全夫，劉艷，余玲

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院眼科，四川 瀘州 646000； 2.西南醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州 646000)

青光眼是一種病理性眼內(nèi)壓升高導(dǎo)致特征性視神經(jīng)損害和視野缺損的疾病，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈持續(xù)升高趨勢(shì)[1]。目前，通過(guò)在球結(jié)膜下建立功能性濾過(guò)通道來(lái)控制眼壓的青光眼濾過(guò)手術(shù)(glaucoma filtration surgery，GFS)仍是治療青光眼的有效方法，但失敗率約為20%，導(dǎo)致手術(shù)失敗的主要原因是在手術(shù)區(qū)域內(nèi)成纖維細(xì)胞的增殖致濾過(guò)通道的瘢痕形成，濾過(guò)通道功能減弱，從而導(dǎo)致眼壓再次升高[2-4]。

泛素特異性蛋白酶15(ubiquitin-specific proteases 15,USP15)的基因位于染色體帶12q14處，由952個(gè)氨基酸組成，分子量為109 200，屬于泛素特異性加工酶家族的一員[5-6]。研究表明，對(duì)小鼠進(jìn)行USP15基因敲除，小鼠表現(xiàn)為切口愈合延遲，瘢痕化進(jìn)展減慢[7]。在瘢痕纖維化過(guò)程中，USP15可維持轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)途徑的活性[8]，USP15可被介導(dǎo)與Smad泛素化因子2形成復(fù)合物，作用于TGF-β受體(transforming growth factor-β receptor，Tβ-R)并去泛素化Tβ-RⅠ，穩(wěn)定Tβ-RⅠ，從而增強(qiáng)TGF-β信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)纖維化過(guò)程[9]。王洋等[10]發(fā)現(xiàn)USP15與TGF-β信號(hào)通路作用相關(guān)，而TGF-β信號(hào)通路已被證明與瘢痕的形成密切相關(guān)。目前，USP15在瘢痕組織中表達(dá)的研究較少見(jiàn)。

從肉芽腫到瘢痕增生的形成過(guò)程中，肌成纖維細(xì)胞是組織瘢痕化的關(guān)鍵細(xì)胞，而肌成纖維細(xì)胞的主要組成成分為α-平滑肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，即α-SMA表達(dá)水平越高，組織瘢痕化程度越嚴(yán)重[11-12]。本研究旨在通過(guò)檢測(cè)GFS術(shù)后瘢痕組織中USP15和α-SMA的表達(dá)并分析兩者的關(guān)系，為研究如何抑制GFS術(shù)后濾過(guò)通道的瘢痕化提供新思路。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 20只健康成年新西蘭大白兔，清潔級(jí)別，不分雌雄，體重1.65～1.75 kg，由西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[使用許可證：SYXK(川)2018-065]，室溫約26 ℃，實(shí)驗(yàn)前將凈水和人工飼料混合并飼養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)遵守視覺(jué)與眼科學(xué)研究協(xié)會(huì)有關(guān)動(dòng)物在眼科及視力方面研究的規(guī)定。

1.2主要儀器及試劑 光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；眼科顯微手術(shù)器械(中國(guó)蘇州醫(yī)療器械有限公司)；Tono-pen眼壓計(jì)(美國(guó)Reichert公司)；USP15抗體(英國(guó)Abcam公司)；α-SMA抗體(英國(guó)Abcam公司)；免疫組織化學(xué)試劑盒(江蘇江萊生物科技有限公司)。

1.3方法 采用自身雙眼對(duì)照設(shè)計(jì)研究，以右眼為實(shí)驗(yàn)組(20只)，建立GFS的動(dòng)物模型，左眼作為正常對(duì)照組(10只)。隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)組分為術(shù)后14 d組(10只)、術(shù)后28 d組(10只)。對(duì)家兔行苯巴比妥鈉1 mL/kg耳緣靜脈注射麻醉，術(shù)前局部用鹽酸丙卡因滴眼液表面麻醉。右眼常規(guī)消毒、鋪巾，沿角膜緣用鈍頭的Westcott剪刀切開(kāi)并直接切開(kāi)結(jié)膜和腱膜。用30°彎刀制造3 mm×4 mm的鞏膜瓣(1/2鞏膜厚度)，無(wú)齒鑷提起半厚的鞏膜瓣，直到觀察到小梁，眼科剪剪除Schlemm管和小梁網(wǎng)在內(nèi)的矩形角鞏膜以及部分外周虹膜根部，放下鞏膜瓣將鞏膜瓣兩端各縫1針，球結(jié)膜用10-0尼龍針縫合2針。術(shù)后使用左氧氟沙星滴眼液預(yù)防感染。同一人使用Tono-pen眼壓計(jì)于同一日上午9：00～11：00測(cè)量家兔眼壓，同眼連續(xù)測(cè)量3次，取平均值。術(shù)前測(cè)量實(shí)驗(yàn)組和正常對(duì)照組眼壓，術(shù)后測(cè)量14 d組和28 d組眼壓。實(shí)驗(yàn)組分別在術(shù)后14 d和28 d觀察角膜、前房、濾過(guò)泡及瘢痕組織的外觀，并在術(shù)后14 d及術(shù)后28 d瘢痕組織上分別進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)、Masson和免疫組織化學(xué)染色，分析實(shí)驗(yàn)組瘢痕組織和正常對(duì)照組結(jié)膜組織中USP15和α-SMA的表達(dá)。

