秦秋紅，何旭江，江武軍，王子龍，曾志將

東方蜜蜂幼蟲封蓋信息素含量及生物合成通路

秦秋紅1,2，何旭江1，江武軍3，王子龍1，曾志將1

1江西農(nóng)業(yè)大學蜜蜂研究所/江西省蜜蜂生物學與飼養(yǎng)重點實驗室，南昌 330045；2廣西科技大學醫(yī)學部，廣西柳州 545005；3江西省養(yǎng)蜂研究所，南昌 330052

【】在蜜蜂中，甲基棕櫚酸酯（MP）、甲基油酸酯（MO）、甲基亞油酸酯（ML）和甲基亞麻酸酯（MLN）是重要的封蓋信息素成分，它們觸發(fā)成年工蜂對幼蟲的封蓋行為。本研究旨在比較封蓋信息素化學成分在不同封蓋時期的東方蜜蜂（）工蜂與雄蜂幼蟲體內(nèi)的含量，并分析其在幼蟲體內(nèi)的生物合成通路，進一步探索蜜蜂幼蟲與成年工蜂之間的信息素交流機制。以中華蜜蜂（）為實驗材料，分別取未封蓋、正在封蓋和已封蓋的工蜂與雄蜂幼蟲，利用GC/MS分析技術，比較4種封蓋信息素成分在不同封蓋時期的工蜂與雄蜂幼蟲體內(nèi)的含量；同時利用RNA-seq技術對不同封蓋時期的工蜂與雄蜂幼蟲進行轉(zhuǎn)錄組測序，分析其基因表達差異，并根據(jù)差異表達基因KEGG富集分析推測封蓋信息素的生物合成通路。在工蜂幼蟲中，4種封蓋信息素成分在正在封蓋和已封蓋幼蟲體內(nèi)的含量均顯著高于未封蓋幼蟲，其中MP和MO的含量均隨幼蟲日齡增長而顯著增加，而ML和MLN的含量在正在封蓋和已封蓋幼蟲體內(nèi)差異不顯著；在雄蜂幼蟲中，4種信息素成分含量均隨日齡增長而增加，且已封蓋幼蟲的信息素含量顯著高于未封蓋和正在封蓋的幼蟲。對工蜂與雄蜂3個封蓋時期幼蟲的基因表達量進行組間比較分析，分別從3個比較組中獲得4 299和3 926個差異表達基因，并且在差異表達基因KEGG注釋分析中分別獲得152和130個KEGG通路。根據(jù)差異表達基因KEGG富集結(jié)果，推測出東方蜜蜂工蜂與雄蜂幼蟲可能利用乙酰輔酶A合成MP、MO、ML和MLN的生物合成通路以及11個調(diào)控候選基因，并發(fā)現(xiàn)該生物合成通路與西方蜜蜂相同。東方蜜蜂工蜂幼蟲與雄蜂幼蟲在被封蠟蓋的關鍵階段增加了MP、MO、ML和MLN的釋放量，進一步驗證了它們是與蜜蜂封蓋行為相關的信息素，并且推測這些信息素可能是在相關基因的調(diào)控下由乙酰輔酶A從頭合成，而東方蜜蜂幼蟲與西方蜜蜂幼蟲可能利用相同的生物合成通路進行信息素的生物合成。

