張林林，智慧，湯沙，張仁梁，張偉，賈冠清，刁現(xiàn)民

谷子抽穗時(shí)間基因的表達(dá)與單倍型變異分析

張林林，智慧，湯沙，張仁梁，張偉，賈冠清，刁現(xiàn)民

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081

【】谷子抽穗時(shí)間的適應(yīng)性表現(xiàn)是廣適性新品種選育的基礎(chǔ)，分析抽穗時(shí)間關(guān)鍵基因的遺傳變異和單倍型效應(yīng)，為品種適應(yīng)性改良提供基礎(chǔ)信息。通過全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS），定位谷子抽穗時(shí)間關(guān)鍵基因，利用多組學(xué)數(shù)據(jù)庫（multi-omics database for，MDSi）提供的數(shù)字表達(dá)量，分析的組織時(shí)空表達(dá)特性，并利用原生質(zhì)體對(duì)SiTOC1蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位。采用qRT-PCR在短日（10 h光照/14 h黑暗）條件下進(jìn)行24 h節(jié)律表達(dá)模式分析。利用有代表性的99份谷子品種，分析編碼區(qū)和啟動(dòng)子區(qū)的遺傳多態(tài)性、單倍型以及轉(zhuǎn)錄水平，并對(duì)單倍型與抽穗時(shí)間的關(guān)系進(jìn)行鑒定。在第1染色體物理位置31 456 761 bp處鑒定到了一個(gè)顯著的關(guān)聯(lián)信號(hào)，與抽穗時(shí)間緊密相關(guān)，該位點(diǎn)附近存在一個(gè)擬南芥抽穗期的同源基因。在光周期響應(yīng)組織（根、莖、葉等）中高表達(dá)，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核，在傍晚表達(dá)量上調(diào)，呈現(xiàn)出24 h節(jié)律性表達(dá)模式。在不同谷子品種中存在豐富的多態(tài)性，但REC和CCT結(jié)構(gòu)域高度保守。編碼區(qū)2種主要單倍型H-2和H-6分別與啟動(dòng)子單倍型Hp-591C和Hp-591A共分離，其中，啟動(dòng)子單倍型Hp-591C較Hp-591A的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)了約2.5倍（=0.014），并且該單倍型在三亞市、長(zhǎng)治市和烏魯木齊市3個(gè)環(huán)境下的抽穗時(shí)間分別平均延遲9、11和12 d。啟動(dòng)子區(qū)第591 bp處的SNP是引起抽穗時(shí)間差異的主效位點(diǎn)，單倍型Hp-591A較Hp-591C早熟，可作為主效單倍型用于分子育種選擇。

谷子；抽穗時(shí)間；全基因組關(guān)聯(lián)分析；單倍型；遺傳變異；節(jié)律性表達(dá)

