劉金秋,曹幫華,段正洪,孔雨光,崔鳳華,郝明慧,陳 珍,趙聯(lián)秀,欒 艷

（1.山東省地質(zhì)科學(xué)研究院，山東濟(jì)南250013；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，山東泰安271001；3.滕州市國(guó)有西崗苗圃，山東滕州277519；4.山東省林業(yè)監(jiān)測(cè)規(guī)劃院，山東濟(jì)南250014）

水分是植物的重要組成部分，是植物賴以生存的必要條件之一，無論是長(zhǎng)時(shí)期的干旱還是短時(shí)間的水分虧缺都可能對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生不同程度的影響[1]。干旱脅迫會(huì)引起植物脫水，降低細(xì)胞和組織水勢(shì)，影響植物各種生理過程，同時(shí)植物主動(dòng)適應(yīng)外界變化，積極的進(jìn)行生理生化代謝變化[2]。在林業(yè)生產(chǎn)中，普遍存在著因?yàn)橥寥栏珊翟斐沙苫盥什桓吆腿斯ち稚a(chǎn)力低下等問題[3]。研究植物在干旱脅迫下的抵抗能力對(duì)林業(yè)生產(chǎn)、良種選育具有重要意義。

欒樹（Koelreuteria paniculata）在園林綠化中應(yīng)用較多，其觀賞性較高，抗逆性較強(qiáng)，是優(yōu)良的園林綠化行道樹樹種[4]。欒樹在我國(guó)生長(zhǎng)地域廣闊，國(guó)內(nèi)東北南部、長(zhǎng)江流域、甘肅一帶都有栽植。近年來對(duì)欒樹的培育、病蟲害防治皆有研究，抗旱性的研究多集中在生長(zhǎng)速率、葉片生理生化特征上，對(duì)干旱脅迫下形態(tài)學(xué)、光合作用影響研究較少，且多是與其他樹種間的比較，而欒樹種間抗旱性研究較少[5-8]。本文以滕州西崗國(guó)有苗圃選育的欒樹優(yōu)良觀賞無性系“滕選”4 號(hào)、5 號(hào)以及北欒為研究對(duì)象，通過盆栽試驗(yàn)，研究了持續(xù)干旱條件下，各個(gè)供試無性系苗木形態(tài)及生理生化指標(biāo)的變化，并對(duì)其抗旱性進(jìn)行比較，為良種選育和生產(chǎn)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為欒樹優(yōu)良無性系“滕選”4 號(hào)、5 號(hào)1年生扦插苗，以北欒實(shí)生樹扦插苗為對(duì)照。

1.2 研究方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)地位于山東省滕州市西崗國(guó)有苗圃。試驗(yàn)設(shè)干旱和對(duì)照(正常澆水)2 個(gè)處理，每個(gè)處理每個(gè)無性系5 株，3 次重復(fù)，計(jì)15 株。2019年4月，將植株定植在35 cm×30 cm(高×內(nèi)徑)的塑料營(yíng)養(yǎng)盆中。7月25日試驗(yàn)開始，脅迫前2 d 對(duì)所有植株澆透水2 次，之后停止?jié)菜?，?duì)照組正常澆水。逐日測(cè)定土壤含水量，每隔5 d 進(jìn)行形態(tài)觀測(cè)統(tǒng)計(jì)，苗高測(cè)量，并取各供試材料相同位置葉片測(cè)定相關(guān)生理生化指標(biāo)，至第40 d 停止取樣，共取樣9 次。

1.2.2 指標(biāo)及測(cè)定方法

（1）形態(tài)觀測(cè)

記錄不同無性系葉片萎蔫、黃葉、枯葉數(shù)量及時(shí)間。

（2）土壤含水量

采用稱重法測(cè)定，土壤相對(duì)含水量=土壤絕對(duì)含水量/田間持水量。

（3）生理生化指標(biāo)

苗高用卷尺測(cè)量,生長(zhǎng)率=（干旱脅迫末期苗高-干旱脅迫前苗高）/干旱脅迫前苗高；葉綠素用SPAD-502 葉綠素儀測(cè)定；凈光合速率用Li-6400XT 光合儀測(cè)定；脯氨酸、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)采用的分光光度法[9]。