1.4結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 采用Sinicrope等[13]的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)每個(gè)視野的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和染色深度進(jìn)行評(píng)分，總分為染色強(qiáng)度得分和陽(yáng)性染色細(xì)胞百分比得分的乘積。染色強(qiáng)度確定標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)色或淺黃色與背景一致為0分；淺棕黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。其中0分表示陰性，1～4分為弱陽(yáng)性，5～8分為陽(yáng)性，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性。陽(yáng)性染色細(xì)胞的百分比標(biāo)準(zhǔn)：每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選擇3個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，并計(jì)算3個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞的平均數(shù)量，其中<10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。

2 結(jié) 果

2.1造模結(jié)果

2.1.1眼壓結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組基線眼壓為(15.00±0.67) mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，正常對(duì)照組為(14.90±0.74) mmHg，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.857，P=0.379)。正常對(duì)照組、術(shù)后14 d組、術(shù)后28 d組眼壓比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，術(shù)后14 d組眼壓低于正常對(duì)照組(P<0.05)，術(shù)后28 d組與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，術(shù)后28 d組高于術(shù)后14 d組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 正常對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組眼壓比較

2.1.2HE染色結(jié)果 正常結(jié)膜組織HE染色示結(jié)膜組織形態(tài)完整，組織排列較整齊；術(shù)后14 d結(jié)膜組織HE染色示結(jié)膜下炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維組織形成，組織排列紊亂，濾過(guò)道受到牽拉、變窄；術(shù)后28 d結(jié)膜組織HE染色示結(jié)膜下大量纖維組織收縮，濾過(guò)道消失。見(jiàn)圖1。

1a：正常結(jié)膜組織；1b：術(shù)后14 d結(jié)膜組織；1c：術(shù)后28 d結(jié)膜組織；箭頭表示該處染色的變化

2.1.3Masson染色結(jié)果 正常結(jié)膜組織Masson染色示結(jié)膜下組織極少量膠原沉積；術(shù)后14 d結(jié)膜組織Masson染色示結(jié)膜下及濾過(guò)道少量膠原沉積；術(shù)后28 d結(jié)膜組織Masson染色示結(jié)膜下及濾過(guò)道大量膠原沉積。見(jiàn)圖2。

2a：正常結(jié)膜組織；2b：術(shù)后14 d結(jié)膜組織；2c：術(shù)后28 d結(jié)膜組織；箭頭表示該處染色的變化

2.2瘢痕組織USP15及α-SMA的表達(dá)水平

2.2.1USP15的表達(dá) 正常結(jié)膜組織中，USP15為陰性或弱陽(yáng)性表達(dá)，極少量表達(dá)于結(jié)膜上皮層和基質(zhì)層胞質(zhì)及胞核；術(shù)后14 d瘢痕組織中，USP15少量表達(dá)于結(jié)膜上皮層及基質(zhì)層成纖維細(xì)胞質(zhì)及胞核；術(shù)后28 d瘢痕組織中，USP15大量表達(dá)于結(jié)膜上皮全層及成纖維細(xì)胞質(zhì)及胞核，見(jiàn)圖3。各組USP15表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，術(shù)后14 d組、術(shù)后28 d組高于正常對(duì)照組，術(shù)后28 d組高于術(shù)后14 d組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 正常對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組瘢痕組織中USP15表達(dá)水平的比較

3a：正常結(jié)膜組織中USP15弱陽(yáng)性表達(dá)；3b：術(shù)后14 d結(jié)膜瘢痕組織中USP15陽(yáng)性表達(dá)；3c：術(shù)后28 d結(jié)膜瘢痕組織中USP15強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；箭頭表示該處USP15陽(yáng)性表達(dá)

2.2.2α-SMA的表達(dá) 各組α-SMA表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，術(shù)后14 d組、術(shù)后28 d組高于正常對(duì)照組，術(shù)后28 d組高于術(shù)后14 d組(P<0.05)，見(jiàn)表3。正常結(jié)膜組織中，α-SMA為陰性或弱陽(yáng)性表達(dá)，極少量表達(dá)于結(jié)膜上皮層和基質(zhì)層胞質(zhì)及胞核；術(shù)后14 d結(jié)膜組織中，α-SMA少量表達(dá)于結(jié)膜上皮層及基質(zhì)層成纖維細(xì)胞質(zhì)及胞核；術(shù)后28 d結(jié)膜組織中，α-SMA大量表達(dá)于結(jié)膜上皮全層及成纖維細(xì)胞質(zhì)及胞核，見(jiàn)圖4。

