張巖，梁松杰，王文君*，張悅

遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū)生物工程系（珠海 519041）

土茯苓為百合科多年生草本植物光葉菝葜（Smilax glabraRoxb.）的干燥根莖，主要產(chǎn)于我國華南、中南地區(qū)。其味甘、淡、平，歸肝、胃經(jīng)，具有解毒、除濕、通利關(guān)節(jié)等功效[1]，也表現(xiàn)出一定的抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛的作用[2-4]，可用于治療銀屑病、痛風(fēng)、高尿酸血癥等疾病[5-7]。近幾年，對于土茯苓的抗氧化作用也有研究[8]，但報道不多。

酪氨酸酶是機(jī)體產(chǎn)生黑色素的關(guān)鍵限速酶，其活性降低或失去有可能引發(fā)白斑、白癜風(fēng)等[9-10]疾病，但關(guān)于土茯苓提取物對酪氨酸酶的影響作用未見報道。

因此，試驗(yàn)研究土茯苓的體外抗氧化活性與酪氨酸酶激活作用，旨在拓展土茯苓的應(yīng)用范圍，深入開發(fā)其藥用價值。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

ABTS 2, 2’-聯(lián)氨-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨鹽、DPPH（1, 1-二苯-2-苦基肼）、Levo-DOPA（L-多巴）（上海麥克林生化科技有限公司）；VC（西隴科學(xué)股份有限公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；酪氨酸酶，自提于新鮮土豆；土茯苓，購自珠海東咀濟(jì)生醫(yī)藥。

1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

UV-2600紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津）；超聲波清洗儀（上海同天生物技術(shù)股份有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Hei-VAP，德國Heidolph公司）；高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 土茯苓提取物的制備

稱取20.00 g土茯苓粗粉，加入100 mL無水乙醇過夜浸泡，在80 ℃條件下，超聲提取30 min，抽濾，重復(fù)提取1次。濾液在50 ℃條件下減壓旋蒸至黏稠浸膏。

1.3.2 土茯苓提取物抗氧化活性測定

1.3.2.1 土茯苓粗提液制備

精密稱取100.00 mg浸膏置50 mL容量瓶中，加入甲醇定容至50 mL，得到初濃度為2.0 mg/mL土茯苓溶液，在4 ℃冰箱冷凍保存。

1.3.2.2 DPPH法

DPPH試劑的制備。精密稱取3.40 mg的DPPH，用甲醇溶解并定容至100 mL，其質(zhì)量濃度為0.034 0 mg/mL，避光保存。

VC對照品溶液的制備。精密稱取48.00 mg的對照品VC，用甲醇溶解并定容至100 mL，其質(zhì)量濃度為0.480 mg/mL。

抗氧化活性測定。參考文獻(xiàn)[8]的方法，移取6組樣品溶液，各0.50 mL，置于10 mL試管中，向其中加入4 mL的DPPH試劑，振搖，室溫避光反應(yīng)30 min。在516 nm處測定吸光度A，繪制清除率曲線。樣品質(zhì)量濃度分別為2.2，6.7，11.0，16.0，20.0和24.0 mg/mL。以VC做對照。

式中：A0為未加入樣品的DPPH甲醇溶液，即空白組的吸光度；Ai為加入樣品溶液與DPPH試劑反應(yīng)后的吸光度；Aj則是樣品本身的吸光度。

1.3.2.3 ABTS法

ABTS+試劑制備。參考文獻(xiàn)[8]的方法，精密稱取96.3 mg的ABTS+和16.56 mg的K2S2O8配制成7.00 mmol/L的ABTS+水溶液和2.45 mmol/L的K2S2O8水溶液，按1︰1混合，室溫避光反應(yīng)12 h以上，即得濃度3.5mmol·L-1的ABTS+工作液。試驗(yàn)前吸取1.32 mL的工作液，用甲醇稀釋定容至50 mL，得到濃度為0.092 5 mmol/L的ABTS+試劑。

抗氧化活性測定。分別移取6組樣品溶液，各100 mL，置于10 mL試管中，再向其中加入3 mL的ABTS+試劑，振搖，在室溫條件下避光反應(yīng)30 min。試劑空白、VC做對照，在750 nm處測定吸光度A，繪制清除率曲線。樣品質(zhì)量濃度分別為8.4，9.7，11.0，12.0和14.0 mg/mL。

式中，A0為未加入樣品的ABTS+甲醇溶液，即空白組的吸光度；Ai為加入樣品溶液與ABTS+試劑反應(yīng)后的吸光度，Aj則是樣品本身的吸光度。

1.3.3 土茯苓提取物影響酪氨酸酶活性的分析

1.3.3.1 酪氨酸酶液制備

參考文獻(xiàn)[11]方法，試驗(yàn)前12 h將新鮮土豆去皮切塊，取16 g冷藏于-20 ℃冰箱保存；試驗(yàn)當(dāng)天將保存的土豆置于勻漿機(jī)中，加入100 mL的PBS（pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液）溶液，勻漿2 min；過濾，濾液在4 ℃，按4 000 r/min離心10 min，取上清液備用，即為酪氨酸酶溶液。