1.2.3 數(shù)據(jù)的處理與分析

利用Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)歸整理、作圖，SPSS 20.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，鄧肯（Duncant）方法進(jìn)行多重比較。運(yùn)用模糊數(shù)學(xué)中隸屬函數(shù)法[10]，分別根據(jù)試驗(yàn)測(cè)定的指標(biāo)情況，對(duì)其抗旱能力進(jìn)行排序。

與植物抗旱性呈正相關(guān)的生長(zhǎng)率、葉綠素含量、凈光合速率、SOD 的隸屬函數(shù)值計(jì)算采用公式：

R（Xi）＝（Xi－Xmin）／（Xmax－Xmin）

與植物抗旱性呈負(fù)相關(guān)的丙二醛含量的隸屬函數(shù)值計(jì)算采用公式：

R（Xi）＝1-(Xi－Xmin）／（Xmax－Xmin）

式中，Xi為第40 d 某項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定值，Xmax、Xmin為某一指標(biāo)的最大值和最小值。將各無性系隸屬函數(shù)值進(jìn)行計(jì)算，然后取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下不同欒樹無性系土壤含水量變化

各無性系土壤含水量變化見表1，干旱脅迫初期土壤相對(duì)含水量分別為4 號(hào)65.17%、5 號(hào)65.3%、北欒65.51%，至脅迫結(jié)束分別降至14.15%、13.91%、11.35%，土壤含水量在相同脅迫時(shí)間不同無性系間差異不顯著（P＞0.05），但同一無性系在不同干旱脅迫時(shí)間下差異極顯著（P＜0.01）。

隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，土壤相對(duì)含水量逐漸下降，但是下降幅度又有所不同，前15 d 各個(gè)無性系土壤含水量下降較快，以北欒下降幅度最大，至第10 d 土壤含水量已降至24.24%，達(dá)到嚴(yán)重干旱水平，而4 號(hào)、5 號(hào)在第10 d 仍維持到43.42%、37.15%，至15 d 才分別降至26.42%、28.42%，接近對(duì)照第10 d 的干旱水平，表明北欒在前期苗木蒸騰大于無性系4 號(hào)、5 號(hào)。第10 d 后所有無性系土壤含水量下降較為平緩，此時(shí)苗木蒸騰能力下降，土壤含水量由高到低依次為“滕選”4 號(hào)＞“滕選”5 號(hào)＞北欒。

2.2 干旱脅迫下3 個(gè)欒樹無性系苗木形態(tài)特征

干旱脅迫下3 個(gè)無性系形態(tài)特征見表2，在干旱脅迫前5 d 所有無性系生長(zhǎng)正常；干旱脅迫至第10 d 對(duì)照北欒2 株葉片萎蔫下垂但“滕選”4 號(hào)、“滕選”5 號(hào)仍基本正常；干旱脅迫第15 d 對(duì)照北欒11株葉片萎蔫下垂，葉片開始脫落，“滕選”4 號(hào)5 株葉片萎蔫下垂，8 株底部葉片出現(xiàn)黃葉，部分出現(xiàn)黃葉，“滕選”5 號(hào)3 株萎蔫下垂，2 株底部出現(xiàn)黃葉；干旱脅迫第20 d 對(duì)照北欒所有植株萎蔫，6 株底部葉片失綠變紅；“滕選”4 號(hào)（12 株）、“滕選”5 號(hào)（5株）葉片萎蔫下垂；干旱脅迫第25 d 對(duì)照北欒（9株）、“滕選”4 號(hào)（6 株）、“滕選”5 號(hào)（4 株）下部出現(xiàn)枯葉；干旱脅迫第30 d 對(duì)照北欒所有植株下部枯葉，“滕選”4 號(hào)、5 號(hào)所有植株葉片萎蔫下垂，葉片干枯加??；干旱脅迫第35 d 對(duì)照北欒13 株上部出現(xiàn)枯葉，“滕選”4 號(hào)、“滕選”5 號(hào)所有植株下部出現(xiàn)黃葉；干旱脅迫第40 d 對(duì)照北欒葉片萎蔫嚴(yán)重，莖變細(xì)軟，落葉嚴(yán)重，“滕選”4 號(hào)、5 號(hào)均14 株枯葉，葉片干枯嚴(yán)重，莖變細(xì)軟。相比而言，“滕選”5 號(hào)葉片萎蔫程度較輕，4 號(hào)次之，北欒葉片萎蔫及脫落情況最嚴(yán)重。

