圖雅，田金鳳，孫卓然，尚遠(yuǎn)宏*

1. 呼和浩特市疾病預(yù)防控制中心（呼和浩特 010070）；2. 攀枝花學(xué)院醫(yī)學(xué)院（攀枝花 617000）

四環(huán)素類抗生素是20世紀(jì)40年代發(fā)現(xiàn)的一類廣譜抗生素，由于其對支原體、衣原體、革蘭氏陰性需氧菌和厭氧菌等有抗菌作用，常用于預(yù)防和治療禽類疾病[1-4]。由于家禽養(yǎng)殖人員的濫用抗生素，造成家禽肉、蛋產(chǎn)品中的藥物殘留，直接危害人體健康[5-7]。禽類養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中使用最廣泛、風(fēng)險較高的四環(huán)素類藥物主要為土霉素（OTC）和強(qiáng)力霉素（DC）[8]。GB 31650—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》規(guī)定，土霉素、強(qiáng)力霉素在所有食品動物肌肉中每種最大殘留不得超過200 μg/kg，禽類蛋中不得超過400 μg/kg[9]。測定四環(huán)素類抗生素殘留量的方法主要有液相色譜法[10-11]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-15]。運(yùn)用QuEChERS法結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對雞蛋、雞肉等動物源性食品基質(zhì)中土霉素、強(qiáng)力霉素殘留量進(jìn)行測定，該方法準(zhǔn)確可靠，回收率和重現(xiàn)性好，操作較簡易，可滿足日常檢測的需要。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

Agilent 6460A超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）；千分之一電子天平（精度為0.001 g，上海越平公司）；超純水器（美國Millipore公司）；離心機(jī)（Sigma公司）；渦旋混合器（LMS公司）；KQ-500E超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）；Discovery DSC-18凈化填料。乙腈（色譜純，F(xiàn)isher公司）；乙酸（優(yōu)級純）；乙二胺四乙酸鈉（Na2EDTA，分析純）；土霉素（CAS 6153-64-6）、強(qiáng)力霉素（CAS 564-25-0）、標(biāo)準(zhǔn)品（德國Dr. Ehrenstorfer GmbH）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別稱取0.010 g（精確到0.000 01 g）土霉素、強(qiáng)力霉素標(biāo)準(zhǔn)品，分別用甲醇溶解并定容至10 mL，質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL，于-20 ℃避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別準(zhǔn)確吸取100 μL土霉素、強(qiáng)力霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL，于-20 ℃避光保存。

1.2.2 樣品前處理

雞蛋：取適量新鮮或冷凍解凍的樣品，去殼后混合均勻。雞肉：取新鮮或冷凍解凍的樣品搗碎均勻。稱取2 g（精確至0.01 g）均質(zhì)樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈（1%乙酸酸化）-水溶液（80︰20，V/V）和0.1 g Na2EDTA，迅速振蕩1 min，渦旋振蕩提取5 min，超聲提取5 min，在9 000 r/min低溫（4 ℃）離心5 min，吸取上清液，備用。另取一支15 mL離心管，加入200 mg Discovery DSC-18吸附劑，移入5 mL上清液，振蕩1 min，以9 000 r/min離心5 min，取1 mL上清液用于上機(jī)測定。

1.2.3 儀器條件

色譜條件：色譜柱ZORBAX SB-C18（2.1 mm×100mm，1.8 μm）；流速0.2 mL/min；進(jìn)樣體積2 μL；流動相采用甲醇-0.1%甲酸水；洗脫方式采用梯度洗脫，洗脫程序：0～3.0 min，30%甲醇；3.0～5.0 min，90%甲醇；5.0～5.1 min，99%甲醇；5.1～7.0 min，99%甲醇；7.0～8.0 min，30%甲醇。

質(zhì)譜條件：離子源采用電噴霧離子源；掃描方式采用正離子掃描；檢測方式采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；干燥氣流量12 L/min；霧化器壓力40 psi；毛細(xì)管電壓3 500 V（正離子）。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理技術(shù)的優(yōu)化