0 引言

【研究意義】農(nóng)作物是人類與動(dòng)物能量和食物的主要來源。據(jù)預(yù)測(cè)，在2050年之前，全球農(nóng)作物的單產(chǎn)增加100%—110%才能夠滿足不斷增長(zhǎng)人口的食物需求[1]。培育適宜生育期的農(nóng)作物新品種，充分利用光溫資源并實(shí)現(xiàn)更高的谷物產(chǎn)量，是解決這一問題的有效途徑?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】谷子（）作為起源于中國(guó)黃河流域的古老糧飼兼用作物，在中國(guó)的栽培歷史超過一萬年，在長(zhǎng)期的栽培和馴化過程中形成了豐富的種質(zhì)資源[2]。目前，谷子仍然是中國(guó)北方干旱、半干旱地區(qū)的重要糧食作物。谷子遺傳資源按照分布區(qū)域和播種期可分為春谷和夏谷兩類。已有研究結(jié)果表明，春谷主要分布在中國(guó)北方（黑龍江省）和西北部的高海拔地區(qū)，夏谷則分布在氣候溫暖的中部和南部地區(qū)，并且春谷平均抽穗期明顯早于夏谷[3]。谷子是禾本科黍亞科二倍體（2n=2X=18）自花授粉作物，具有C4高光效、基因組較?。s430 M）的特點(diǎn)，目前，谷子高質(zhì)量基因組測(cè)序及組裝已經(jīng)完成[4-5]，穩(wěn)定高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系也已建立[6]，單倍型物理圖譜已經(jīng)構(gòu)建[3]完成，正在快速發(fā)展成為旱生C4禾谷類作物分子研究的模式植物。植物能夠整合季節(jié)性光周期和冬季溫度等外源信號(hào)及其內(nèi)源性調(diào)節(jié)物質(zhì)來調(diào)節(jié)開花時(shí)間[7]。日照時(shí)數(shù)和溫度，特別是光周期開花和春化過程與抽穗期緊密相關(guān)，并且這些調(diào)節(jié)途徑由多個(gè)基因共同決定[8-9]。CCT家族基因編碼的蛋白（CONSTANS、CO-like和TOC1）具有CCT蛋白保守結(jié)構(gòu)域，作為一類調(diào)控開花的轉(zhuǎn)錄因子，在植物花期調(diào)控過程中發(fā)揮了重要作用[10]。根據(jù)N末端結(jié)構(gòu)域，CCT家族基因編碼的蛋白質(zhì)可分為3個(gè)進(jìn)化枝，即CONSTANS-like（COL）進(jìn)化枝，CCT MOTIF FAMILY（CMF）進(jìn)化枝和PSEUDORESPONSE REGULATOR（PRR）進(jìn)化枝。COL蛋白具有1或2個(gè)B-box型鋅指結(jié)構(gòu)域，如擬南芥基因（）和水稻基因（）；CMF蛋白在N末端沒有保守結(jié)構(gòu)域，如水稻基因（）[11]；PRR蛋白具有偽受體（response regulator receiver motif，REC）結(jié)構(gòu)域，如擬南芥晝夜節(jié)律系統(tǒng)關(guān)鍵調(diào)控基因（，也稱為）和水稻基因（也稱為）[12-14]。CO是第一個(gè)被報(bào)道的CCT家族基因，在擬南芥中介導(dǎo)了上游光周期信號(hào)與下游成花素基因間的協(xié)同調(diào)控[15]。研究發(fā)現(xiàn)，水稻CCT結(jié)構(gòu)域發(fā)生錯(cuò)義突變，形成PRR37/Hd2和Ghd7/Hd4 2種功能缺失突變，進(jìn)而拓寬了水稻抽穗期從溫暖地區(qū)到寒涼地區(qū)的適應(yīng)性[16]。已有研究表明，擬南芥晝夜節(jié)律振蕩器由多個(gè)連鎖的轉(zhuǎn)錄反饋網(wǎng)絡(luò)環(huán)組合而成[17-19]，振蕩器核心部位成員包括MYB轉(zhuǎn)錄因子（）和（），以及偽響應(yīng)調(diào)節(jié)器（），其中，的突變體表現(xiàn)為振蕩節(jié)律紊亂，抽穗期提前且早熟，葉片數(shù)及生物量下降[10]。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，該蛋白定位于細(xì)胞核，在被LHY/CCA1蛋白復(fù)合體負(fù)向調(diào)節(jié)的同時(shí)可以正向調(diào)節(jié)和的表達(dá)[20-21]。【本研究切入點(diǎn)】目前，雖然的晝夜節(jié)律特點(diǎn)和光周期開花調(diào)控規(guī)律已經(jīng)在雙子葉植物中初步解析，但在禾谷類作物中的表達(dá)規(guī)律和自然變異特點(diǎn)仍然缺乏了解，如何利用節(jié)律振蕩器的早熟效應(yīng)拓寬農(nóng)作物的適種范圍，尋找優(yōu)異單倍型并進(jìn)而提高禾谷類作物育種的效率和水平，是目前亟待解決的理論和應(yīng)用問題?！緮M解決的關(guān)鍵問題】中國(guó)擁有世界上最豐富多樣的谷子種質(zhì)資源，并且谷子單倍型物理圖譜已經(jīng)構(gòu)建完成[3]，本研究采用全基因組關(guān)聯(lián)分析的方法定位谷子抽穗時(shí)間基因，對(duì)該基因的時(shí)空表達(dá)、亞細(xì)胞定位、光周期響應(yīng)規(guī)律及序列變異與抽穗時(shí)間之間的關(guān)系進(jìn)行研究，為谷子高效遺傳改良和廣適性分子育種提供指導(dǎo)信息，為解決谷子抽穗時(shí)間分子標(biāo)記匱乏問題奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 種質(zhì)資源表型鑒定

以盡可能囊括不同地理來源、不同基因型品種多樣性為原則，有代表性地挑選以中國(guó)地區(qū)為主來自世界各地的99份谷子品種（地方品種66份和育成品種33份）作為研究材料（電子附表1），分別在三亞市（2010年）、長(zhǎng)治市（2016年）和烏魯木齊市（2016年）3個(gè)不同生態(tài)環(huán)境下種植。每品種播種兩行，行長(zhǎng)3 m，調(diào)查出苗期和抽穗期，每穗行50%幼苗展開第一片真葉的日期即為谷子出苗期，每穗行50%植株穗露出旗葉鞘的日期即為谷子抽穗期[22]。計(jì)算出苗次日至50%植株抽穗日的天數(shù)即為抽穗時(shí)間（單位：天）。

1.2 全基因組關(guān)聯(lián)分析

采用TASSEL 5.0軟件進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，所使用的單倍型圖譜及遺傳結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)均來自已經(jīng)發(fā)表的結(jié)果[3]。采用混合線性MLM模型進(jìn)行數(shù)據(jù)運(yùn)算，采用R軟件包qqman[23]完成數(shù)據(jù)分析。谷子基因組注釋文件下載自：https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal. html。

1.3 生物信息學(xué)分析

將（Photozyme數(shù)據(jù)庫基因號(hào)：）的蛋白序列提交至Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org）進(jìn)行蛋白序列Blast，挑選出擬南芥（）、水稻（）、玉米（）、小麥（）、高粱（）、大豆（）、棉花（）、蒺藜苜蓿（）等不同物種對(duì)應(yīng)同源蛋白序列的Fasta格式導(dǎo)入到MEGA 6軟件中進(jìn)行多序列比對(duì)，將比對(duì)好的同源蛋白序列利用鄰接法（Neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，步長(zhǎng)值設(shè)為1 000，其他參數(shù)為默認(rèn)值。