表1 干旱脅迫下不同欒樹無性系土壤相對(duì)含水量（%）的變化

表2 干旱脅迫對(duì)3 個(gè)欒樹無性系苗木形態(tài)特征的影響統(tǒng)計(jì)表

2.3 干旱脅迫下不同欒樹無性系苗高的變化及生長(zhǎng)率

植物高生長(zhǎng)受生長(zhǎng)環(huán)境影響，高生長(zhǎng)與其抗逆性具有相關(guān)性，一般情況下逆境脅迫增強(qiáng)，生長(zhǎng)速度隨之減慢，甚至停止。因此，高生長(zhǎng)指標(biāo)是衡量樹種生長(zhǎng)狀況的重要形態(tài)指標(biāo)之一[11]。不同欒樹無性系苗高的變化見表3，相同脅迫時(shí)間不同無性系間差異不顯著(P＞0.05)，同一無性系不同脅迫時(shí)間差異顯著(P＜0.05)。各無性系前20 d 生長(zhǎng)量變化較大，表明生長(zhǎng)相對(duì)迅速，第25 -40 d 變化不顯著，表明隨著干旱脅迫的加深，各無性系苗高增長(zhǎng)變緩，干旱脅迫極大地影響了植株生長(zhǎng)。各無性系生長(zhǎng)率分別為0.4、0.41、0.39，從高到低排序?yàn)椤半x”5 號(hào)、“滕選”4 號(hào)、北欒。

表3 干旱脅迫下不同欒樹無性系苗高的變化

2.4 干旱脅迫下不同欒樹無性系葉綠素含量的變化

SPAD-502 葉綠素儀可以直接測(cè)定葉綠素值，在不損害葉片的前提下可以較好的反映植物葉片的葉綠素濃度[12]。各無性系葉綠素含量變化如表4所示，3 個(gè)無性系葉片葉綠素含量變化趨勢(shì)表現(xiàn)出一定規(guī)律性，都呈先降低再升高再降低的趨勢(shì)，相同脅迫時(shí)間下不同無性系差異不顯著。4 號(hào)在第5 d、第20-30 d 葉綠素含量降低，其余升高；5 號(hào)在第0-15 d 降低，至第20 d 含量最高，之后降低；北欒對(duì)照0-10 d 降低，10-20 d 升高，20 d 之后降低。變化幅度上，4 號(hào)、5 號(hào)、北欒葉綠素相對(duì)含量分別為11.24、14.67、12.4，變化幅度“滕選”5 號(hào)＞北欒＞“滕選”4 號(hào)。

表4 干旱脅迫下不同欒樹無性系葉綠素含量的變化

2.5 干旱脅迫下不同欒樹無性系凈光合速率的變化

持續(xù)干旱第32 d 對(duì)各無性系凈光合速率影響見表5，結(jié)果表明，欒樹各無性系隨干旱脅迫強(qiáng)度增加凈光合速率均顯著降低，且各無性系間差異極顯著（P＜0.01），而各無性系對(duì)照凈光合速率差異不顯著，表明干旱脅迫對(duì)植物葉片造成損傷，葉片光合作用下降。4 號(hào)、5 號(hào)、北欒與CK 相比分別降低了4.14 mmoL·m-2·s-1、3.81 mmoL·m-·2s-1、5.15 mmoL·m-·2s-1，各無性系凈光合速率值分別為對(duì)照的20%、30%、4%。3 個(gè)欒樹無性系葉片凈光合速率較對(duì)照下降幅度大小依次為：北欒＞“滕選”4 號(hào)＞“滕選”5 號(hào)。