東方蜜蜂；封蓋信息素；含量；轉(zhuǎn)錄組；生物合成通路

0 引言

【研究意義】蜜蜂是一種高度社會化的昆蟲，蜂群成員間需要進行信息交流來協(xié)調(diào)個體活動，以確保群體能夠健康生存和持續(xù)繁衍。作為完全依賴群體的成員，蜜蜂幼蟲通過各種化學信號向成年工蜂表明自己的生物狀態(tài)和需求，以便得到必需的喂養(yǎng)和照料[1-4]。從分子水平研究東方蜜蜂（）幼蟲封蓋信息素的生物合成通路，進一步探索蜜蜂幼蟲誘導成年工蜂封蓋幼蟲巢房行為的分子機理，可為深入了解東方蜜蜂信息素交流的內(nèi)在機制提供新的啟示。【前人研究進展】Le Conte等首次從西方蜜蜂（）雄蜂幼蟲中鑒定出10種幼蟲酯類信息素（the brood ester pheromone，BEP）：甲基棕櫚酸酯（methyl palmitate，MP）、甲基油酸酯（methyl oleate，MO）、甲基亞油酸酯（methyl linoleate，ML）、甲基硬脂酸酯（methyl stearate，MS）、甲基亞麻酸酯（methyl linolenate，MLN）、乙基棕櫚酸酯（ethyl palmitate，EP）、乙基油酸酯（ethyl oleate，EO）、乙基亞油酸酯（ethyl linoleate，EL）、乙基硬脂酸酯（ethyl stearate，ES）和乙基亞麻酸酯（ethyl linolenate，ELN）[5]。近30年來科研工作者發(fā)現(xiàn)，蜜蜂幼蟲信息素中單一或組合的脂肪酸酯能夠引起工蜂不同的行為與發(fā)育變化，這些信息素成分隨著幼蟲日齡和性別的不同而發(fā)生變化（工蜂或雄蜂），成年工蜂也相應地調(diào)整它們對幼蟲的行為反應[1,6-7]。然而目前大多數(shù)的研究僅涉及信息素的化學成分鑒定和功能描述，對蜜蜂信息素的合成途徑研究較少。He等研究發(fā)現(xiàn)E--羅勒烯可能是工蜂幼蟲的饑餓信息素，并利用RNA-seq技術分析推測出E--羅勒烯在工蜂幼蟲體內(nèi)通過乙酰輔酶A和乙酰乙酰輔酶A從頭合成的生物合成通路及其調(diào)控候選基因[8]。進一步研究表明，蜜蜂蜂王與雄蜂幼蟲通過同樣的通路在體內(nèi)從頭合成E--羅勒烯作為其饑餓信息素來乞求食物[9]。蜜蜂是一種變態(tài)發(fā)育的昆蟲，其生活史要經(jīng)過卵、幼蟲、蛹和成蟲4個階段。在正常的蜂巢環(huán)境中（巢房溫度約35℃），卵孵化成幼蟲并發(fā)育到一定時期（蜂王幼蟲5 d、工蜂幼蟲6 d、雄蜂幼蟲7 d），成年工蜂就會從蠟腺分泌蜂蠟對其巢房進行封蓋，以利于幼蟲在一個干凈、穩(wěn)定的封閉環(huán)境中化蛹[10]。Le Conte等研究發(fā)現(xiàn)，蜜蜂幼蟲信息素中MP、MO、ML和MLN 4種成分中的單一或混合成分都可以誘導成年工蜂對幼蟲巢房的封蓋行為[11]。Qin等利用RNA-seq技術分析推測出西方蜜蜂工蜂與雄蜂幼蟲利用乙酰輔酶A合成MP、MO、ML和MLN的生物合成通路以及12個調(diào)控候選基因，并利用穩(wěn)定同位素示蹤劑證實了這些封蓋信息素成分是由幼蟲合成的，而不是從它們的食物中獲得[12]。蜂螨是危害蜜蜂最嚴重的寄生性病害之一，導致全球蜜蜂很高的死亡率[13]。研究表明，大蜂螨能利用蜜蜂幼蟲信息素找到即將封蓋的工蜂或雄蜂幼蟲[5,11]，在幼蟲被封蓋前潛入其巢房內(nèi)，吸食幼蟲血淋巴，繁殖后代，而蜂螨更偏好于寄生在雄蜂的幼蟲巢房內(nèi)[10]?！颈狙芯壳腥朦c】東方蜜蜂和西方蜜蜂是目前世界上廣泛飼養(yǎng)的兩個蜂種，它們在外部形態(tài)、個體發(fā)育、生活習性和學習記憶等生物學特性方面存在較大差異[14-16]。目前對蜜蜂信息素的研究大多集中在以意大利蜜蜂（）為代表的西方蜜蜂上。雖然近年來我國學者逐漸對東方蜜蜂信息素展開研究[17-18]，獲得了一些東方蜜蜂化學通訊的知識，但相對于西方蜜蜂而言，人們對東方蜜蜂信息素仍知之甚少，尤其是信息素分子水平層面的研究較為缺乏?！緮M解決的關鍵問題】為了豐富對東方蜜蜂信息素的了解，分別利用GC/MS技術和RNA-seq技術，分析封蓋信息素化學成分在不同封蓋時期的東方蜜蜂工蜂與雄蜂幼蟲體內(nèi)的含量變化及轉(zhuǎn)錄組差異，驗證MP、MO、ML和MLN是與東方蜜蜂封蓋行為相關的信息素并探究其生物合成分子機理，進一步揭示東方蜜蜂幼蟲與成年工蜂之間的信息素交流內(nèi)在機制。

1 材料與方法

信息素鑒定試驗于2017年4—5月在江西中煙工業(yè)有限責任公司完成，轉(zhuǎn)錄組測序分析于2017年4—8月在北京百邁客生物科技有限公司完成，熒光定量PCR驗證于2018年4—5月在江西農(nóng)業(yè)大學蜜蜂研究所完成。

1.1 供試昆蟲

供試樣品均采自中華蜜蜂（）蜂群，由江西農(nóng)業(yè)大學蜜蜂研究所（28.46°N，115.49°E）根據(jù)標準的養(yǎng)蜂技術飼養(yǎng)。

幼蟲樣品均分為以下3個不同封蓋時期：4日齡未封蓋的工蜂與雄蜂幼蟲（4-day-old WL/DL）；正在封蓋的工蜂與雄蜂幼蟲（capping WL/DL），即蜂房上的蠟蓋正在被筑建的幼蟲；已封蓋的工蜂與雄蜂幼蟲（capped WL/DL），樣品取自完全封蓋的蜂房，蠟蓋下有一層薄薄的繭衣，工蜂約8日齡，雄蜂約9日齡。各組幼蟲均為從蜂箱中直接取出巢脾新鮮采集，每個生物學重復分別來自于群勢相同的不同健康蜂群。

1.2 氣相色譜-質(zhì)譜（GC/MS）分析

3個不同封蓋時期的幼蟲樣品數(shù)量分別為4日齡未封蓋的工蜂與雄蜂幼蟲各40只，正在封蓋和已封蓋的工蜂幼蟲各20只，正在封蓋和已封蓋的雄蜂幼蟲各10只，每組樣品進行4個生物學重復。將采集的幼蟲樣品（未經(jīng)清洗）分別放入裝有3 mL二氯甲烷（分析純，南京化學試劑股份有限公司）的玻璃瓶中，并添加20 μL甲基十九烷酸酯（≥98%，標準品，10 μg·mL-1，Sigma）作為內(nèi)標。隨后，將裝有幼蟲的玻璃小瓶放置在水平脫色搖床（ZD-9560，江蘇盛藍儀器制造有限公司）上輕輕搖晃30 min（120 r/min），最后將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的玻璃瓶中并用氮氣濃縮至約20 μL。分別取1 μL濃縮后的樣品注入氣相色譜-質(zhì)譜（GC/MS）系統(tǒng)（7890A/5975C，Agilent）進行檢測，具體參數(shù)參照Qin等[12]的報道。