1.4 表達(dá)及亞細(xì)胞定位

在谷子多組學(xué)數(shù)據(jù)庫（MDSi：Multi-omics Database for，http://foxtail-millet.biocloud. net/home）表達(dá)量可視化（expression visualization）欄目中檢索（）獲得數(shù)字表達(dá)量FPKM值，分析的時(shí)空組織表達(dá)特異性。

以已完成全基因組測(cè)序的豫谷1號(hào)[5]cDNA為模板，分別用亞細(xì)胞定位N端載體引物對(duì)GFPG5-F1/ GFPG5-R1和C端載體引物對(duì)G5GFP-F1/G5GFP-R1（去除終止密碼子）（表1）對(duì)的CDS進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以日本晴cDNA為模板，用亞細(xì)胞定位N端載體引物對(duì)MYBRFP-F/MYBRFP-R對(duì)已報(bào)道核定位基因[24]的CDS進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用限制性內(nèi)切酶Ⅰ和Ⅰ消化亞細(xì)胞定位PUC-N端載體；限制性內(nèi)切酶Ⅰ和Ⅰ消化亞細(xì)胞定位PUC-C端載體，將獲得的N端、C端和N端PCR回收產(chǎn)物利用同源重組酶Phanta?Max Super-Fidelity DNA Ploymerase（Vazyme #P505）連接到純化回收后的線性化的PUC-N和PUC-C端載體上分別完成35S∷GFP︰SiTOC1、35S∷SiTOC1︰GFP和35S∷RFP︰OsMYB2亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建。將構(gòu)建好的亞細(xì)胞定位N端、C端載體和Marker載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中挑取單克隆，分別用N端、C端載體檢測(cè)引物對(duì)PUCGFPN- TestF/PUCGFPN-TestR（GFPG5-F1.1和GFPG5-R1.1為內(nèi)部測(cè)序引物）、PUCGFPC-TestF/PUCGFPC-TestR（G5GFP-F1.1和G5GFP-R1.1為內(nèi)部測(cè)序引物）和PUCRFPN-TestF/PUCRFPN-TestR檢測(cè)陽性克隆（表1），并對(duì)陽性克隆完成雙向測(cè)序和序列拼接，挑選與參考序列完全一致的單克隆提取質(zhì)粒（濃度不低于500 ng·μl-1）。提取豫谷1號(hào)谷子原生質(zhì)體，將構(gòu)建好的SiTOC135S∷ GFP︰SiTOC1和35S∷SiTOC1︰GFP亞細(xì)胞定位N端、C端載體分別與Marker載體35S∷RFP︰OsMYB2共轉(zhuǎn)和空載體同時(shí)轉(zhuǎn)化谷子原生質(zhì)體，利用共聚焦電子顯微鏡ZenLightEdition（廠家：Carl Zeiss MicroImaging）觀察轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體并生成亞細(xì)胞定位結(jié)果圖。

表1 SiTOC1亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建PCR擴(kuò)增及測(cè)序引物

GFP-N端載體對(duì)應(yīng)35S∷GFP∶SiTOC1，RFP-N端載體對(duì)應(yīng)35S∷RFP∶OsMYB2，其中，GFPG5-F1.1和GFPG5-R1.1僅為測(cè)序引物；GFP-C端載體對(duì)應(yīng)35S∷SiTOC1︰GFP，其中，G5GFP-F1.1和G5-R1.1僅為測(cè)序引物

The GFP-N end vector corresponds to 35S∷GFP︰SiTOC1, the GFP-N end vector corresponds to 35S∷RFP︰OsMYB2, of which GFPG5-F1.1 and GFPG5-R1.1 are only sequencing primers. the GFP-C end vector corresponds to 35S∷SiTOC1︰GFP, of which G5GFP-F1.1 and G5-R1.1 are only sequencing primers

1.5 表達(dá)節(jié)律分析

利用光、溫敏感的Ci846作為研究材料，將Ci846種子播種于短日條件（10 h光照/14 h黑暗）、28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至5葉1心期進(jìn)行24 h光周期取樣，取地上部組織，每隔2 h取樣一次，其中7：00至17：00為光照階段，17：00至次日7：00為黑暗階段，共取樣13次，將取好的樣品放置于液氮中冷凍，利用全式金的TransZol Up（Lot#O10707）試劑盒，按照操作說明完成所有樣品總RNA的提取，提取好的RNA用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，結(jié)果顯示，能夠看到清晰明亮的28s和18s帶型，28s帶型約為18s亮度的2倍，5s帶型亮度較弱，吸取各樣本RNA原液2 μl利用Nanodrop ND 1000分光光度計(jì)（廠家：美國(guó)Nano Drop）檢測(cè)OD260/OD280比值和RNA濃度，OD260/OD280比值為1.7—2.1，代表RNA完整性及純度良好。利用TakaRa廠家的PrimeScriptTM Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit（Cat # 6210A）試劑盒對(duì)提取好的樣品RNA取2 000 ng反轉(zhuǎn)成雙鏈cDNA。利用熒光定量引物對(duì)G5Q-F1/G5Q-R1和內(nèi)參基因熒光定量引物對(duì)Cullin-F/Cullin-R（表2）進(jìn)行熒光定量PCR（3次技術(shù)重復(fù)），所用試劑為Realtime PCR Super mix SYBRgreen with anti-Taq（Cat #MF013-01）。配置好的PCR反應(yīng)液瞬離后放入熒光定量PCR儀（廠家：ROCGENE，型號(hào)：Archimed-X6系統(tǒng)），對(duì)PCR反應(yīng)結(jié)束后輸出的Ct值利用2-△△Ct公式[25]計(jì)算各樣品的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行節(jié)律表達(dá)分析。

