王曉華 胡金鈺
海陽(yáng)市人民醫(yī)院神經(jīng)外科,山東 265100
神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤是大腦和脊髓質(zhì)細(xì)胞癌變導(dǎo)致原發(fā)性顱腦惡性腫瘤[1],具有進(jìn)展快、高復(fù)發(fā)率、高病死率、預(yù)后差等特點(diǎn)[2]。神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的惡性腦瘤之一,約占惡性腦瘤的55%左右[3]。神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生是一個(gè)多基因、多環(huán)節(jié)異常改變的綜合進(jìn)展過(guò)程,分子機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜,致使臨床上治療和預(yù)后改善效果甚微。目前臨床主要采用膠質(zhì)瘤全切術(shù)配合放化療治療神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤,但總體治療效果仍不甚理想[4]。因此,探究其發(fā)病機(jī)制,可為臨床更好的治療提供幫助。miRNA與癌癥的發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程有關(guān)。有關(guān)研究顯示,miR-206在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中低表達(dá),通過(guò)靶向調(diào)控BCL-2表達(dá)影響膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)展[5]。細(xì)胞周期依賴性激酶4(cyclin-dependent kinase 4,CDK4)參與細(xì)胞周期調(diào)控,與乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲性生長(zhǎng)密切相關(guān)[6]。研究表明CDK4在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中高表達(dá),與腫瘤細(xì)胞增殖有關(guān),抑制CDK4表達(dá)可靶向治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[7]。但miR-206與CDK4在神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系尚不清楚。本研究旨在探究miR-206與CDK4在神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及與神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。
1.1 一般資料 選擇2014年8月至2015年10月在本院就診的神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者74例為研究對(duì)象,入院時(shí)統(tǒng)計(jì)患者臨床病理資料?;颊咧心?0例,女34例;年齡范圍15~58歲,<50歲者39例,≥50歲者35例;腫瘤大小≤3 cm者32例,>3 cm者42例;WHO分級(jí)中Ⅰ~Ⅱ級(jí)36例,Ⅲ~Ⅳ級(jí)38例;核分裂≤2者29例,>2者45例。(1)納入標(biāo)準(zhǔn):①所有患者均符合《中國(guó)腦膠質(zhì)瘤分子診療指南》(2014)診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]且經(jīng)術(shù)后病理學(xué)確診為神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者;②患者均為原發(fā)膠質(zhì)瘤且首次行膠質(zhì)瘤全切術(shù);③經(jīng)溝通后獲得患者及家屬同意獲取組織,并簽署知情同意書(shū)。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①患者膠質(zhì)瘤全切術(shù)后復(fù)發(fā),再次手術(shù)者;②合并其他惡性腫瘤、全身系統(tǒng)性疾病及免疫性疾病者;③依從性差無(wú)法配合完成治療者;④非正常死亡患者。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)。
1.2 方法
1.2.1 標(biāo)本采集及與預(yù)處理 患者行膠質(zhì)瘤全切術(shù)中取膠質(zhì)瘤組織及瘤周組織(>3 cm),以生理鹽水洗凈,一部分放于液氮中速凍5 min后置于-80℃冰箱用于提取總RNA,另一部分備用。
1.2.2 膠質(zhì)瘤組織及瘤周組織中miR-206和CDK4 mRNA表達(dá)水平分析 取出凍存標(biāo)本,冰上解凍,按照Trizol試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司生產(chǎn))說(shuō)明書(shū)提取組織總RNA,經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)后確保RNA純度且無(wú)降解,取2μg以miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司生產(chǎn))反轉(zhuǎn)錄為cDNA。熒光定量PCR反應(yīng)體系參照SYBR Green PCR master mix試劑(TaKaRa公司生產(chǎn))說(shuō)明加配反應(yīng)體系,每個(gè)樣品設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。反應(yīng)體系:2×Master mix 8μl、cDNA 1μl、20×SYBRI 1μl、PCR forward primer 0.5μl、PCR reverse primer 0.5μl、加無(wú)RNase H2O至總體積為20μl。體系加配完成后,放入Bio-Rad熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)程序設(shè)置:97℃預(yù)熱3 min,95℃變性45 s,63℃退火30 s,共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后收集數(shù)據(jù)。miR-206以U6為內(nèi)參基因,CDK4以β-actin為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt算法計(jì)算miR-206和CDK4 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。引物由北京六合華大基因公司合成,引物序列見(jiàn)表1。
