周媛，郭勇秀，蔣林, *，李芳嬋，隨家寧，魏博偉

1. 廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院（南寧 530007）；2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院（南寧 530007）；3. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)廣西壯瑤藥工程技術(shù)研究中心（南寧 530007）

簕菜根是五加科植物白簕（Acanthopanax trifoliatus（L.）Merr.）的干燥根皮，收錄在廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（第一卷）。簕菜根味苦，辛，凉，具有清熱解毒、祛風(fēng)利濕、舒筋活血功效[1]。簕菜根在民間用于治療感冒高熱、風(fēng)濕/類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。有研究結(jié)果表明簕菜根的醇提物具有明顯的抗炎鎮(zhèn)痛作用[2-3]，現(xiàn)代藥理作用研究提示與其清熱解毒、祛風(fēng)除濕功效有良好的相關(guān)性；同時(shí)，五加屬酚酸類成分具有多種功效，如抗氧化、抗病毒、抗炎癥、抑菌等，其中抗炎作用尤為突出[4-8]。目前從簕菜根提取分離出來的成分主要有綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C等[9]酚酸類成分。研究報(bào)道，簕菜根及其同屬植物中主要有酚酸類、木質(zhì)素類、揮發(fā)油類、萜類等成分[10]。其中酚酸類成分是五加屬植物的重要特征化學(xué)標(biāo)志物。因此，從同屬之間的親緣關(guān)系及簕菜不同藥用部位分析，酚酸類是其主要化學(xué)成分之一，多數(shù)共有成分為新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、咖啡酸、原兒茶酸等，可考慮作為簕菜根藥材的特征化學(xué)標(biāo)志物。此次試驗(yàn)根據(jù)近年來對(duì)簕菜根及其同屬植物的研究，依照質(zhì)量標(biāo)志物（Q-marker）的新概念和新理論[11]，初步預(yù)測(cè)簕菜根潛在的Q-marker并測(cè)定含量，為簕菜根開發(fā)成保健食品及臨床用藥質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器與材料

1.1.1 儀器與設(shè)備

Shimadzu LC-2030 Plus高效液相色譜系統(tǒng)（日本島津公司）；色譜柱phenomenex C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；Mettler Toledo XS105DU電子分析天平；KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；密理博超純水機(jī)（廣西南寧市博美生物科技有限公司）。

1.1.2 試劑與材料

對(duì)照品綠原酸（批號(hào)110753-201817，純度≥96.8%，購自中國食品藥品檢定研究院）；異綠原酸B（批號(hào) DST190226-037，純度≥99.04%）；異綠原酸A（DST190113-036，純度≥99.5%）；異綠原酸C（DST190110-038，純度≥99.47%，購自成都德思特生物技術(shù)有限公司）。乙腈、甲醇為色譜純，其余為分析純，水為超純水。

10批簕菜根分別購自桂林、欽州、南寧、防城港、金秀、陽朔、樂山、揭陽、贛州、汕頭，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)朱意麟高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定，均為五加科植物白簕（Acanthopanax trifoliatus（L.）Merr.）的干燥根。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱Phenomenex C18（4.6 nm×250 nm×5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（C）-0.2%磷酸溶液（A），梯度洗脫（0～6 min，9.5% C；6～15 min，13% C；15～18 min，14%；18～20 min，15% C；20～30 min，18%C；30～45 min，30% C；45～50 min，35% C）；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長：325 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

1.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取適量新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C對(duì)照品，加50%甲醇溶解，分別制成質(zhì)量濃度為1.03，1.55，1.16，1.01和1.21 mg/mL的對(duì)照品溶液；另取適量上述溶液，置于同一量瓶中，加50%甲醇稀釋，制成含新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C質(zhì)量濃度分別為0.019，0.39，0.2，0.033和0.06 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，備用。

1.2.3 供試品溶液的制備

精密稱取約0.5 g簕菜根粉末，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入30 mL 50%乙醇，稱其質(zhì)量，超聲30 min，冷卻，加50%乙醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，過濾，取15 mL續(xù)濾液，揮干，用50%乙醇定容至5 mL，搖勻，過濾，取續(xù)濾液離心，取上清液，即得。

1.3 方法學(xué)考察

1.3.1 線性關(guān)系考察取混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程及線性范圍。

1.3.2 專屬性考察取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)行HPLC檢測(cè)并分析其專屬性。

1.3.3 精密度考察取混合對(duì)照溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（δRSD），檢驗(yàn)HPLC的精密度。

1.3.4 重復(fù)性考察

取供試品粉末，精密稱定，平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算5個(gè)成分的含量及δRSD，檢驗(yàn)HPLC的重復(fù)性。

1.3.5 穩(wěn)定性考察

取供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，根據(jù)新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A及異綠原酸C 5個(gè)成分峰面積，分別計(jì)算δRSD，檢驗(yàn)HPLC的穩(wěn)定性。

1.3.6 加樣回收率考察

取同一批已知含量簕菜根樣品粉末，精密稱定6份，每份約0.25 g，分別精密加入一定量的新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C對(duì)照品，制備供試品溶液，進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率及δRSD。

1.4 樣品含量測(cè)定

分別精密稱取0.5 g 10個(gè)產(chǎn)地樣品粉末，制備供試品溶液，測(cè)定峰面積。根據(jù)回歸方程計(jì)算10批樣品中5個(gè)酚酸類成分含量，擬定含量限定范圍。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察結(jié)果