在MP、MO、ML和MLN的基峰重建了單個離子監(jiān)測色譜圖，內(nèi)部標準分別為質(zhì)荷比（m/z）270、264、294、292和312。對于感興趣的化合物，通過參考每種化合物的校準曲線，將峰面積轉(zhuǎn)換為數(shù)量。外部標準品為MP、MO、ML和MLN（≥99.5%，Sigma），7個濃度的外標（0.25、0.5、1、2、5、10和25 μg·mL-1）被用來構(gòu)建標準曲線。所構(gòu)建的4條標準曲線的相關系數(shù)均大于99.96%，說明GC/MS系統(tǒng)足夠穩(wěn)定[19]，可用于后期對蜜蜂幼蟲MP、MO、ML和MLN的定量分析。

1.3 RNA-seq分析

采集未封蓋、正在封蓋和已封蓋的工蜂與雄蜂幼蟲各6只，每組樣品進行3個生物學重復。取樣時將幼蟲放入5 mL EP管中，隨后迅速放入液氮速凍，并于-80℃保存。按標準TRlzol Reagent法提取RNA（Life technologies，California，USA），并使用瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白分析儀（IMPLEN）對RNA進行質(zhì)量檢測，將檢測合格的RNA樣品用于cDNA文庫構(gòu)建。cDNA文庫的構(gòu)建和測序由北京百邁客生物科技有限公司完成，具體操作方法參見余愛麗等[20]的報道。

對測序獲得的18個樣品的Raw Data進行去接頭、去引物序列、過濾低質(zhì)量Reads等質(zhì)量控制，最終獲得高質(zhì)量Clean Reads。采用中華蜜蜂的全基因組序列（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCA/002/290/385/GCA_002290385.1_ApisCC1.0/）作為參考基因進行比對。以FPKM（Fragments per Kilobase of transcript per Million fragments mapped）作為衡量指標，對測序樣品的基因表達量進行統(tǒng)計。用斯皮爾曼相關系數(shù)2評估各組樣品3個生物學重復的相關性[21]。以fold change≥2且FDR＜0.05作為篩選差異表達基因（differential expressed gene，DEG）的標準檢測各幼蟲樣品組間的基因表達差異。

為了進一步解讀差異表達基因的功能，探究東方蜜蜂幼蟲封蓋信息素的生物合成途徑，利用KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫對差異表達基因進行通路（Pathway）注釋和富集分析。首先將差異表達基因最長的轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)化為蛋白序列，然后利用BLAST軟件與KEGG蛋白數(shù)據(jù)庫進行比較，界定標準為e＜10-5。為了識別RNA-seq數(shù)據(jù)中假定的代謝通路富集，使用基于KEGG Orthology的注釋系統(tǒng)2.0（KOBAS 2.0）分析KEGG映射的結(jié)果。KOBAS 2.0將提供的基因數(shù)據(jù)庫與代謝和信號通路的多個現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫進行對照，以識別RNA-seq樣本中富集的通路[22]。

1.4 差異表達基因qRT-PCR驗證

從本研究的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中推測出東方蜜蜂工蜂與雄蜂幼蟲封蓋信息素的生物合成通路及參與該通路的11個基因。為了驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可靠性，以中華蜜蜂工蜂幼蟲為實驗材料，隨機選取5個參與該通路的候選基因進行qRT-PCR定量分析：（gene- APICC_00421：3-ketoacyl-CoA thiolase）、（gene-APICC_06057：Trifunctional enzyme subunit alpha）、（gene-APICC_00389：PREDICTED: probable trans-2-enoyl-CoA reductase, mitochondrial）、（gene-APICC_02088：PREDICTED: very-long- chain（3R）-3-hydroxyacyl-CoA dehydratase hpo-8）和（gene-APICC_01118：Acyl-CoA Delta（11）desaturase）。

采集未封蓋、正在封蓋和已封蓋的工蜂幼蟲各3只，每組樣品進行3個生物學重復。將采集的樣品迅速放入液氮中速凍，并于-80℃保存。按標準TRlzol Reagent法提取RNA并檢測RNA樣品的質(zhì)量，隨后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）將檢測合格的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。用Primer 5.0軟件進行基因引物設計，并由上海生物工程有限公司進行引物合成（引物序列詳見表1）。選用為“管家基因”。qRT-PCR反應體系（10 μL）： cDNA模板1 μL，上、下游引物各0.4 μL（10 μmol·L-1），SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ 5 μL，無RNA酶水3.2 μL。qRT-PCR反應條件：95℃預變性30 s；95℃ 10 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)。擴增反應結(jié)束后繼續(xù)從50℃緩慢加熱到90℃，建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線。對于每個基因，每個樣品進行3個技術重復。用公式2-ΔΔCt計算各個基因在各樣品中的相對表達水平[23-24]，然后做平方根轉(zhuǎn)換后進行方差分析，檢驗各基因在工蜂幼蟲不同封蓋時期的表達量差異情況。

表1 實時熒光定量PCR引物

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

使用StatView 5.01（SAS Institute，Cary，NC，USA）分析GC/MS和qRT-PCR的數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)采用“ANOVA and-test”中的“ANOVA or ANCOVA”進行統(tǒng)計分析，各組間用Fisher’s PLSD進行差異顯著性比較分析。組間差異被認為是顯著的概率水平為0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同封蓋時期幼蟲封蓋信息素含量

在工蜂中，4個封蓋信息素成分在正在封蓋和已封蓋幼蟲體內(nèi)的含量均顯著高于4日齡未封蓋的幼蟲。其中，MP和MO的含量均隨幼蟲年齡的增長而增加，且在3個封蓋時期間差異顯著（＜0.05），而ML和MLN的含量在正在封蓋和已封蓋的幼蟲中差異不顯著（＞0.05）（圖1）。

