李成華，薛長松*，于斌，張偉豪

通化師范學(xué)院 吉林省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-長白山植物種質(zhì)資源保護(hù)與利用實(shí)驗(yàn)室（通化 134001）

酸漿（Physali alkekengiL.）別名紅姑娘、燈籠草、菇蔫兒、姑娘兒、掛金燈，原產(chǎn)于中國，主要分布在吉林、遼寧、黑龍江、內(nèi)蒙古、四川、西藏等地，植株全身均可入藥[1]，其性味甘、酸，性寒，有清凉、消腫、利尿、清除自由基、抗腫瘤等功效。初步研究發(fā)現(xiàn)，酸漿入藥部位主要含黃酮、多酚類物質(zhì)[2]。植物中存在的酚類化合物可分為游離酚和結(jié)合酚。酚類化合物的分離提取的難易程度與其存在形態(tài)有關(guān)，游離酚易溶于水或有機(jī)溶劑，可直接萃取出來，結(jié)合酚需要水解破壞化學(xué)鍵后或水解、蒸煮等方式破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)才可提取[3-4]。結(jié)合酚廣泛分布在植物中，具有較強(qiáng)抗氧化活性[5]，體內(nèi)研究表明，在代謝途徑和生物活性方面與游離酚相比有所不同[6]。結(jié)合酚經(jīng)過胃和小腸消化，經(jīng)腸道微生物菌群發(fā)酵作用后，相對(duì)于游離酚，在結(jié)腸中釋放并產(chǎn)生更強(qiáng)生物活性[7-9]。開展植物結(jié)合酚提取方法的研究十分必要。Wang等[10]研究表明在水果中結(jié)合酚占比60%～90%，Ma等[11]研究表明棗籽中結(jié)合酚含量是游離酚的3倍以上，結(jié)合酚的水解方法主要為堿水解和酸水解，堿水解主要破壞酯鍵，酸水解主要破壞糖苷鍵[12]，以堿法最為常用，可避免高溫?fù)p失結(jié)合酚。

酸漿宿萼結(jié)合酚提取工藝參數(shù)缺乏，以酸漿宿萼為原料，采用堿水解法將結(jié)合酚從原料組織中釋放出來，采用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，利用響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)合酚的堿水解法提取工藝。開展該研究有利于開展酸漿宿萼中結(jié)合酚的提取及明確其含量，對(duì)評(píng)估酸漿宿萼結(jié)合酚的總量的研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器、試劑

酸漿宿萼（2017年10月采自吉林省通化市周邊山上，粉碎備用）。

沒食子酸對(duì)照品（批號(hào)161171-160921，中國食品藥品檢定研究院）；乙醇、乙酸乙酯、甲醇等（均為分析純，天津市百世化工有限公司）。

HZQ-X100恒溫振蕩培養(yǎng)箱（大倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；HH-8型恒溫水浴鍋（常州冠軍儀器制造有限公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮）；PB-10型pH計(jì)（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 原料處理及游離酚提取[13]

取1 g酸漿宿萼干燥粉末加25 mL體積分?jǐn)?shù)80%丙酮，在50 ℃、100 W條件下超聲處理30 min，過濾保留上清液，殘?jiān)猛瑯臃椒ㄌ崛?次，合并上清液，定容至5 mL，得酸漿宿萼游離酚。

1.2.2 宿萼結(jié)合酚提取[14]

取充分提取游離酚后的宿萼殘?jiān)糜趫A底燒瓶中，加入NaOH溶液后水解，離心（4 000 r/min，20min），棄去殘?jiān)Ａ羯锨逡?，用鹽酸將pH調(diào)至中性后加入20 mL乙酸乙酯萃取，萃取2次，合并萃取相，離心（4 000 r/min，20 min）。在45 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，殘余物用50%甲醇定容至5 mL，得到宿萼結(jié)合酚提取液，于-20 ℃避光保存。

1.2.3 多酚含量測定

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取10.00 mg沒食子酸用蒸餾水定容至10mL，得到Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)液，取2.5 mL Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水定容至25 mL得到Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)液。準(zhǔn)確吸取0，1，2，3，4和5 mL的Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)液，0.75，1.00和1.50 mL的Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)液，用蒸餾水定容至5 mL，得到質(zhì)量濃度梯度為0，20，40，60，80，100，150，200和300 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