表5 干旱脅迫下不同欒樹無性系凈光合速率的變化

2.6 干旱脅迫對(duì)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸含量的影響

各無性系脯氨酸變化從表6 可以看出，相同干旱脅迫時(shí)間下，各無性系脯氨酸含量第0 d“騰選”4號(hào)同5 號(hào)、北欒之間差異不顯著，5 號(hào)同北欒差異顯著，干旱第20 d“滕選”4 號(hào)同5 號(hào)差異顯著，北欒同4 號(hào)、5 號(hào)之間差異不顯著，第35 d“滕選“4 號(hào)同北欒差異顯著，5 號(hào)同4 號(hào)、北欒之間差異均不顯著；第40 d“滕選”4 號(hào)、5 號(hào)之間差異不顯著，但與北欒差異顯著。同一無性系不同脅迫時(shí)間上，差異極顯著（P＜0.01）?！半x“4 號(hào)在前10 d 差異不顯著，第0 d、5 d、15 d 之間差異不顯著，第20-40 d 差異不顯著?！半x”5 號(hào)第0 -20 d 之間差異不顯著，第25-40 d 之間差異不顯著。北欒第0-5 d 差異不顯著，第10-25 d 差異不顯著，第30 d 同40d 差異不顯著，第35 d 同其他所有脅迫時(shí)間差異顯著。

表6 干旱脅迫下不同欒樹無性系脯氨酸含量（mg·g-1）的變化

持續(xù)干旱脅迫下，隨著土壤含水量的降低，欒樹3 個(gè)無性系的脯氨酸含量變化前35 d 總體呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，第35 d 往后北欒下降，“滕選”4 號(hào)、5號(hào)變化不明顯。“滕選”4 號(hào)前10 d 變化不大，第10 d 后迅速增加，表明4 號(hào)在前10 d 受傷害并不是很嚴(yán)重，隨著干旱脅迫的加劇，脯氨酸含量迅速升高，表明植物受到傷害逐漸加重。“滕選”5 號(hào)前20 d 增加不明顯，至第20 d 迅速增加，北欒對(duì)照從脅迫開始至第35 d 近乎直線增加，之后迅速下降，脯氨酸含量下降說明干旱對(duì)其造成的傷害突破了其自身的滲透調(diào)節(jié)能力，植物生理機(jī)能下降。

2.7 干旱脅迫對(duì)超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

各無性系SOD 含量變化由表7 可知，通過方差分析與多重比較，相同時(shí)間不同無性系間，干旱脅迫第0 d“滕選”5 號(hào)同4 號(hào)、北欒差異顯著，4 號(hào)同北欒之間差異不顯著；第10 d 北欒同4 號(hào)、5 號(hào)差異顯著，4 號(hào)、5 號(hào)差異不顯著；第15 d 5 號(hào)同4 號(hào)、北欒差異顯著，4 號(hào)同北欒差異不顯著，第20 d 北欒同4 號(hào)、5 號(hào)差異顯著，4 號(hào)、5 號(hào)之間差異不顯著，其余相同脅迫時(shí)間下各無性系間差異不顯著（P＞0.05）。同一無性系不同脅迫時(shí)間比較，差異極顯著（P＜0.01）?！半x”4 號(hào)第20 d 同第35 d 之間差異不顯著，第20 d 同第30 d 之間差異不顯著，第25 d、30 d 之間差異不顯著，第5 d、10 d、40 d 之間差異不顯著，第0-10 d、第0 d、5 d、15 d 之間差異不顯著。“滕選”5 號(hào)第0 d、5 d、15 d 之間差異不顯著，第5-15 d、第40 d 之間差異不顯著，第20 d-35 d 之間差異不顯著。北欒第0-15 d 差異不顯著，第0 d、5 d、15 d 差異不顯著，第20 d、25 d、40 d 之間差異不顯著，第35 d、第40 d 分別同其他所有脅迫時(shí)間差異顯著。

表7 干旱脅迫下各無性系SOD 含量（u·g-1）的變化

持續(xù)干旱脅迫下，隨著土壤含水量的降低，所有欒樹無性系SOD 活性呈降低-升高-降低-升高-降低趨勢(shì)。在增加幅度上，前15 d 變化不明顯，至第20 d 快速上升，至第25 d 快速上升至第35 d 峰值后下降。