1.2.3 組織CDK4蛋白表達(dá)檢測(cè) 以10%中性緩沖甲醛固定膠質(zhì)瘤組織及瘤周組織,完成固定后行石蠟包埋切片HE染色,中性樹(shù)脂進(jìn)行封片,置于顯微鏡下進(jìn)行觀察。觀察時(shí)隨機(jī)取10個(gè)高倍鏡視野進(jìn)行病理切片觀察,并對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。CDK4陽(yáng)性大多數(shù)位于細(xì)胞核中,均以棕黃色顆粒特異性分布于細(xì)胞核者視為陽(yáng)性細(xì)胞。由2名主治病理醫(yī)生分別獨(dú)立執(zhí)行,采用雙盲法閱片。按照陽(yáng)性細(xì)胞百分比記分:<5%0分,5%~20%1分,21%~50%2分,51%~75%3分,>75%4分;按照染色程度:無(wú)色0分,淡黃色1分,棕黃色2分,褐黃色3分。取兩組積分乘積,≤2分為陰性,>2分為陽(yáng)性。
1.2.4 生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-206和CDK4的關(guān)系 關(guān)于miR-206與CDK4之間的關(guān)系主要采用生物信息學(xué)網(wǎng)站(http://www.microrna.org)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。
表1 qRT-PCR引物序列
1.3 隨訪 以復(fù)診或電話等方式對(duì)神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)后生存情況進(jìn)行隨訪,記錄患者從手術(shù)治療到腫瘤進(jìn)展引起死亡的患者例數(shù)計(jì)算無(wú)進(jìn)展生存率(progressive-free survival,PFS)。隨訪時(shí)間為期36個(gè)月,自手術(shù)當(dāng)天始,截止至2018年11月1日。所有患者均完成隨訪,無(wú)一例患者失訪。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 17.0對(duì)本研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)數(shù)資料以例(%)表示,比較行χ2檢驗(yàn);正態(tài)分布的計(jì)量資料以(±s)表示,比較行配對(duì)t檢驗(yàn);Kaplan-Meier分析神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)后3年生存情況。COX回歸模型分析影響神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素;Pearson相關(guān)性分析法分析神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤組織中miR-206和CDK4 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性,各組數(shù)據(jù)均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 膠質(zhì)瘤組織和瘤周組織miR-206和CDK4 mRNA表達(dá)分析 神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者膠質(zhì)瘤組織中miR-206表達(dá)水平顯著低于瘤周組織(P>0.05),CDK4 mRNA表達(dá)水平顯著高于瘤周組織(P>0.05),詳見(jiàn)表2。
表2 74例神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者膠質(zhì)瘤組織和瘤周組織miR-206和CDK4 mRNA表達(dá)分析(±s)
表2 74例神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者膠質(zhì)瘤組織和瘤周組織miR-206和CDK4 mRNA表達(dá)分析(±s)
注:miR-206為微小RNA-206,CDK4為細(xì)胞周期依賴性激酶4,U6與β-actin均為內(nèi)參基因
組織類型瘤周組織膠質(zhì)瘤組織t值P值miR-206/U6 1.02±0.17 0.68±0.14 12.764<0.001 CDK4/β-actin 1.01±0.18 1.48±0.27 12.205<0.001
2.2 神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤CDK4蛋白表達(dá)分析 免疫組化結(jié)果顯示CDK4蛋白位于細(xì)胞核中,染色呈淺黃色、棕黃色,見(jiàn)圖1。神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織CDK4蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于瘤周組織[66.22%(49/74)比22.97%(17/74)](χ2=28.003,P<0.001)。
2.3 miR-206、CDK4表達(dá)水平與神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征關(guān)系 根據(jù)膠質(zhì)瘤組織中miR-206表達(dá)水平將患者分為miR-206高表達(dá)組和miR-206低表達(dá)組,根據(jù)免疫組化結(jié)果將患者分為CDK4陽(yáng)性表達(dá)組和CDK4陰性表達(dá)組。結(jié)果顯示miR-206、CDK4表達(dá)水平與神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者腫瘤長(zhǎng)徑、病理分級(jí)、腫瘤組織壞死有關(guān)(均P<0.05),與患者性別、年齡無(wú)關(guān)(均P>0.05),見(jiàn)表3。
2.4 miR-206、CDK4表達(dá)水平與神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系 對(duì)74例神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行為期36個(gè)月的隨訪,Kaplan-Meier法分析顯示,miR-206高表達(dá)患者的PFS中位時(shí)間28.12個(gè)月、無(wú)進(jìn)展生存率45.95%,顯著高于miR-206低表達(dá)患者的PFS中位時(shí)間16.69個(gè)月、無(wú)進(jìn)展生存率32.35%;CDK4陽(yáng)性表達(dá)患者的PFS中位時(shí)間16.32個(gè)月、無(wú)進(jìn)展生存率35.71%,顯著低于CDK4陰性表達(dá)患者的PFS中位時(shí)間27.38個(gè)月、無(wú)進(jìn)展生存率45.72%,詳見(jiàn)圖2。