在雄蜂中，從4日齡未封蓋幼蟲到已封蓋幼蟲，4種信息素成分含量均隨年齡增長而增加，且已封蓋幼蟲的信息素含量顯著高于4日齡和正在封蓋的幼蟲（＜0.05）。此外，除了ML在正在封蓋幼蟲體內(nèi)的含量顯著高于4日齡未封蓋幼蟲外（＜0.05），其余3種信息素成分在這兩個封蓋時期的幼蟲中均差異不顯著（＞0.05）（圖2）。

圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤，柱上標不同字母表示差異顯著（P＜0.05）。圖2同

圖2 雄蜂不同封蓋時期幼蟲封蓋信息素含量

2.2 RNA-seq分析

完成了18個樣品RNA-seq測序，經(jīng)過質(zhì)量控制，共獲得57.26 Gb Clean Data，各樣品Clean Data均達到2.65 Gb，且Q30堿基百分比均≥94.74%。分別將各樣品的Clean Reads與中華蜜蜂參考基因組進行序列比對，比對效率均在88.89%—95.37%，且Unique Reads的比對率≥87.99%，數(shù)據(jù)利用率正常。各試驗組3個生物學重復的斯皮爾曼相關系數(shù)2均＞0.75，說明本研究中工蜂與雄蜂各封蓋時期幼蟲3個重復樣品的相關性較強。

對工蜂與雄蜂3個不同封蓋時期幼蟲的基因表達量進行組間比較分析，分別獲得4 299和3 926個差異表達基因。在未封蓋與正在封蓋、正在封蓋與已封蓋以及未封蓋與已封蓋3個比較組中，工蜂幼蟲分別有62、3 288和3 701個基因存在表達差異，其中表達上調(diào)的基因數(shù)分別為20、1 812和2 022個，表達下調(diào)的基因數(shù)分別為42、1 476和1 679個（圖3-A）；雄蜂幼蟲分別有355、2 343和3 489個基因存在表達差異，其中表達上調(diào)的基因數(shù)分別為204、1 517和1 936個，表達下調(diào)的基因數(shù)分別為151、826和1 553個（圖3-C）。分別對工蜂與雄蜂幼蟲的差異表達基因集進行集合分析（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ Venn/），在未封蓋與正在封蓋、正在封蓋與已封蓋以及未封蓋與已封蓋3個比較組中，工蜂幼蟲有21個共有的差異表達基因，4、587和983個獨有的差異表達基因（圖3-B）；雄蜂幼蟲有116個共有的差異表達基因，58、341和1 382個獨有的差異表達基因（圖3-D）。

圖3 工蜂與雄蜂不同封蓋時期幼蟲差異表達基因

在KEGG注釋分析中，工蜂不同封蓋時期幼蟲間的所有差異表達基因共注釋到152個KEGG通路，其中未封蓋與正在封蓋、正在封蓋與已封蓋以及未封蓋與已封蓋3個比較組中的差異表達基因分別注釋到31、99和22個通路。雄蜂不同封蓋時期幼蟲間的所有差異表達基因共注釋到130個KEGG通路，其中上述3個比較組中的差異表達基因分別注釋到65、128和125個通路。KEGG分類注釋結(jié)果表明，上述KEGG通路涉及到新陳代謝、細胞過程、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理和有機系統(tǒng)5個方面，其中與代謝有關的通路數(shù)量最多。

進一步對注釋到的所有KEGG通路進行分析，發(fā)現(xiàn)兩個脂肪酸延伸通路（ko00062：Fatty acid elongation）和不飽和脂肪酸生物合成通路（ko01040：Biosynthesis of unsaturated fatty acids），它們可能涉及長碳鏈的生物合成途徑：首先由乙酰輔酶A通過脂肪酸延伸通路從頭合成十六鹽酸（C16），然后以C16為前體通過不飽和脂肪酸生物合成通路形成一個或多個雙鍵的不飽和脂肪酸，如油酸和亞油酸。據(jù)報道，一些昆蟲通過這一途徑進行信息素的生物合成[25-27]。因此推測，這兩個KEGG通路可能與東方蜜蜂工蜂與雄蜂幼蟲封蓋信息素的生物合成有關。

在工蜂與雄蜂幼蟲中，共有11個差異表達基因富集在脂肪酸延伸通路和不飽和脂肪酸生物合成通路。其中5個基因gene-APICC_00389、gene-APICC_00421、gene-APICC_05477、gene-APICC_06057和gene- APICC_10032富集在脂肪酸延伸通路，4個基因gene- APICC_01118、gene-APICC_01590、gene-APICC_03413和gene-APICC_06057富集在不飽和脂肪酸生物合成通路，此外還有2個基因gene-APICC_05451和gene-APICC_02088同時富集到上述兩個通路中。推測這11個基因可能參與調(diào)控東方蜜蜂工蜂與雄蜂幼蟲封蓋信息素MP、MO、ML和MLN的生物合成過程（表2）。

根據(jù)上述結(jié)果，提出東方蜜蜂工蜂與雄蜂幼蟲封蓋信息素的生物合成通路，以及調(diào)控這些通路的相關基因（圖4）。

2.3 qRT-PCR

調(diào)控東方蜜蜂工蜂與雄蜂幼蟲封蓋信息素生物合成的5個候選基因、、、和在封蓋前后3個時期的表達量上、下調(diào)趨勢和差異情況均與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果相一致（圖5）。qRT-PCR結(jié)果驗證了轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可靠性。

網(wǎng)格表示工蜂與雄蜂不同封蓋時期幼蟲的基因表達量。每個格子的灰度等級代表各個基因在幼蟲中的絕對表達量，各灰度等級對應的FPKM值分別為0—10、10—20、20—40、40—80、80—160、160—320、320—640、640—1280、1280—2560和2560—5500

表2 工蜂與雄蜂幼蟲封蓋信息素生物合成相關候選基因注釋

圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤，柱上標不同字母表示表達量差異顯著（qRT-PCR：P＜0.05；RNA-seq：FDR≤0.05）