分別取125 μL標(biāo)準(zhǔn)使用液于試管中，加500 μL蒸餾水和125 μL福林酚，搖勻，反應(yīng)6 min，加1.25 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)7% Na2CO3溶液，加入1 mL蒸餾水，在20 ℃下避光放置1.5 h后，在760 nm波長處測定吸光度，重復(fù)3次。根據(jù)測定結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=4.936X-0.022 1（R2=0.999 0）。

1.2.3.2 樣品多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定

根據(jù)1.2.3.1的方法測定酸漿宿萼結(jié)合酚含量，多酚含量以每克質(zhì)量中含沒食子酸當(dāng)量表示。

式中：C為測定的結(jié)合酚質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液總體積，μL；W為稱取酸漿宿萼質(zhì)量，g。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化宿萼結(jié)合酚提取條件

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇NaOH濃度（A）、液料比（B）、水解時(shí)間（C）、水解溫度（D），利用Design-Expert 8.0.6軟件優(yōu)化酸漿宿萼結(jié)合酚提取條件。以結(jié)合酚提取量為響應(yīng)值（Y）進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，各因素水平見表1。

表1 因素水平設(shè)計(jì)表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素考察結(jié)果

2.1.1 NaOH濃度對(duì)結(jié)合酚的影響

固定液料比30︰1（mL/g）、溫度60 ℃、水解時(shí)間6 h，改變NaOH濃度（2，4，6，8和10 mol/L），結(jié)合酚提取量隨NaOH濃度變化結(jié)果見圖1。結(jié)合酚提取量從NaOH濃度2 mol/L開始隨濃度增大而增大，NaOH濃度6 mol/L時(shí)結(jié)合酚提取量達(dá)到最高峰，隨后開始下降又升高，因此，選擇NaOH濃度6 mol/L時(shí)較適宜。一定濃度堿液能夠水解結(jié)合酚的醚鍵和酯鍵，有利于結(jié)合酚釋放，但是強(qiáng)堿環(huán)境中結(jié)合酚的羥基發(fā)生電離，造成結(jié)合酚損失[15]。

圖1 NaOH濃度對(duì)結(jié)合酚含量的影響

2.1.2 液料比對(duì)結(jié)合酚的影響

固定NaOH濃度6 mol/L、溫度60 ℃、水解時(shí)間6 h，改變液料比10︰1，20︰1，30︰1，40︰1和50︰1（mL/g），結(jié)合酚含量30︰1（mL/g）時(shí)達(dá)到最大值，見圖2?？赡苁沁m當(dāng)濃度堿液能破壞結(jié)合酚的結(jié)合鍵，增加溶劑用量促進(jìn)結(jié)合酚的溶出[16]，故選擇液料比30︰1（mL/g）。

圖2 液料比對(duì)結(jié)合酚含量的影響

2.1.3 水解時(shí)間對(duì)結(jié)合酚的影響

固定NaOH濃度6 mol/L、液料比30︰1（mL/g）、溫度60 ℃，改變水解時(shí)間2，4，6，8和10 h，隨著提取時(shí)間延長，結(jié)合酚得率逐漸降低后升高，見圖3。這可能是由于提取時(shí)間過長，會(huì)使部分結(jié)合酚被氧化，雜質(zhì)大量溶出[15]。故選取提取時(shí)間為2 h。

圖3 水解時(shí)間對(duì)結(jié)合酚含量的影響

2.1.4 水解溫度對(duì)結(jié)合酚的影響

固定NaOH濃度6 mol/L、液料比30︰1（mL/g）、水解時(shí)間2 h，改變水解溫度40，50，60，70和80℃，隨著水解溫度提高，結(jié)合酚含量呈上升趨勢(shì)，在80 ℃達(dá)到最大，故選擇水解溫度80 ℃。

圖4 水解溫度對(duì)結(jié)合酚含量的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化酸漿宿萼結(jié)合酚提取工藝試驗(yàn)結(jié)果

采用響應(yīng)面分析法分析試驗(yàn)結(jié)果，以結(jié)合酚提取量為響應(yīng)值，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得回歸方程：Y=21.53-0.55A+0.43B-1.06C+1.70D+2.30AB+0.95AC+1.41AD-1.18BC+0.44BD-1.92CD。試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見表2。