表2 SiTOC1 PCR擴(kuò)增和測(cè)序引物

（Photozyme基因號(hào)：）為qPCR內(nèi)參基因，G5P-F1.1和G5P-R1.1僅為測(cè)序引物

(Gene ID:) is the reference gene of qPCR, G5P-F1.1 and G5P-R1.1 are only sequencing primers

1.6 單倍型變異分析

利用CTAB法[26]提取不同谷子品種葉片基因組DNA，稀釋一份200 ng·μl-1DNA工作液用于PCR，其余DNA原液-40℃保存。分別設(shè)計(jì)引物對(duì)G5-F1/ G5-R1和G5-F2/G5-R2對(duì)編碼區(qū)DNA完成PCR擴(kuò)增和測(cè)序，引物對(duì)G5P-F1/G5P-R1對(duì)啟動(dòng)子區(qū)完成PCR擴(kuò)增，G5P-F1.1和G5P-R1.1為內(nèi)部測(cè)序引物（表2）。采用Primer STAR? HS DNA Polymerase with GC Buffer（Cat#R044A），按試劑說明書配置PCR反應(yīng)液。配置好的PCR反應(yīng)液瞬離后放入PCR儀（廠家：新加坡Veriti，型號(hào)：VeritiTM 96-well Thermal Cycler）進(jìn)行PCR反應(yīng)。用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，結(jié)果均為單一的目的條帶，將樣品特異的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，利用DNAMAN軟件完成序列拼接。將拼接好的所有樣品序列提交至MEGA 6軟件完成多序列比對(duì)，比對(duì)好的序列文件提交至DnaSP v.5.0提取變異位點(diǎn)[27]，并對(duì)所有變異位點(diǎn)進(jìn)行單倍型分析。將分析好的單倍型文件（rdf格式）使用Network軟件分析單倍型之間的衍生關(guān)系生成單倍型Network網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 啟動(dòng)子單倍型轉(zhuǎn)錄水平分析

將挑選出的Hp-591A單倍型材料Ci001、Ci023、Ci086、Ci162、Ci846和Hp-591A單倍型材料Ci038、Ci082、Ci115、Ci138、Ci222播種于短日條件（10 h光照/14 h黑暗）、28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至5葉1心期，取地上部組織提取RNA、反轉(zhuǎn)成cDNA、使用引物對(duì)G5Q-F1/G5Q-R1和引物對(duì)Cullin-F/Cullin-R（表2）對(duì)進(jìn)行熒光定量PCR（3次技術(shù)重復(fù)），并計(jì)算各樣品的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 谷子抽穗時(shí)間基因SiTOC1的關(guān)聯(lián)分析定位

通過全基因組關(guān)聯(lián)分析，在第1染色體物理位置31 456 761 bp處鑒定到了一個(gè)顯著的關(guān)聯(lián)信號(hào)（2010年三亞市），與抽穗期緊密相關(guān)（圖1-A）。在該位點(diǎn)上下游50 kb區(qū)間內(nèi)共存在7個(gè)編碼基因（圖1-B），統(tǒng)計(jì)7個(gè)候選基因的功能注釋信息（表3）發(fā)現(xiàn)為擬南芥同源基因，該基因?qū)儆贑CT基因家族，與抽穗時(shí)間密切相關(guān)。

2.2 SiTOC1的基因結(jié)構(gòu)與同源衍化

編碼區(qū)全長(zhǎng)2 266 bp，包含6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子。SiTOC1蛋白N端第28—143位氨基酸（1、2、3外顯子）存在一個(gè)REC結(jié)構(gòu)域（response regulator receiver domain），C端第443—486位氨基酸（第6外顯子）存在一個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域（CCT domain）（圖2-A）。對(duì)SiTOC1在擬南芥、水稻、玉米、小麥、高粱、大豆、棉花、蒺藜苜蓿等不同物種中的同源蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，并對(duì)其基因結(jié)構(gòu)和作用基序進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示同源蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹劃分為兩大分枝：分枝Ⅰ均為單子葉植物；分枝Ⅱ均為雙子葉植物。谷子SiTOC1在分枝Ⅰ中與高粱、玉米、水稻具有更高的相似度（圖2-B）?；蚪Y(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)在不同物種中具有保守的基因結(jié)構(gòu)，并且共享保守的REC和CCT結(jié)構(gòu)域。