3 討論

Le Conte等提出MP、MO、ML和MLN是誘導蜜蜂封蓋行為的重要信號[11]。本研究表明，工蜂與雄蜂幼蟲在被封蠟蓋的關鍵階段均增加了這4種信息素成分的釋放量，這與前人報道的西方蜜蜂結(jié)果相一致[12,28]，進一步驗證了MP、MO、ML和MLN是與東方蜜蜂封蓋行為相關的信息素。

在蜂螨的生活周期里，可分為體外寄生期和蜂房繁殖期兩個不同的時期。體外寄生期的雌性成螨寄生在巢房外的成年蜂體上，依靠吸取成年蜂的血淋巴生活，當巢房內(nèi)的蜜蜂幼蟲將要被工蜂封蓋時，便潛入到幼蟲巢房中，并于巢房封蓋后轉(zhuǎn)移到幼蟲或預蛹體上，靠吮吸其血淋巴補充營養(yǎng)，隨后產(chǎn)卵繁殖。蜂螨更偏好于寄生在雄蜂的幼蟲巢房內(nèi)[10]。據(jù)報道，在蜂群中有3種BEP成分對蜂螨有吸引作用，其中MP對蜂螨的吸引力最強，而EP和ML的作用相對較弱[5]。在本研究中，MP和ML在正在封蓋的雄蜂幼蟲中的含量均顯著高于同發(fā)育時期的工蜂幼蟲，試驗數(shù)據(jù)支持早期的研究結(jié)果，即這些BEP成分可以被蜂螨用來從正在封蓋的工蜂幼蟲中區(qū)分和挑選出雄蜂幼蟲。

顏偉玉等[17]測定了10種幼蟲信息素成分在中華蜜蜂不同日齡幼蟲和成年蜂個體中的含量分布情況，張含等[18]和曾云峰等[29]先后研究了幼蟲信息素3種酯類成分MP、EP和EO對中華蜜蜂工蜂和蜂王個體發(fā)育以及工蜂采集、哺育和封蓋等行為的影響，并與意大利蜜蜂作比較，均發(fā)現(xiàn)中華蜜蜂幼蟲與意大利蜜蜂幼蟲所分泌的幼蟲信息素的成分和含量不同，且這兩個蜂種的工蜂對幼蟲信息素的反應靈敏度也不同。本研究中，東方蜜蜂工蜂與雄蜂幼蟲的MO、ML和MLN含量整體來說均低于已報道的相同實驗條件下的西方蜜蜂[12]，筆者推測這可能是由于東方蜜蜂嗅覺更靈敏[16]，較低的信息素水平即可引起工蜂對幼蟲的封蓋行為。然而，MP在東方蜜蜂工蜂與雄蜂幼蟲中的含量卻高于西方蜜蜂。除了能引發(fā)工蜂的封蓋行為外，MP還被報道與工蜂的發(fā)育和采集等行為有關[18,29]，但東方蜜蜂幼蟲MP含量高的具體原因還有待進一步研究。

信息素的前體主要有3個來源：從頭合成、宿主植物或基質(zhì)提供的前體的轉(zhuǎn)化以及宿主分子的直接結(jié)合，但大部分的信息素還是通過昆蟲自身的從頭合成而來[30]。脂類信息素廣泛存在于鱗翅目昆蟲中且種類繁多，其生物合成通常是在一系列酶的作用下，利用軟脂酸和硬脂酸等脂肪酸中間產(chǎn)物作為前體，經(jīng)過碳鏈縮短、去飽和化和官能團修飾等步驟逐步形成信息素。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序技術分析了3個不同封蓋時期的東方蜜蜂工蜂與雄蜂幼蟲各組間的差異表達基因，并對差異表達基因進行KEGG注釋和富集分析，發(fā)現(xiàn)脂肪酸延伸和不飽和脂肪酸生物合成通路有差異表達基因顯著富集，由此筆者推測出東方蜜蜂工蜂與雄蜂幼蟲封蓋信息素可能的生物合成通路及相關的調(diào)控基因。這些生物合成通路是由乙酰輔酶A從頭合成C16，然后以C16為前體通過去飽和作用形成一個或多個雙鍵的不飽和脂肪酸。在許多昆蟲中，乙酰輔酶A是主導脂肪酸和酯類生物合成的幾個不同代謝途徑的前體[31-33]，昆蟲能利用上述途徑進行信息素的生物合成[26-28]，如在家蠶、鉤端螺旋體和大豆中均發(fā)現(xiàn)了類似的甲酯合成途徑[26-27,34-35]。這些研究支持關于東方蜜蜂幼蟲4種封蓋信息素成分生物合成通路的推測。本研究中提出的東方蜜蜂工蜂與雄蜂幼蟲封蓋信息素生物合成通路與Qin等[12]報道的西方蜜蜂工蜂與雄蜂幼蟲封蓋信息素生物合成通路相同。東方蜜蜂與西方蜜蜂生存的自然環(huán)境、氣候條件和植物區(qū)系等因素不同，其生物學特性存在較大的差異，如外部形態(tài)、個體發(fā)育、生活習性和學習記憶等[14-16]。東方蜜蜂和西方蜜蜂是同屬于蜜蜂屬的兩個蜂種，其遺傳背景相似，都具有蜜蜂屬的特性，如高度的社會性生活、采蜜和貯蜜以及筑造雙面六邊形巢房等。已有研究表明，東方蜜蜂幼蟲含有與西方蜜蜂幼蟲相同的10種脂肪酸酯類信息素[17]，其中一些信息素成分已被證實在影響工蜂發(fā)育和行為方面具有與西方蜜蜂相似的效應。因此，筆者推測東方蜜蜂與西方蜜蜂有可能利用相同的生物合成途徑進行信息素的生物合成。