2.1.1 線性關(guān)系考察結(jié)果

由表1可知，新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C分別在0.019～0.380，0.390～7.800，0.033～0.660，0.200～4.000和0.060～1.200 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

表1 新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C線性回歸方程及線性范圍

2.1.2 專屬性考察結(jié)果

由圖1可知，混合對(duì)照品溶液及簕菜根供試品溶液中5個(gè)酚酸類成分分離度良好。

圖1 混合對(duì)照品（A）和簕菜根樣品（B）的HPLC 色譜圖

2.1.3 精密度考察結(jié)果

結(jié)果顯示，新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A及異綠原酸C峰面積δRSD分別為0.05%，0.07%，0.39%，0.06%和0.75%，表明建立的HPLC精密度良好。

2.1.4 重復(fù)性考察結(jié)果

結(jié)果顯示，新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A及異綠原酸C平均含量分別為1.038，16.32，1.843，17.36和5.519 mg/g，其δRSD分別為1.10%，2.40%，2.10%，2.40%和2.40%，表明建立的HPLC重復(fù)性良好。

2.1.5 穩(wěn)定性考察結(jié)果

結(jié)果顯示，新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A及異綠原酸C峰面積δRSD分別為0.90%，0.22%，1.20%，0.39%和1.30%，表明該供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6 加樣回收率考察結(jié)果

結(jié)果顯示，新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的平均回收率分別為100%，105%，98%，103%和104%；其δRSD分別為2.32%，2.24%，1.90%，1.07%和1.43%，結(jié)果表明建立的HPLC回收率試驗(yàn)符合要求。

2.2 含量測(cè)定結(jié)果

由表2可知，10個(gè)不同產(chǎn)地簕菜根的5種酚酸類成分均有檢出，結(jié)果表明不同產(chǎn)地之間含量存在差異。綠原酸的含量變化范圍為6.567～78.88 mg/g，以廣西南寧的含量最高（78.88 mg/g），四川樂山的含量最低（6.567 mg/g）；異綠原酸A的含量變化范圍為6.289～25.56 mg/g，含量最高的是江西贛州（25.56 mg/g），最低的是廣西欽州（6.289 mg/g）；異綠原酸C的含量變化范圍為1.012～12.08 mg/g，含量最高的是四川樂山（12.08 mg/g），最低的是廣西桂林（1.012 mg/g）；異綠原酸B的含量變化范圍為1.330～4.488 mg/g，含量最高的是廣西南寧（4.488 mg/g），最低的是廣西陽（1.330 mg/g）；新綠原酸的含量變化范圍為0.682～1.409 mg/g，含量最高的是廣西金秀（1.409 mg/g），最低的是江西贛州（0.682 mg/g）。其中，廣西南寧簕菜根的綠原酸、異綠原酸B含量普遍高于廣西其他產(chǎn)地、廣東揭陽、廣東汕頭、四川樂山和江西贛州。

表2 10批次簕菜根含量測(cè)定結(jié)果 單位：mg/g

3 討論

簕菜根是廣西特色的民間常用藥，目前對(duì)食用嫩莖葉研究較多，其根尚未開展深入系統(tǒng)研究，所以其資源也未能得到有效利用。前期課題組采用高效液相色譜與Q-Exactive四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用，考察不同產(chǎn)地的簕菜根成分，借助賽默飛中藥成分高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫OTCML分析，初步推斷簕菜根中含有酚酸類成分綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C，并因產(chǎn)地不同有差異。通過測(cè)定10個(gè)產(chǎn)地簕菜根的含量，結(jié)果顯示10個(gè)產(chǎn)地的簕菜根均含有新綠原酸、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C這5種酚酸類成分。此次試驗(yàn)是結(jié)合Q-marker理論，對(duì)簕菜根藥材的主要活性成分進(jìn)行研究，根據(jù)簕菜根化學(xué)成分的特有性及有效性進(jìn)行分析，對(duì)簕菜根的Q-marker進(jìn)行預(yù)測(cè)與含量分析，建立HPLC法同時(shí)測(cè)定簕菜根壯藥材中新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的含量，從而證明簕菜根藥材選擇酚酸類成分作為質(zhì)量標(biāo)志物之一有一定的合理性與科學(xué)性。

基于單一指標(biāo)成分難以全面反映簕菜根的質(zhì)量，因此選擇多指標(biāo)成分進(jìn)行質(zhì)量分析，采用HPLC同時(shí)用于測(cè)定簕菜根中5個(gè)酚酸類成分的含量，建立簕菜根的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。該方法操作簡單、精密度高、重復(fù)性好，為合理評(píng)價(jià)簕菜根在保健食品及臨床用藥質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

此次試驗(yàn)僅對(duì)簕菜根酚酸類成分開展初步研究，簕菜根含有的木質(zhì)素類、多糖類、黃酮類及萜類等成分，也具有抗炎鎮(zhèn)痛藥理作用[12-13]，很有必要對(duì)其進(jìn)行深入研究，建立專屬的測(cè)定方法。后期，課題組將基于Q-marker理論及研究模式，對(duì)簕菜根進(jìn)行深入研究，確定簕菜根的Q-marker，建立科學(xué)可行的質(zhì)量分析和評(píng)價(jià)方法，為中藥質(zhì)量標(biāo)志物在開發(fā)保健食品中的應(yīng)用提供新的研究思路。