表2 擬合設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案及結(jié)果

由表3可知，以結(jié)合酚提取量為響應(yīng)值，回歸方程顯著性檢測p=0.026 3＜0.050，表明該二次方程模型顯著，回歸方程模型與實(shí)際擬合性較好，試驗(yàn)誤差小，證明應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化酸漿宿萼結(jié)合酚提取工藝可行，各因素對(duì)結(jié)合酚提取量的影響依次為水解時(shí)間＞液料比＞NaOH濃度＞提取溫度。

表3 響應(yīng)面法對(duì)酸漿宿萼結(jié)合酚提取量的方差分析表

將表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面曲面分析，選擇2個(gè)交互的因素對(duì)結(jié)合酚提取量的影響進(jìn)行分析。根據(jù)回歸方程，考察擬合響應(yīng)面的形狀，分析水解時(shí)間、液料比、NaOH濃度、提取溫度對(duì)結(jié)合酚提取量的影響，結(jié)果見圖5。

利用回歸方程分析結(jié)果繪制結(jié)合酚提取量隨各因素變化的響應(yīng)曲面圖，由響應(yīng)曲面圖可知液料比、NaOH濃度、提取溫度、水解時(shí)間對(duì)結(jié)合酚提取量的影響。由圖5可見，提取條件在一定范圍內(nèi)，與其他提取因素比較，液料比與NaOH濃度交互因素與結(jié)合酚提取量呈明顯的拋物線關(guān)系；隨著液料比增加，結(jié)合酚提取量逐漸緩慢減少；隨著NaOH濃度增加，結(jié)合酚提取量產(chǎn)量逐漸減少。

2.2.1 驗(yàn)證試驗(yàn)

由Design-Expert 8.0.6軟件分析，得出酸漿宿萼結(jié)合酚提取的最優(yōu)條件。結(jié)果顯示，酸漿宿萼結(jié)合酚提取的最佳條件是液料比30︰1（mL/g）、NaOH濃度6 mol/L、水解時(shí)間2 h、提取溫度80 ℃。結(jié)合酚提取量為20.169 mg/g。在此優(yōu)化條件下，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果顯示，酸漿宿萼結(jié)合酚提取量為（20.13±0.18）mg/g，與模型預(yù)期值的誤差為5.24%，說明方程與試驗(yàn)情況擬合較好。

圖5 各兩因素交互作用對(duì)結(jié)合酚提取影響的響應(yīng)圖

3 結(jié)論與討論

采用響應(yīng)面法優(yōu)化堿水解法提取酸漿宿萼結(jié)合酚的工藝，最佳提取工藝條件為液料比30︰1 mL/g、NaOH濃度6 mol/L、水解時(shí)間2 h、提取溫度80 ℃。在此條件下，酸漿結(jié)合酚提取量為（20.13±0.18）mg/g，與模型預(yù)期值的誤差為5.24%，影響酸漿宿萼結(jié)合酚得率大小的因素主次順序?yàn)樗鈺r(shí)間＞液料比＞NaOH濃度＞提取溫度。其中，液料比與NaOH濃度交互因素與結(jié)合酚提取量之間交互作用顯著。

結(jié)合酚廣泛存在于植物基質(zhì)中，與游離酚相似，如櫻桃[17]、茭白[18]等的結(jié)合酚。富含酚類化合物的食品進(jìn)入消化道，游離酚可在小腸內(nèi)酯酶的作用下水解，隨后被吸收利用；與細(xì)胞壁緊密結(jié)合的酚類化合物在小腸水解的少，在結(jié)腸微生物產(chǎn)生的水解酶作用下緩慢持續(xù)地釋放，可能會(huì)使其在體內(nèi)發(fā)揮更長抗氧化作用[19]。游離態(tài)和結(jié)合態(tài)酚類化合物廣泛分布在植物中，不同存在形態(tài)的酚類化合物具有相似的生物活性，不同的生理活性。不同酚類化合物在體內(nèi)的吸收代謝途徑和抗氧化方式不同，結(jié)合酚在體內(nèi)較為持續(xù)的抗氧化作用及潛在的生理活性值得探究。研究結(jié)果為酸漿宿萼作為保健食品的深入開發(fā)及酸漿宿萼結(jié)合酚開發(fā)和利用提供依據(jù)，避免資源浪費(fèi)。