作用于信息素合成過程的脫氫酶基因已在許多昆蟲中被發(fā)現(xiàn)。在本研究中，2個基因（gene-APICC_01118和gene-APICC_01590）以及2個基因（gene-APICC_08222和gene-APICC_03413）富集在筆者提出的東方蜜蜂幼蟲封蓋信息素的生物合成通路，且GO注釋表明gene-APICC_08222和gene-APICC_03413具有的生物功能。Δ11脫氫酶是蛾類和蝴蝶類在C11上形成雙鍵最主要的酶[36-41]。Δ11-desaturase是一種生物功能酶，具有類似于Δ11和Δ12的去飽和活性，在昆蟲信息素生物合成過程中發(fā)揮著重要作用[42-46]。Roelofs等研究發(fā)現(xiàn)，紅帶卷葉蛾、大白菜尺蛾和家蠶中的油酸酯、亞油酸酯和亞麻酸酯是從頭合成的，并由去飽和[47]。因此，推測這4個基因可能參與了東方蜜蜂幼蟲封蓋信息素成分的生物合成途徑。將參與調(diào)控東方蜜蜂封蓋信息素生物合成通路的11個候選基因與已報道的西方蜜蜂的12個候選基因進行比對，發(fā)現(xiàn)東方蜜蜂中的10個候選基因（gene-APICC_05477除外）與西方蜜蜂中的10個候選基因有相同的注釋或基因功能，這些基因分別在東方蜜蜂和西方蜜蜂幼蟲封蓋信息素生物合成通路中發(fā)揮著相同的調(diào)控作用。進一步比較這些候選基因在未封蓋、正在封蓋和已封蓋工蜂幼蟲與雄蜂幼蟲中的表達量可知，這些基因在同一封蓋時期的工蜂與雄蜂幼蟲中的表達量相近。上述比較結(jié)果進一步為這些基因作為參與蜜蜂幼蟲封蓋信息素生物合成通路的調(diào)控基因提供了證據(jù)，但確切的調(diào)控機制還有待進一步研究。

4 結(jié)論

東方蜜蜂工蜂幼蟲與雄蜂幼蟲在被封蠟蓋的關鍵階段增加了甲基棕櫚酸酯（MP）、甲基油酸酯（MO）、甲基亞油酸酯（ML）和甲基亞麻酸酯（MLN）的釋放量，進一步驗證了它們是與蜜蜂封蓋行為相關的信息素，推測這些信息素可能是在相關基因的調(diào)控下由乙酰輔酶A從頭合成，而東方蜜蜂幼蟲與西方蜜蜂幼蟲可能利用相同的生物合成通路進行信息素的生物合成。

致謝：本研究得到了江西中煙工業(yè)有限責任公司郭磊和江西農(nóng)業(yè)大學麻俊武老師的幫助，在此表示感謝！

[1] FREE J B, WINDER M E. Brood recognition by honey bee ()workers. Animal Behavior, 1983, 31: 539-545.

[2] HAYDAK M H. Honey bee nutrition. Annual review of entomology, 1970, 15: 143-156.

[3] HUANG Z Y, OTIS G W. Inspection and feeding of larvae by worker honey bees (Hymenoptera: Apidae): effect of starvation and food quantity. Journal of insect behavior, 1991, 4(3): 305-317.

[4] HUANG Z Y, OTIS G W. Nonrandom visitation of brood cells by worker honey bees (Hymenoptera: Apidae). Journal of Insect Behavior, 1991, 4(2): 177-184.

[5] LE CONTE Y, ARNOLD G, TROUILLER J, MASSON C, CHAPPE B, OURISSON G. Attraction of the parasitic miteto the drone larvae of honey bees by simple aliphatic esters. Science, 1989, 245(4918): 638-639.

[6] SLESSOR K N, WINSTON M L, LE CONTE Y. Pheromone communication in the honeybee (L.). Journal of Chemical Ecology, 2005, 31(11): 2731-2745.

[7] LE CONTE Y. The recognition of larvae by worker honeybees. Naturwissenschaften, 1994, 81: 462-465.

[8] HE X J, ZHANG X C, JIANG W J, BARRON A B, ZHANG J H, ZENG Z J. Starving honey bee () larvae signal pheromoneally to worker bees. Scientific Reports, 2016, 6: 22359.

[9] 何旭江, 江武軍, 顏偉玉, 曾志將.蜜蜂蜂王與雄蜂幼蟲饑餓信息素鑒定及其生物合成通路. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2016, 49(23): 4646-4655.

HE X J, JIANG W J, YAN W Y, ZENG Z J. Identification and biosynthetic pathway of a hunger pheromone in honeybee queen and drone larvae. Scientia Agricultura Sinica, 2016, 49(23):4646-4655. (in Chinese)

[10] 曾志將. 蜜蜂生物學. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2007.

ZENG Z J. Bee Biology. Beijing: China Agriculture Press, 2007. (in Chinese)

[11] LE CONTE Y, ARNOLD G, TROUILLER J, MASSON C, CHAPPE B. Identification of a brood pheromone in honeybees.Naturwissenschaften, 1990, 77: 334-336.

[12] QIN Q H, HE X J, BARRON A B, GUO L, JIANG W J, ZENG Z J. The capping pheromones and putative biosynthetic pathways in worker and drone larvae of honey bees. Apidologie, 2019, 50(6): 793-803.

[13] TROUILLER J, ARNOLD G, CHAPPE B, LE CONTE Y, MASSON C. Semiochemical basis of infestation of honey bee brood by. Journal of Chemical Ecology, 1992, 18(11): 2041-2053.

[14] 曾志將. 養(yǎng)蜂學. 3 版. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2017.

ZENG Z J. Apiculture. 3rd ed. Beijing: China Agriculture Press, 2017. (in Chinese)

[15] 陳盛祿. 中國蜜蜂學. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2001.