2.8 干旱脅迫對(duì)丙二醛含量（MDA）的影響

各無性系MDA 含量變化由表8 可知，隨著干旱脅迫加深，相同脅迫時(shí)間不同無性系間的MDA含量差異不顯著，各無性系MDA 含量不同脅迫時(shí)間下差異顯著（P＜0.05）?！半x”4 號(hào)第0 d、5 d 之間差異不顯著，第10-25 d 之間差異不顯著，第30-40 d 之間差異不顯著；“滕選”5 號(hào)第0-25 d 之間差異不顯著，第10-30 d 之間差異不顯著，第15-35 d 之間差異不顯著，第30-40 d 之間差異不顯著；北欒第0-30 d 之間差異不顯著，第20-40 d 之間差異不顯著。

表8 干旱脅迫下各無性系MDA 含量（μ moL·g-1）的變化

在持續(xù)干旱脅迫的條件下，3 個(gè)欒樹無性系的丙二醛（ MDA）含量隨著干旱脅迫的增強(qiáng)總體呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，至40 d 脅迫末期北欒降低?！半x”4 號(hào)、5號(hào)、北欒分別上升了6.706 μmoL·g-1、6.870 μmoL·g-1、6.273 μmoL·g-1，增加幅度排序?yàn)椤半x”5 號(hào)＞“滕選”4 號(hào)＞北欒。

2.9 不同無性系欒樹無性系抗旱能力排序

試驗(yàn)研究了在干旱脅迫期間，“滕選”4 號(hào)、“滕選”5 號(hào)、北欒的5 個(gè)生理生化指標(biāo)的變化情況，不同的生理指標(biāo)在對(duì)同一種源下抗旱能力排序不盡一致。運(yùn)用隸屬函數(shù)法能能克服單個(gè)指標(biāo)的片面性，使評(píng)定結(jié)果更全面地反應(yīng)無性系的實(shí)際抗旱能力[10]。隸屬函數(shù)值及綜合評(píng)價(jià)結(jié)果見表9。

表9 干旱脅迫下各無性系隸屬函數(shù)值及綜合評(píng)價(jià)

結(jié)果表明，3 個(gè)無性系抗旱能力排序?yàn)椤半x”5號(hào)＞“滕選”4 號(hào)＞北欒，其中4 號(hào)、5 號(hào)抗旱能力比較接近。

3 討論

試驗(yàn)研究了在干旱脅迫下，“滕選”4 號(hào)、“滕選”5 號(hào)、北欒3 個(gè)欒樹無性系形態(tài)變化、生長(zhǎng)率、葉綠素含量、凈光合速率、脯氨酸、超氧化物歧化酶、丙二醛的變化情況。結(jié)果表明，隨著干旱時(shí)間的延長(zhǎng)，各無性系葉片均萎蔫下垂，從植株底部往上開始出現(xiàn)黃葉、枯葉。萎蔫嚴(yán)重程度從高到低排序?yàn)楸睓琛ⅰ半x”4 號(hào)、“滕選”5 號(hào)。隨著干旱脅迫加深，各無性系生長(zhǎng)變緩，生長(zhǎng)率排序?yàn)椤半x”5 號(hào)、“滕選”4號(hào)、北欒。

在干旱脅迫下，葉片的葉綠素發(fā)生降解而降低，抗旱性較強(qiáng)的種類葉綠素含量較高[13]。本試驗(yàn)各無性系葉片葉綠素含量總體略有降低但變化不大，表明各無性系抗旱性均較強(qiáng)，在欒樹不同無性系抗旱性比較中葉綠素含量比較差異并不明顯。