2.3 SiTOC1的表達(dá)規(guī)律及亞細(xì)胞定位

利用谷子MDSi數(shù)據(jù)庫表達(dá)量數(shù)據(jù)對(duì)進(jìn)行組織特異性表達(dá)分析，結(jié)果顯示，在根、莖、葉、穗等多個(gè)組織中表達(dá)，其中，在2葉1心期整株、灌漿期穗下莖、灌漿期旗葉、灌漿期旗葉葉鞘、灌漿期頂端正數(shù)第二莖、灌漿期頂端正數(shù)第四葉、灌漿期頂端正數(shù)第四葉葉鞘、灌漿期根、葉脈、葉肉高表達(dá)，但在穗部的小碼表達(dá)量相對(duì)較低（圖3-A）。SiTOC1和GFP融合蛋白（35S∷SiTOC1︰GFP及35S∷GFP︰SiTOC1）在谷子原生質(zhì)體中的亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示SiTOC1定位于細(xì)胞核（圖3-B），這與擬南芥同源基因結(jié)果一致，表明可能和一樣作為轉(zhuǎn)錄因子執(zhí)行相似的生物學(xué)功能。

2.4 SiTOC1 24 h節(jié)律表達(dá)模式分析

24 h表達(dá)節(jié)律結(jié)果顯示，與CCT家族基因相似，在24 h短日（10 h光照/14 h黑暗）光周期條件下具有震蕩表達(dá)模式（圖4），在7：00—11：00受光照階段的前4 h表達(dá)量較低，在開始光照2 h后（9：00）幾乎不表達(dá)，從11：00開始表達(dá)量開始上升，在臨近黑暗條件表達(dá)量急劇上升，在給光10 h后即在光照與黑暗臨界點(diǎn)17：00時(shí)，表達(dá)量達(dá)到峰值。在黑暗處理2 h（19：00—21：00）后表達(dá)量急劇下降，隨后呈現(xiàn)平緩下降的趨勢(shì)，在黑暗處理12 h（即次日凌晨5：00）后表達(dá)量降至最低。

A：SiTOC1 GWAS定位結(jié)果；B：關(guān)聯(lián)位點(diǎn)區(qū)間內(nèi)的候選基因 A: Results of SiTOC1 GWAS; B: Candidate gene in the associated locus range

表3 候選基因注釋信息

紅色字體標(biāo)注同源基因（Seita.1G236100）；N/A表示無注釋信息

homologous gene(Seita.1G236100) is marked in red font; N/A indicates no annotation

A：SiTOC1的基因結(jié)構(gòu)；B：SiTOC1同源蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹和基因結(jié)構(gòu)。GRMZM2G020081_T01：玉米；Sobic.004G216700.1：高粱；Sevir.1G241000.1：狗尾草；Seita.1G236100.1 (SiTOC1)：谷子；LOC_Os02g40510.1：水稻；Traes_6AL_A0A31AA9F.1：小麥；AT5G61380.1：擬南芥；Gorial.003G098300.2：棉花；Glyma.06G196200.1：大豆；Medtr4g108880.2：蒺藜苜蓿

2.5 SiTOC1核苷酸序列遺傳多態(tài)性分析

對(duì)不同地理來源的99份谷子品種（地方品種66份，育成品種33份）的編碼區(qū)所有的變異位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，編碼區(qū)呈現(xiàn)出豐富的遺傳變異，全長(zhǎng)2 266 bp的編碼區(qū)共存在148個(gè)變異位點(diǎn)，其中共有130個(gè)SNP和18個(gè)Indel，這些變異位點(diǎn)共組合成44種單倍型，且變異位點(diǎn)多集中于內(nèi)含子區(qū)。外顯子區(qū)的SNP多為同義突變，但存在13個(gè)非同義SNP位點(diǎn)，分別為g46a（V/M）、g109c（A/P）、g1295a（D/N）、g1428t（I/R）、g1551a（S/N）、t1556a（L/I）、g1707a（R/Q）、g1718t（G/C）、g1756t（Q/H）、a1824c（E/A）、t1847c（Y/H）、c1856t（P/S）和g2180a（V/I）（圖5）。REC結(jié)構(gòu)域共存在25個(gè)變異位點(diǎn)，其中20個(gè)SNP位點(diǎn)為無義突變，5個(gè)位點(diǎn)均導(dǎo)致了移碼突變但均為稀有變異；CCT結(jié)構(gòu)域則十分保守，未發(fā)生突變。編碼區(qū)劃分的44類單倍型中存在2個(gè)主型，分別為H-2（單倍型頻率為13）和H-6（單倍型頻率為10）（圖6）；兩類主要單倍型之間共存在7個(gè)變異位點(diǎn)，其中1個(gè)Indel位點(diǎn)為1099+c（稀有變異），6個(gè)SNP位點(diǎn)中5個(gè)為無義突變分別是g232t、t305c、a351t、t412c和a831g，1個(gè)有義突變?yōu)間1428t（I/R）。對(duì)編碼區(qū)的遺傳變異分析發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)存在豐富的多態(tài)性，但其重要的2個(gè)功能域REC和CCT卻高度保守。