CHEN S L. The Apicultural Science in China. Beijing: China Agriculture Press, 2001. (in Chinese)

[16] QIN Q H, HE X J, TIAN L Q, ZHANG S W, ZENG Z J. Comparison of learning and memory ofand. Journal of Comparative Physiology A, 2012, 198(10): 777-786.

[17] 顏偉玉, LE CONTE Y, BESLAY D, 曾志將. 中華蜜蜂幼蟲信息素鑒定. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2009, 42(6): 2250-2254.

YAN W Y, LE CONTE Y, BESLAY D, ZENG Z J. Identification of brood pheromone in Chinese honeybee [(Hymenoptera: Apidae)]. Scientia Agricultura Sinica, 2009, 42(6): 2250-2254. (in Chinese)

[18] 張含, 曾志將, 顏偉玉, 吳小波, 鄭云林. 信息素中三種酯類對中華蜜蜂工蜂發(fā)育和采集行為的影響. 昆蟲學報, 2010, 53(1): 55-60.

ZHANG H, ZENG Z J, YAN W Y, WU X B, ZHENG Y L. Effects of three aliphatic esters of brood pheromone on development and foraging behavior ofworkers.Acta Entomologica Sinica, 2010, 53(1): 55-60. (in Chinese)

[19] TREFZ P, KISCHKEL S, HEIN D, JAMES E S, SCHUBERTA J K, MIEKISCH W. Needle trap micro-extraction for VOC analysis: effects of packing materials and desorption parameters. Journal of Chromatography A, 2012, 1219: 29-38.

[20] 余愛麗, 趙晉鋒, 成鍇, 王振華, 張鵬, 劉鑫, 田崗, 趙太存, 王玉文. 谷子萌發(fā)吸水期關鍵代謝途徑的篩選與分析. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2020, 53(15): 3005-3019.

YU A L, ZHAO J F, CHENG K, WANG Z H, ZHANG P, LIU X, TIAN G, ZHAO T C, WANG Y W. Screening and analysis of key metabolic pathways in foxtail millet during different water uptake phases of germination.Scientia Agricultura Sinica, 2020, 53(15): 3005-3019. (in Chinese)

[21] LOVE M I, HUBER W, ANDERS S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology, 2014, 15: 550.

[22] XIE C, MAO X, HUANG J, DING Y, WU J M, DONG S, KONG L, GAO G, LI C Y, WEI L P. KOBAS 2.0: a web server for annotation and identification of enriched pathways and diseases. Nucleic Acids Research, 2010, 39: W316-W322.

[23] LIU W, SAINT D A. A new quantitative method of real time reverse transcription polymerase chain reaction assay based on simulation of polymerase chain reaction kinetics. Analytical Biochemistry, 2002, 302(1): 52-59.

[24] DVINGE H, BERTONE P. HTqPCR: high-throughput analysis and visualization of quantitative real-time PCR data in R. Bioinformatics, 2009, 25(24): 3325-3326.

[25] ROELOFS W, BJOSTAD L. Biosynthesis of lepidopteran pheromones. Bioorganic Chemistry, 1984, 12(4): 279-298.

[26] ANDO T, HASE T, ARIMA R, UCHIYAMA M. Biosynthetic pathway of bombykol, the sex pheromone of the female silkworm moth. Agricultural and Biological Chemistry, 1998, 52(2): 473-478.

[27] TANG J D, CHARLTON R E, JURENKA R A, WOLF W A, PHELAN P L, SRENG L, ROELOFS W L. Regulation of pheromone biosynthesis by a brain hormone in two moth species. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1989, 86(6): 1806-1810.

[28] LE CONTE Y, ELLIS M, RITTER W.mites and honey bee health: canexplain part of the colony losses? Apidologie, 2010, 41(3): 353-363.

[29] 曾云峰, 曾志將, 顏偉玉, 吳小波. 幼蟲信息素中三種酯類對中華蜜蜂和意大利蜜蜂工蜂哺育和封蓋行為以及蜂王發(fā)育影響. 昆蟲學報, 2010, 53(2): 154-159.

ZENG Y F, ZENG Z J, YAN W Y, WU X B. Effects of three aliphatic esters of brood pheromone on worker feeding and capping behavior and queen development ofandActa Entomologica Sinica, 2010, 53(2): 154-159.(in Chinese)

[30] TILLMAN J A, SEYBOLD S J, JURENKA R A, BLOMQUIST G J. Insect pheromones—An overview of biosynthesis and endocrine regulation.Insect Biochemistry and Molecular Biology, 1999, 29(6): 481-514.

[31] MCGEE R, SPECTOR A A. Fatty acid biosynthesis in Erlich cells. The mechanism of short term control by exogenous free fatty acids. The Journal of Biological Chemistry, 1975, 250(14): 5419-5425.

[32] CRIPPS C, BLOMQUIST G J, DE RENOBALES M.biosynthesis of linoleic acid in insects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Lipids and Lipid Metabolism, 1986, 876(3): 572-580.

[33] MOSHITZKY P, MILOSLAVSKI I, AIZENSHTAT Z, Applebaum S W. Methyl palmitate: a novel product of the medfly () corpus allatum. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2003, 33(12): 1299-1306.

[34] STERN N, SHENBERG E, TIETZ A. Studies on the metabolism of fatty acids in leptospira: the biosynthesis of Δ9- and Δ11- monounsaturated acids. European Journal of Biochemistry, 1969, 8(1): 101-108.

[35] BACHLAVA E, DEWEY R E, BURTON J W, CARDINAL A J. Mapping candidate genes for oleate biosynthesis and their association with unsaturated fatty acid seed content in soybean. Molecular Breeding, 2009, 23(2): 337-347.