植物光合作用將CO2和水轉(zhuǎn)化為有機(jī)物，蓄積太陽能并提供氧氣，光合作用是植物適應(yīng)環(huán)境最重要的特征和物質(zhì)積累代謝的基本單元，也是植物生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)和生產(chǎn)力高低的決定性因素[14]。干旱脅迫下各無性系凈光合速率均顯著下降，表明持續(xù)干旱影響了葉片的光合能力和生理機(jī)能，“滕選”4 號(hào)、5號(hào)、北欒與CK 相比分別降低了4.14 mmoL·m-2·s-1、3.81 mmoL·m-2·s-1、5.15 mmoL·m-2·s-1，處理測(cè)定值分別為對(duì)照的20%、30%、4%。光合下降幅度結(jié)果與最終抗旱性比較結(jié)果一致，體現(xiàn)了凈光合速率與抗旱性的正相關(guān)關(guān)系。

脯氨酸是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，干旱脅迫下積累脯氨酸能夠增加植物的吸水、保水能力，維持各項(xiàng)代謝正常進(jìn)行[13]。干旱脅迫時(shí)植物會(huì)產(chǎn)生傷害植物細(xì)胞的活性氧，植物體內(nèi)具有清除活性氧的防御保護(hù)體系可以提高細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，SOD 等酶活性的高低一定程度上反映了植物的抗逆境能力[15]，SOD 升高說明植物抗旱體系通過酶的升高應(yīng)對(duì)干旱脅迫。丙二醛（MDA）反映了植物的脂膜過氧化，逆境下會(huì)大量累積[16]，MDA 值越高，說明植物傷害越嚴(yán)重。脯氨酸含量、SOD、丙二醛含量在整個(gè)干旱脅迫過程中變化較大，反映了這些指標(biāo)在干旱逆境中的敏感性。各無性系變化趨勢(shì)也有所不同，脯氨酸含量“滕選“4 號(hào)、5 號(hào)升高，北欒先升高后降低；SOD 活性均呈升高-降低-升高-降低趨勢(shì)；MDA 含量“滕選”4 號(hào)、5 號(hào)總體呈升高趨勢(shì)，北欒先升高后降低。北欒脯氨酸含量、SOD 活性在脅迫末期都降低，而“滕選”4 號(hào)、5 號(hào)僅SOD 活性降低，可能是由于北欒最先到達(dá)干旱脅迫的最大承受能力導(dǎo)致生理機(jī)能下降，“滕選”4 號(hào)、5 號(hào)葉片生理機(jī)能還未達(dá)到生理機(jī)能紊亂的最大限度，同時(shí)也說明了SOD 活性相比較MDA、脯氨酸對(duì)干旱帶來的損傷反應(yīng)更加迅速。

本試驗(yàn)干旱脅迫時(shí)間為40 d，從第15 d 重度干旱至脅迫結(jié)束所有植株皆未死亡，體現(xiàn)了各無性系抗旱能力。各無性系抗旱水平受多種因素共同影響，單一指標(biāo)無法準(zhǔn)確判斷抗旱性，本文以脅迫末期第40 d 數(shù)值比較，運(yùn)用隸屬函數(shù)法判斷植物的抗旱性差異，各無性系抗旱能力排序?yàn)椤?滕選”5 號(hào)＞“滕選”4 號(hào)＞北欒，其中4 號(hào)、5 號(hào)抗旱能力比較接近，此結(jié)果與外部形態(tài)觀測(cè)、生長(zhǎng)率排序一致。在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，可對(duì)各個(gè)不同干旱脅迫階段抗旱指標(biāo)抗旱性綜合評(píng)定，以提高抗旱性鑒定的全面性以及實(shí)用性。

本試驗(yàn)確定干旱脅迫強(qiáng)度是通過盆栽控水實(shí)現(xiàn)的，在整個(gè)試驗(yàn)過程中，脯氨酸、SOD、MDA 等生理指標(biāo)并非呈現(xiàn)持續(xù)性地增高或降低，而是出現(xiàn)上下波動(dòng)，其原因一方面與不同取樣植株存在單株差異性導(dǎo)致數(shù)值波動(dòng)有關(guān)，另一方面，與試驗(yàn)期間降水較多，導(dǎo)致空氣濕度變化增大緩解了植物干旱脅迫程度有關(guān)。如需更精確的抗旱比較，可從延長(zhǎng)脅迫時(shí)間、復(fù)水恢復(fù)性、植株根系等方面加強(qiáng)研究。