啟動(dòng)子區(qū)的遺傳變異常與基因的表達(dá)量緊密相關(guān)。對(duì)不同地理來源的29份谷子地方品種的啟動(dòng)子進(jìn)行單倍型分析，共檢測(cè)到60個(gè)變異位點(diǎn)，包括44個(gè)SNP位點(diǎn)和16個(gè)Indel位點(diǎn)，共有14種單倍型，包括2種主要單倍型Hp-3（單倍型頻率為4）和Hp-4（單倍型頻率為12）（圖7-A）。這兩類單倍型僅在ATG上游第591 bp處存在一個(gè)SNP（C-591A），其中單倍型Hp-3在該位點(diǎn)為C，單倍型Hp-4在該位點(diǎn)處為A，暗示該位點(diǎn)可能會(huì)影響的轉(zhuǎn)錄水平。啟動(dòng)子單倍型Hp-591C（單倍型頻率為16）和Hp-591A（單倍型頻率為13）的相對(duì)表達(dá)量分析結(jié)果顯示，Hp-591C表達(dá)量高于Hp-591A（圖7-B），上調(diào)了近2.5倍（=0.014）（圖7-C）。

A：SiTOC1的組織特異性分析：a：2葉1心期整株；b：灌漿期穗下莖；c：灌漿期旗葉；d：灌漿期旗葉葉鞘；e：灌漿期頂端正數(shù)第二莖；f：灌漿期頂端正數(shù)第四葉；g：灌漿期頂端正數(shù)第四葉葉鞘；h：灌漿期根；i：發(fā)育早期穗部小碼；j：發(fā)育晚期穗部小碼；k：葉脈；l：葉肉。B：SiTOC1的亞細(xì)胞定位，紅色熒光蛋白信號(hào)通道顯示35S∷RFP∶OsMYB2的信號(hào)，比例尺bar=10 μm

頂部條框的白色部分對(duì)應(yīng)光照時(shí)間段（7：00—17：00），黑色部分對(duì)應(yīng)黑暗時(shí)間段（17：00—7：00）

SiTOC1編碼區(qū)單倍型Network圖，不同實(shí)心圓代表不同單倍型，圓的面積和對(duì)應(yīng)單倍型所包含的品種數(shù)量成正比，黑色連接線代表不同單倍型的突變步驟，連接線上的紅色圓點(diǎn)代表大于一次的突變步驟

2.6 SiTOC1單倍型與抽穗時(shí)間的相關(guān)性分析

編碼區(qū)兩類單倍型抽穗時(shí)間差異分析結(jié)果（圖8）表明，H-2單倍型在3個(gè)環(huán)境下（2010三亞市、2016長(zhǎng)治市、2016烏魯木齊市）的抽穗時(shí)間均顯著晚于H-6單倍型，在2016烏魯木齊市達(dá)到了極顯著差異水平（=0.0089）（圖8-A）；啟動(dòng)子區(qū)單倍型Hp-591C和Hp-591A在3個(gè)環(huán)境下的抽穗時(shí)間差異顯著性分析結(jié)果顯示，Hp-591C單倍型在3個(gè)環(huán)境下的抽穗時(shí)間均顯著晚于Hp-591A單倍型（圖8-B），分別平均延遲9、11和12 d。通過比較編碼區(qū)單倍型H-2和H-6，僅存在一個(gè)有義突變：g1428t（I/R），該分離位點(diǎn)在3個(gè)環(huán)境下的抽穗時(shí)間均無顯著差異（電子附圖1）。鑒于H-2單倍型和Hp-591C單倍型與H-6單倍型和Hp-591A單倍型共分離，推測(cè)在3個(gè)環(huán)境下抽穗時(shí)間的顯著差異主要決定于啟動(dòng)子區(qū)的變異。

3 討論

3.1 TOC1功能在禾谷類作物中具有保守型

從同源基因進(jìn)化分析結(jié)果可以看出，不同物種中的具有保守的REC和CCT結(jié)構(gòu)域（圖2），暗示不同物種中的也許具有近似的功能，尤其是禾谷類作物中的由于具有較高的序列保守性，功能可能更為接近。擬南芥功能分析發(fā)現(xiàn)，該基因的突變可導(dǎo)致生物鐘節(jié)律由24 h變?yōu)?1 h左右，導(dǎo)致擬南芥植株對(duì)24 h光周期下的長(zhǎng)日和短日響應(yīng)變?nèi)?，相比野生型表現(xiàn)出了早熟、生物量降低的現(xiàn)象[10]。谷子編碼基因的時(shí)空表達(dá)規(guī)律也表現(xiàn)出了生物鐘基因特點(diǎn)，并且SiTOC1定位于細(xì)胞核，這和擬南芥中研究認(rèn)為作為核定位的轉(zhuǎn)錄因子行使功能結(jié)果一致。谷子單倍型變異分析顯示，該基因表達(dá)量的降低可導(dǎo)致早熟效應(yīng)，這和擬南芥中觀察到的結(jié)果趨勢(shì)相同[10]。本研究的結(jié)果表明，禾谷類作物中功能與雙子葉植物類似，突變或表達(dá)量降低可引起早熟效應(yīng)，具有潛在的育種利用價(jià)值。