[36] KNIPPLE D C, ROSENFIELD C L, MILLER S J, LIU W, TANG J, MA P W K, ROELOFS W L. Cloning and functional expression of a cDNA encoding a pheromone gland-specific acyl-CoA Δ11-desaturase of the cabbage looper moth,. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1998, 95: 15287-15292.

[37] LIENARD M A, STRANDH M, HEDENSTROM E, JOHANSSON T, L?FSTEDT C. Key biosynthetic gene subfamily recruited for pheromone production prior to the extensive radiation of Lepidoptera. BMC Evolutionary Biology, 2008, 8: 270.

[38] DING B J, LIENARD M A, WANG H L,ZHAO C H, L?FSTEDT C. Terminal fatty-acyl-CoA desaturase involved in sex pheromone biosynthesis in the winter moth (). Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2011, 41(9): 715-722.

[39] HAGSTROM A K, LIENARD M A, GROOT A T, HEDENSTROM E, L?FSTEDT C. Semi-selective fatty acyl reductases from four heliothine moths influence the specific pheromone composition. PLoS ONE, 2012, 7(5): e37230.

[40] LIENARD M A, WANG H L, LASSANCE J M, L?FSTEDT C. Sex pheromone biosynthetic pathways are conserved between moths and the butterfly. Nature Communications, 2014, 5: 3957.

[41] Wang H L, Brattstr?m O, Brakefield P M, Francke W, L?FSTEDT C. Identification and biosynthesis of novel male specific esters in the wings of the tropical butterfly,. Journal of Chemical Ecology, 2014, 40(6): 549-559.

[42] 王鏡巖, 朱圣庚, 徐長法. 生物化學. 3版. 北京: 高等教育出版社, 2002.

WANG J Y, ZHU S G, XU C F. Biological chemistry. 3rd edBeijing: higher education press, 2002. (in Chinese)

[43] SERRA M, PI?A B, BUJONS J, CAMPS F. FABRIAS G. Biosynthesis of 10, 12-dienoic fatty acids by a bifunctional Δ11 desaturase in. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2006, 36(8): 634-641.

[44] LOFSTEDT C, ELMFORS A, SJ?GREN M, WIJK E. Confirmation of sex pheromone biosynthesis from (16-d3) palmitic acid in the turnip moth using capillary gas chromatography. Experientia, 1986, 42(9): 1059-1061.

[45] RODRIGUEZ F, HALLAHAN D L, PICKETT J A, CAMPS F. Characterization of the Δ11-palmitoyl-coa-desaturase from(lepidoptera: noctuidae).Insect Biochemistry and Molecular Biology, 1992, 22(2): 143-148.

[46] FOSTER S P. Sex pheromone biosynthesis in the tortricid moth(walker) involves chain-shortening of palmitoleate and oleate. Archives of Insect Biochemistry and Physiology, 1998, 37(2): 158-167.

[47] ROELOFS W, BJOSTAD L. Biosynthesis of lepidopteran pheromones. Bioorganic Chemistry, 1984, 12(4): 279-298.

The Capping Pheromone Contents and Putative Biosynthetic Pathways in Larvae of Honeybees

QIN QiuHong1,2, HE XuJiang1, JIANG WuJun3, WANG ZiLong1, ZENG ZhiJiang1

1Honeybee Research Institute, Jiangxi Agricultural University/Jiangxi Province Key Laboratory of Honeybee Biology and Beekeeping, Nanchang 330045;2School of Medicine, Guangxi University of Science and Technology, Liuzhou 545005, Guangxi;3Apicultural Research Institute of Jiangxi Province, Nanchang 330052

【】In honeybees, methyl palmitate (MP), methyl oleate (MO), methyl linoleate (ML) and methyl linolenate (MLN) are important capping pheromone components, which trigger the capping behavior of adult workers.The objective of this study is to compare the contents of these four pheromone components in the larvae of workers and drones ofat different capping stages, analyze their biosynthetic pathways, and to further explore the mechanism of pheromone communication between larvae and adult workers.【】Usingas the experimental material, the larvae of workers and drones of prior to be capped, in the process of being capped and had been capped were collected for comparing the contents of these four pheromone components by using GC/MS. Simultaneously, RNA-seq was used for gene expression analysis, and the biosynthetic pathways were speculated based on KEGG enrichment of differential expressed genes.【】In worker larvae, the contents of the four capping pheromone components were significantly higher at the capping and capped stage than those of the prior to be capped larvae, and the contents of MP and MO significantly increased with aging of the larvae, while the contents of ML and MLN were not significantly different between the capping and capped stage. Whereas in drone larvae, the contents of the four pheromone components were higher overall and increased with aging, and the content at capped stage was significantly higher than that at prior to be capped and capping. RNA-seq results showed that there were 4 299 and 3 926 differential expressed genes among the larvae groups of three stages of workers and drones, respectively. In addition, 152 and 130 KEGG pathways were obtained from the KEGG annotation analysis of the differential expressed genes, respectively. Furthermore, the possiblebiosynthetic pathways were proposed for MP, MO, ML and MLN from acetyl-CoA, regulating under 11 related candidate genes, and these biosynthesis pathways were found to be similar to those of.【】The release contents of MP, MO, ML and MLN were increased during the critical stage of capping in worker and drone larvae of, which further verified that these four pheromones were related to capping behavior of honeybees, and it was speculated that they were possiblybiosynthesized from acetyl-CoA under the control of related genes.larvae andlarvae may use the same biosynthesis pathway for pheromone biosynthesis.

; capping pheromone; content; transcriptome; biosynthetic pathway

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.11.017

2020-08-24；

2020-11-09

國家自然科學基金（31872432）、國家蜂產(chǎn)業(yè)技術體系（CARS-44-kxj15）

秦秋紅，E-mail：qqhpcc87@163.com。通信作者曾志將，E-mail：bees1965@sina.com

（責任編輯 岳梅）