2.5 影響神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析COX單因素分析顯示miR-206表達(dá)水平、CDK4表達(dá)水平、腫瘤長(zhǎng)徑、WHO分級(jí)、腫瘤組織壞死是影響神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素,多因素分析結(jié)果顯示miR-206表達(dá)水平、CDK4表達(dá)水平是影響神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,詳見(jiàn)表4。
2.6 神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤組織中miR-206、CDK4表達(dá)的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示miR-206和CDK4表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.642,P<0.001),詳見(jiàn)圖3A。生物信息學(xué)分析顯示CDK4與miR-206具有靶向關(guān)系,詳見(jiàn)圖3B。
表3 74例神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者miR-206、CDK4表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]
圖1 細(xì)胞周期依賴性激酶4(CDK4)在神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者組織中的表達(dá)分析(HE染色 ×400);1A:陰性表達(dá),1B:陽(yáng)性表達(dá) 圖2 74例神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者微小RNA-206(miR-206)(2A)和細(xì)胞周期依賴性激酶4(CDK4)(2B)表達(dá)水平與無(wú)進(jìn)展生存率的關(guān)系 圖3 74例神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者組織中微小RNA-206(miR-206)、細(xì)胞周期依賴性激酶4(CDK4)表達(dá)結(jié)果;3A:相關(guān)性分析,3B:生物信息學(xué)分析
神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見(jiàn)、最具侵襲性、致命性顱內(nèi)腫瘤[2]。生活方式改變和工作壓力增加,使神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤發(fā)病率逐年升高。但神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。研究表明,長(zhǎng)期吸煙、酗酒、熬夜、環(huán)境污染、病毒感染、遺傳等多種因素與神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤發(fā)生有關(guān),目前尚未有研究表明某個(gè)因素與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者發(fā)病有直接因果關(guān)系[9]。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科技的快速發(fā)展,如手術(shù)切除治療、放射療法、化學(xué)療法及綜合療法等應(yīng)用于神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤治療,但復(fù)雜的發(fā)病原因?qū)е律窠?jīng)腦膠質(zhì)瘤患者治療后總體預(yù)后較差[10]。因此,深入研究神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,對(duì)神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者病程監(jiān)測(cè)及預(yù)后判斷有重要意義。
惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與多種基因表達(dá)異常有關(guān),miRNAs是一類特殊的非編碼小分子RNA,通過(guò)與靶基因3’UTR區(qū)域發(fā)生特異性結(jié)合,調(diào)控靶基因的表達(dá),參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及遷移過(guò)程[11]。已有研究表明miRNAs在神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。miR-200c在膠質(zhì)瘤組織中低表達(dá),抑制膠質(zhì)瘤組織的生長(zhǎng)和癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[12],提示miRNA主要通過(guò)影響腫瘤組織的生長(zhǎng),參與膠質(zhì)瘤的發(fā)展進(jìn)程。miR-206是一種保守非編碼RNA小分子,與多種腫瘤發(fā)展進(jìn)程密切相 關(guān)[13]。有 關(guān) 研 究 表 明,miR-206在神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)下調(diào),其可通過(guò)直接靶向抑制卷曲蛋 白7(FZD7)mRNA WNT/β-catenin途徑,從而在神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤中發(fā)揮腫瘤抑制作用,miR-206有可能是治療神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤的潛在靶標(biāo)[14]。此外,Hao等[5]研究發(fā)現(xiàn)miR-206在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中表達(dá)下調(diào),與腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲有關(guān)。本研究結(jié)果顯示miR-206在神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平顯著低于瘤周組織,與Zhou等[14]研究趨勢(shì)一致,表明miR-206表達(dá)水平 可能與神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤發(fā)生有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-206表達(dá)水平與神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者腫瘤長(zhǎng)徑、病理分級(jí)、腫瘤組織壞死有關(guān),提示miR-206可能參與調(diào)控癌細(xì)胞增殖,影響患者腫瘤大小和病理分級(jí)。Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示miR-206低表達(dá)患者術(shù)后3年的無(wú)進(jìn)展生存率顯著低于miR-206高表達(dá)患者,提示miR-206可能通過(guò)影響腫瘤大小、病理分級(jí)、核分裂程度,間接影響患者的預(yù)后。COX分析結(jié)果顯示miR-206表達(dá)水平是影響神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。以上研究結(jié)果提示miR-206低表達(dá)可能參與神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生過(guò)程,可能通過(guò)影響神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者的發(fā)病進(jìn)程,影響患者預(yù)后。
表4 COX回歸模型分析影響74例神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素
CDK4是一種細(xì)胞周期重要調(diào)控分子,能與細(xì)胞周期素D結(jié)合,促進(jìn)細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換,它的活性與結(jié)合周期素依賴性激酶抑制素還是與周期素結(jié)合有關(guān)[15]。研究表明CDK4主要調(diào)控癌細(xì)胞G1期向S期轉(zhuǎn)換過(guò)程[16],提示CDK4表達(dá)可能與惡性腫瘤的進(jìn)展有關(guān)。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中CDK4高表達(dá),參與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病程進(jìn)展,抑制CDK4表達(dá)可改善患者病情發(fā)展[7],提示CDK4可能調(diào)控病程發(fā)展,影響患者治療效果。本研究結(jié)果顯示CDK4在神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤組織中mRNA表達(dá)水平顯著高于瘤周組織,與Xu和Li[7]研究結(jié)果類似,表明CDK4可能參與神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤發(fā)病過(guò)程。免疫組化結(jié)果顯示神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤組織中CDK4蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于瘤周組織,表明CDK4在神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤組織中的mRNA與蛋白表達(dá)水平存在一致性。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),CDK4蛋白表達(dá)與腫瘤大小、病理分級(jí)、核分裂有關(guān),CDK4高表達(dá)患者術(shù)后無(wú)進(jìn)展生存率顯著低于低表達(dá)者,提示CDK4高表達(dá)可能促進(jìn)腫瘤增殖,導(dǎo)致不良預(yù)后。COX分析顯示CDK4表達(dá)水平是神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素,提示檢測(cè)CDK4表達(dá)水平對(duì)神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后判斷有一定意義。過(guò)往研究發(fā)現(xiàn),miRNAs主要通過(guò)調(diào)控靶基因表達(dá)參與癌癥發(fā)展,Georgantas等[17]研究表明miR-206通過(guò)靶向調(diào)控CDK4表達(dá)誘導(dǎo)黑色素瘤G1期停滯。凌晨等[15]學(xué)者通過(guò)探討miR-206/CDK4信號(hào)在卵巢癌生長(zhǎng)和化療增敏中的作用顯示,通過(guò)采用miR-206 mimics轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞,CDK4表達(dá)呈現(xiàn)明顯抑制的情況,而在使用miR-206特異抑制劑后能明顯恢復(fù)CDK4在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá),另外熒光素酶報(bào)告基因活性分析顯示,miR-206能特異結(jié)合到CDK4 3’UTR,抑制熒光素酶活性,因此其認(rèn)為miR-206通過(guò)直接靶基CDK4,從而抑制細(xì)胞周期其他因子的表達(dá),降低卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。還有學(xué)者實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染miR-206前列腺癌細(xì)胞中CDK4和細(xì)胞周期素G相關(guān)蛋白激酶(GAK)的表達(dá)水平顯著降低,因此其認(rèn)為miR-206可干擾兩者的表達(dá)[18]。而本研究結(jié)果顯示miR-206與CDK4 mRNA水平呈負(fù)相關(guān),且生物信息學(xué)分析顯示miR-206可靶向結(jié)合CDK4,提示miR-206可能通過(guò)靶向結(jié)合CDK4,進(jìn)而參與神經(jīng)腦細(xì)胞瘤發(fā)病進(jìn)程,影響患者預(yù)后。
綜上所述,miR-206在神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)下調(diào),CDK4表達(dá)上調(diào),miR-206可能通過(guò)負(fù)向調(diào)控CDK4表達(dá)參與神經(jīng)腦膠質(zhì)瘤發(fā)病進(jìn)程,影響患者預(yù)后。本研究樣本量較少,可能存在一定實(shí)驗(yàn)誤差;此外,miR-206對(duì)CDK4調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
利益沖突:作者已申明文章無(wú)相關(guān)利益沖突。
國(guó)際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報(bào)2021年10期