A：SiTOC1啟動(dòng)子單倍型Network圖；B—C：SiTOC1啟動(dòng)子單倍型相對(duì)表達(dá)量分析，P=0.014。*：在P＜0.05水平達(dá)到顯著差異。下同

**：在P＜0.01水平達(dá)到極顯著差異。A：SiTOC1編碼區(qū)單倍型與抽穗時(shí)間數(shù)據(jù)的差異顯著性分析，其中2010三亞市P=0.0180，2016長(zhǎng)治市P=0.0290，2016烏魯木齊市P=0.0089；B：SiTOC1啟動(dòng)子單倍型與抽穗時(shí)間數(shù)據(jù)的差異顯著性分析，其中2010三亞市P=0.0262，2016長(zhǎng)治市P=0.0106，2016烏魯木齊市P=0.0257

已知水稻CCT家族基因/Hd2和/Hd4 2種發(fā)生在CCT結(jié)構(gòu)域的功能缺失的自然等位突變拓寬了水稻抽穗期的適應(yīng)性[17]。分析不同谷子品種編碼區(qū)的遺傳多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)存在豐富的遺傳多樣性，全長(zhǎng)2 266 bp的編碼區(qū)在99份谷子不同品種中共檢測(cè)到148個(gè)變異位點(diǎn)，單倍型分析發(fā)現(xiàn)所有變異位點(diǎn)組合成了豐富的單倍型變異類型共計(jì)49種。雖然存在豐富的核苷酸多態(tài)性，但編碼區(qū)REC，CCT結(jié)構(gòu)域卻高度保守，REC結(jié)構(gòu)域檢測(cè)到25個(gè)變異位點(diǎn)，其中20個(gè)SNP位點(diǎn)均為同義突變，5個(gè)Indel位點(diǎn)均導(dǎo)致了移碼突變但均為稀有變異。處在光周期途徑中晝夜節(jié)律振蕩器的核心位置，已知REC和CCT結(jié)構(gòu)域是SiTOC1的關(guān)鍵作用基序，尤其CCT結(jié)構(gòu)域涉及核定位、DNA結(jié)合和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，可直接作用于/并抑制其表達(dá)，該作用基序發(fā)生突變或者刪除可導(dǎo)致SiTOC1對(duì)/的抑制作用消除[15-16]，因此的REC、CCT結(jié)構(gòu)域在不同地理來源的谷子品種中表現(xiàn)出了保守性，對(duì)于穩(wěn)定谷子的抽穗時(shí)間表現(xiàn)具有重要意義。

3.2 SiTOC1具有主效單倍型并在多環(huán)境下表現(xiàn)早熟效應(yīng)

本研究分析了編碼區(qū)和啟動(dòng)子區(qū)的單倍型，發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)的2種主要單倍型H-2和H-6與啟動(dòng)子區(qū)Hp-591C和Hp-591A單倍型共分離，共同引起谷子抽穗時(shí)間在多環(huán)境下的顯著差異。通過比較分析發(fā)現(xiàn)相比于編碼區(qū)，啟動(dòng)子區(qū)C-591A可能是影響谷子抽穗時(shí)間的一個(gè)重要位點(diǎn)，該分離位點(diǎn)產(chǎn)生的單倍型Hp-591C和Hp-591A的相對(duì)表達(dá)量以及抽穗時(shí)間均存在顯著差異，并且Hp-591C具有更高的表達(dá)量和較長(zhǎng)的抽穗時(shí)間。因此Hp-591A可作為早抽穗單倍型用于育種選擇。已有研究發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)的EE元件（evening element，AAAATATCT）是節(jié)律響應(yīng)的重要順式作用元件，Myb類轉(zhuǎn)錄因子CCA1和LHY可直接結(jié)合啟動(dòng)子區(qū)的EE元件抑制的表達(dá)[20-21]，而啟動(dòng)子區(qū)EE元件在所有品種中保守，未發(fā)生突變，因此C-591A分離位點(diǎn)可能位于其他特殊的順式作用元件或者結(jié)合位點(diǎn)從而影響的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，該位點(diǎn)的具體作用還需要深入開展遺傳研究加以核實(shí)。本研究的結(jié)果直接證實(shí)了主效單倍型的存在，并發(fā)現(xiàn)在不同緯度條件下主效單倍型的效應(yīng)穩(wěn)定且顯著，具有潛在的育種利用價(jià)值。

3.3 谷子廣適性品種選育可能的技術(shù)途徑

快速、有效地改良抽穗時(shí)間，實(shí)現(xiàn)農(nóng)作物對(duì)不同光周期環(huán)境的適應(yīng)性改良具有重要的實(shí)踐意義。谷子是光周期敏感作物，對(duì)不同光周期生態(tài)區(qū)域的適應(yīng)性較差。近年來，豫谷18、中谷2等廣適性谷子新品種的選育成功[28]，在一定程度上說明了開展谷子廣適性育種的可行性。本研究發(fā)現(xiàn)主效單倍型的存在和潛在的利用途徑，有望在未來的谷子新品種改良過程中發(fā)揮作用。