2.1.1 樣品提取溶劑的選擇

酸化乙腈作為QuEChERS方法通常選用的提取溶劑，不僅有很好的提取效率，還能起到沉淀蛋白的作用。由于方法所測的土霉素、強(qiáng)力霉素有較強(qiáng)極性，需要更高極性的溶劑作為提取溶劑。因此選擇極性較大的乙腈和水的混合溶劑對目標(biāo)化合物進(jìn)行提取。比較1%乙酸酸化乙腈-水體積比分別為20︰80，50︰50和80︰20時的提取效果及對沉淀蛋白的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1%乙酸酸化乙腈-水體積比20︰80時對樣品中的蛋白質(zhì)沒有沉淀作用嚴(yán)重，影響下一步凈化；1%乙酸酸化乙腈-水體積比80︰20時有較高的提取回收率和較好的沉淀蛋白的效果。因此選擇1%乙酸酸化乙腈-水（80︰20，V/V）作為土霉素、強(qiáng)力霉素的提取溶劑。此外，四環(huán)素類抗生素在樣品溶液中容易與金屬離子形成配合物，所以需要加入Na2EDTA競爭結(jié)合金屬離子，減少四環(huán)素類藥物與金屬離子的螯合反應(yīng)，保證藥物的游離性。

2.1.2 凈化條件的選擇

QuEChERS方法使用分散固相萃取（DSPE）凈化，在凈化管中加入提取液，樣品在提取液和散裝填料之間進(jìn)行分配和吸附，從而實現(xiàn)對基質(zhì)樣品的凈化。雞蛋和雞肉等動物源性食品中含有大量脂肪、蛋白質(zhì)及部分脂溶性基質(zhì)雜質(zhì)，所以選擇能夠吸附脂肪等非極性干擾物的C18作為吸附劑進(jìn)行凈化。將土霉素、強(qiáng)力霉素直接加到空白雞肉基質(zhì)提取液中考察C18吸附劑用量對回收率的影響。隨著C18吸附劑用量增至40 mg/mL，土霉素和強(qiáng)力霉素回收率達(dá)到85%～90%，用量50 mg/mL時回收率開始下降。因此，選擇吸附劑C18用量為40 mg/mL。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

使用混合標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度1.0 μg/mL優(yōu)化其質(zhì)譜條件。以化合物進(jìn)入一級質(zhì)譜后產(chǎn)生的穩(wěn)定[M+H]+離子為母離子，進(jìn)一步優(yōu)化。在SIM模式下，對化合物的分解電壓進(jìn)行優(yōu)化，即母離子進(jìn)入二級質(zhì)譜發(fā)生斷裂或重排等產(chǎn)生不同離子碎片。在Product Ion模式下，對化合物母離子施加一定的碰撞能量（CE），得到相應(yīng)的離子碎片。在MRM模式下，優(yōu)化土霉素和強(qiáng)力霉素離子碎片的最佳碰撞能量。2種化合物的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1，土霉素、強(qiáng)力霉素的MRM色譜圖見圖1。

表1 質(zhì)譜分析參數(shù)

2.3 方法的線性關(guān)系及檢出限

向空白雞肉基質(zhì)溶液中加入系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積對應(yīng)的濃度進(jìn)行線性回歸，其線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）＞0.999。根據(jù)信噪比S/N=3和S/N=10計算檢出限（LOD）和定量限（LOQ），結(jié)果見表2。

表2 方法的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.4 方法的回收率與精密度

選取雞肉、雞蛋為樣品，在空白基質(zhì)中添加混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，在0.01，0.05和0.25 mg/kg 3個濃度水平上進(jìn)行加標(biāo)回收率及精密度試驗，按1.2.2方法處理并進(jìn)行分析，土霉素和強(qiáng)力霉素回收率的范圍為80.5%～104.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%～6.6%，方法的準(zhǔn)確度與精密度均滿足實驗要求，結(jié)果見表3。土霉素和強(qiáng)力霉素的MRM色譜圖見圖1。

表3 方法的精密度及加標(biāo)回收率實驗（n=6）

圖1 土霉素、強(qiáng)力霉素的MRM色譜圖

2.5 樣品測定

2019年實驗室采用該方法對150份雞肉、70份雞蛋樣品中的土霉素及強(qiáng)力霉素殘留量進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，雞肉中檢出強(qiáng)力霉素4份，含量范圍在8.47～89.38 μg/kg，其余樣品中均未檢出。

3 結(jié)論

采用QuEChERS法提取凈化，超高效液相色譜分離，串聯(lián)質(zhì)譜法檢測，建立雞肉、雞蛋中四環(huán)素類藥物的檢測方法。與傳統(tǒng)固相萃取法相比，該方法操作簡單、前處理耗時短，達(dá)到快速準(zhǔn)確、可靠的測定。該方法回收率、精密度、線性及靈敏度均滿足殘留檢測方法確認(rèn)的要求，可應(yīng)用禽蛋等動物源性食品中四環(huán)素類藥物殘留的定量測定。