表3 正常對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組瘢痕組織α-SMA表達(dá)水平比較

4a：正常結(jié)膜組織中α-SMA弱陽(yáng)性表達(dá)；4b：術(shù)后14 d結(jié)膜瘢痕組織中α-SMA陽(yáng)性表達(dá)；4c：術(shù)后28 d結(jié)膜瘢痕組織中α-SMA強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；箭頭表示該處α-SMA陽(yáng)性表達(dá)

2.3瘢痕組織中USP15與α-SMA表達(dá)的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，正常結(jié)膜組織中USP15與α-SMA表達(dá)無(wú)相關(guān)性(r=0.063，P=0.297)；術(shù)后14 d瘢痕組織中USP15與α-SMA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.865，P<0.001)；術(shù)后28 d瘢痕組織中USP15與α-SMA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.976，P<0.001)。

3 討 論

青光眼是一種致盲性眼病，可對(duì)視神經(jīng)及視野造成不可逆的損害。GFS已成為青光眼治療的標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)方法，但術(shù)后濾過(guò)道的瘢痕形成是手術(shù)失敗的最常見(jiàn)原因[14]。目前關(guān)于GFS術(shù)后瘢痕形成機(jī)制的研究較多。USP15廣泛分布于人體的各個(gè)組織器官，其作為去泛素化酶的成員，可參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的去除過(guò)程，同時(shí)在調(diào)節(jié)DNA轉(zhuǎn)錄與修復(fù)、細(xì)胞生長(zhǎng)與凋亡、免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用。有研究表明，TGF-β信號(hào)通路可通過(guò)調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號(hào)而上調(diào)USP15信號(hào)，從而穩(wěn)定p53并抑制腫瘤惡化[15-16]。故腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展可能是由于USP15的高表達(dá)引起TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程失調(diào)所致。以上研究結(jié)果顯示，USP15與TGF-β信號(hào)通路可能具有相互調(diào)節(jié)的作用。

在增生性瘢痕形成過(guò)程中，TGF-β信號(hào)通路主要通過(guò)TGF-β/Smad發(fā)揮生物學(xué)調(diào)控作用，而Tβ-R又是TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵受體，其異常表達(dá)與瘢痕的形成密切相關(guān)。TGF-β通過(guò)膜受體Tβ-RⅠ和Tβ-RⅡ活化前體物質(zhì)后與Tβ-RⅡ結(jié)合形成Tβ-RⅡ復(fù)合物，并迅速引起Tβ-RⅠ磷酸化，激活靶基因的轉(zhuǎn)錄[17]。Smad7蛋白可通過(guò)與Smad3競(jìng)爭(zhēng)Tβ-RⅠ而阻止受體介導(dǎo)的Smad3活化，阻斷TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而負(fù)反饋調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號(hào)通路[18]。研究顯示，Smad7還可介導(dǎo)USP15去泛素化并穩(wěn)定Tβ-RⅠ增強(qiáng)TGF-β信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，該過(guò)程由Smad7介導(dǎo)USP15與Smad泛素化調(diào)節(jié)因子2形成復(fù)合體，使USP15作用于Tβ-RⅠ并使其去泛素化，從而在穩(wěn)定Tβ-RⅠ的同時(shí)增強(qiáng)TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[9，19]。也有研究發(fā)現(xiàn)，USP15可被腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子4通過(guò)拮抗Smad泛素化調(diào)節(jié)因子2促進(jìn)其與Tβ-R作用，使Tβ-RⅠ去泛素化并穩(wěn)定，從而增強(qiáng) TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[20]。

本研究對(duì)家兔進(jìn)行術(shù)前、術(shù)后眼壓測(cè)量，結(jié)果顯示術(shù)后14 d、28 d眼壓逐漸升高，組織瘢痕增生逐漸增加，與既往研究結(jié)果一致[21]，說(shuō)明兔眼GFS術(shù)后模型成功建立。同時(shí)，本研究結(jié)果還顯示，USP15在GFS術(shù)后14 d、28 d結(jié)膜瘢痕組織中異常高表達(dá)，并且與α-SMA表達(dá)呈正相關(guān)，驗(yàn)證了USP15在瘢痕組織中的高表達(dá)同樣可能使TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程失調(diào)，促進(jìn)組織瘢痕增生[15-16]。而USP15是否協(xié)同Smad7及其他相關(guān)因子調(diào)節(jié)TGF-β信號(hào)通路在瘢痕組織形成過(guò)程中的作用可能是下一步研究USP15調(diào)控TGF-β信號(hào)通路具體機(jī)制的方向。

綜上所述，USP15在瘢痕組織中異常高表達(dá)，且與α-SMA相關(guān)，提示USP15可能在GFS術(shù)后的濾過(guò)道瘢痕形成過(guò)程中發(fā)揮作用，可為GFS術(shù)后瘢痕的發(fā)病機(jī)制和治療提供新的研究目標(biāo)和思路。