在禾谷類作物水稻中關(guān)于CCT類基因的研究進(jìn)展表明，在不同的日長(zhǎng)中顯示出雙功能，在日本晴中短日條件促進(jìn)開花，長(zhǎng)日條件延遲開花[29]，而且可在晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)下觸發(fā)下游的成花素表達(dá)[30]。此外，的雙功能特性與背景有關(guān)：在長(zhǎng)日照條件下，被誘導(dǎo)抑制谷物中編碼B型響應(yīng)調(diào)節(jié)劑的特異開花激活基因的表達(dá)，導(dǎo)致成花素減少和開花時(shí)間延遲[31]，在鎮(zhèn)山97中，持續(xù)促進(jìn)開花，當(dāng)基因組中存在時(shí)，與相互作用并導(dǎo)致開花延遲[32]。除了、和也能夠?qū)崿F(xiàn)從促進(jìn)開花到延遲開花的功能逆轉(zhuǎn)[33-34]。已有的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明，、和之間以及、和之間的遺傳相互作用增強(qiáng)了對(duì)的抑制作用[35]。從水稻中已有的研究結(jié)果來看，CCT類基因普遍與抽穗期適應(yīng)性調(diào)控緊密相關(guān)，開展相關(guān)基因的遺傳變異分析對(duì)于尋找相關(guān)基因的育種利用途徑具有重要的理論和實(shí)踐指導(dǎo)意義。

可以看出，谷子CCT類基因之間的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及其遺傳相互作用也應(yīng)該普遍存在，需要育種工作者進(jìn)一步開展相關(guān)基因的自然變異及遺傳效應(yīng)研究，為谷子廣適性新品種選育提供更多分子標(biāo)記。此外，通過在禾谷類作物中開展更多CCT類基因的變異和單倍型效應(yīng)研究，也必將極大地促進(jìn)相關(guān)育種工作的高效開展，為廣適性新品種選育及保障國(guó)家糧食安全提供更多指導(dǎo)信息。

4 結(jié)論

谷子SiTOC1具有保守的REC和CCT結(jié)構(gòu)域，在響應(yīng)光周期的組織（根、莖、葉）中高表達(dá)，具有CCT家族基因典型的晝夜節(jié)律性表達(dá)模式并定位于細(xì)胞核。編碼區(qū)主要單倍型H-2和H-6與啟動(dòng)子區(qū)效應(yīng)位點(diǎn)（C-591A）共分離，該效應(yīng)位點(diǎn)單倍型Hp-591C的表達(dá)量較Hp-591A顯著上調(diào)，導(dǎo)致谷子品種在三亞市、長(zhǎng)治市和烏魯木齊市3個(gè)不同環(huán)境下的抽穗時(shí)間分別平均延遲9、11和12 d。

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Characterizations of Transcriptional and Haplotypic Variations of

ZHANG LinLin, ZHI Hui, TANG Sha, ZHANG RenLiang, ZHANG Wei, JIA GuanQing, DIAO XianMin

Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081

【】Identification of allelic variations of heading date adaptation related genes and laying foundation for breeding of wide-adapted varieties in foxtail millet.【】In this trial, a vital regulator of heading time in foxtail millet,, was identified using genome-wide association analysis. Spatio-temporal transcription (multi-omics database for，MDSi), sub-cellular localization and 24 hours rhythm expression pattern ofwas analyzed. Sequence variations of both promoter and encoding regions inand relationships between haplotypic variations and heading date were characterized in 99 foxtail millet accessions.【】A significant GWAS signal (Position: 31 456 761 bp) was detected on Chromosome 1 and only onehomologue was identified ().highly expressed in root, stem and leaf, and located into cell nucleus. An elevated expression ofwas identified at dusk across whole day transcription survey under short-day environment. Many haplotypic variations ofwere identified but REC and CCT domains of SiTOC1were conserved in foxtail millet accessions, and two main haplotypes including H-2 and H-6 in protein encoding regions combined with two co-segregated haplotypes including Hp-591C and Hp-591A were identified. Nearly 2.5 times higher expression of Hp-591C haplotype combined with 9,11 and 12 days delay of heading time through Hainan, Changzhi and Urumuqi were observed.【】The major haplotype Hp-591A identified at 591 bp in the promoter region ofmatures earlier than Hp-591C and could be selected as a main effective locus for molecular breeding of foxtail millet.

; heading time; genome-wide association study; haplotype; genetic variation; rhythmic expression

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.11.003

2020-11-09；

2020-12-07

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFD1000701/2018YFD1000700）、國(guó)家自然科學(xué)基金（31871630）、國(guó)家谷子高粱產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-06-13.5- A4）、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程

張林林，E-mail：657044121@qq.com。通信作者賈冠清，E-mail：jiaguanqing@caas.cn。通信作者刁現(xiàn)民，E-mail：diaoxianmin@caas.cn

（責(zé)任編輯 李莉）