1.3.3.2 多巴溶液的制備

精確稱取0.078 g的多巴固體藥品，加入90 mL的PBS溶液溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容至刻度線，即得到多巴溶液以備用。

1.3.3.3 活性分析

參考文獻(xiàn)[11]，根據(jù)表1的方法，向試管中加入多巴溶液、樣品溶液和PBS溶液，混合均勻后于35 ℃進(jìn)行水浴加熱10 min，加入酪氨酸酶再水浴加熱10 min，土茯苓樣品溶液的質(zhì)量濃度分別為0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 mg/mL，在475 nm進(jìn)行吸光度A的測定，計(jì)算激活率，繪制激活率曲線。

表1 土茯苓對酪氨酸酶活性作用體系溶液配制表單位：mL

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，相對應(yīng)的各組數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，即x±s，得到圖表結(jié)果，并進(jìn)行顯著性差異計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 土茯苓提取率

得到土茯苓浸膏2.376 g，產(chǎn)率為11.88%。

2.2 土茯苓提取物抗氧化活性測定結(jié)果

2.2.1 土茯苓提取物對DPPH自由基的清除能力

從圖1可以看出，土茯苓提取物和VC對DPPH自由基的清除能力均隨質(zhì)量濃度增大而增強(qiáng)，表現(xiàn)出劑效依賴性，且具有很好線性關(guān)系，相關(guān)性在0.99以上，半數(shù)抑制率IC50值分別為（13.55±0.55）mg/mL和（3.0±0.009 5）mg/mL，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.001）。土茯苓具有較好的抗氧化能力，但稍弱于對照品VC，約為VC的1/4，見表2。6組不同質(zhì)量濃度樣品對DPPH自由基的清除能力兩兩比較，均具有顯著性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

圖1 土茯苓提取物及VC清除DPPH自由基的線性關(guān)系圖（n=3）

表2 土茯苓提取物及VC清除DPPH自由基的線性關(guān)系（n=3）

表3 土茯苓提取物對DPPH自由基的清除率（n=3）

2.2.2 土茯苓提取物對ABTS+自由基的清除能力

從圖2可看出土茯苓提取物和VC對ABTS+自由基的清除能力均隨質(zhì)量濃度增大而增大，同樣表現(xiàn)出劑效關(guān)系，且具有一定線性關(guān)系，相關(guān)性為0.978 5和0.996 2，IC50值分別為（11.07±0.37）mg/mL和（2.40±0.046）mg/mL，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.001）。土茯苓具有較好抗氧化能力，但還是稍弱于對照品VC，約為VC的1/5，見表4。且5組不同質(zhì)量濃度樣品對ABTS+自由基的清除能力兩兩比較，均具有顯著性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表5。

圖2 土茯苓提取物及VC清除ABTS+自由基的線性關(guān)系圖（n=3）

表4 土茯苓提取物及VC清除ABTS+自由基的線性關(guān)系（n=3）

2.3 土茯苓提取物對酪氨酸酶活性的影響

從圖3可看出，土茯苓提取物對酪氨酸酶具有一定激活作用，且激活作用隨著樣品質(zhì)量濃度增大而逐漸增強(qiáng)，表現(xiàn)出較好劑效關(guān)系，相關(guān)性在0.96以上，土茯苓提取物濃度為（0.38±0.13）mg/mL，酪氨酸酶激活率達(dá)到50%，見表6。但土茯苓濃度較低時，卻表現(xiàn)出微弱的酪氨酸酶抑制作用，發(fā)現(xiàn)土茯苓質(zhì)量濃度在0.10 mg/mL以上就表現(xiàn)出明顯的對酪氨酸酶激活作用。

表5 不同質(zhì)量濃度土茯苓提取物對ABTS+自由基的清除率比較（n=3）

圖3 土茯苓提取物激活酪氨酸酶活性的線性關(guān)系圖（n=3）

表6 土茯苓提取物對酪氨酸酶活性的影響（n=3）

3 結(jié)論

土茯苓提取物具有較好的抗氧化能力，可以顯著清除DPPH自由基和ABTS+自由基，IC50值分別為（13.55±0.55）mg/mL和（11.07±0.37）mg/mL。土茯苓提取物對酪氨酸酶具有激活作用，其濃度為（0.38±0.13）mg/mL時，酪氨酸酶激活率達(dá)到50%，試驗(yàn)結(jié)果為土茯苓的深入開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持，為拓展土茯苓在抗氧化和因酪氨酸酶活性降低而引起的色素缺失性疾病的治療提供可能性。