楊昆，潘新杰, ，陶亮，黃艾祥*

1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院（昆明 650201）；2. 濰坊工程職業(yè)學(xué)院（濰坊 262500）

辣木（Moringa oleifera）又稱鼓槌樹（Drumstick tree），是辣木科辣木屬植物，最早起源于印度的喜馬拉雅山南麓[1]。辣木營養(yǎng)豐富，且深受人們的喜愛。據(jù)報(bào)道，辣木葉子干粉中每100 g中含有27.1%的粗蛋白、2 000.30 mg鈣、368 mg鎂、204 mg磷、1 324 mg鉀、0.60 mg銅、282 mg鐵，以及163 mg維生素A、30.7 mg維生素B、173 mg維生素C、113 mg維生素E[2-4]。辣木在印度、非洲等地有“素食黃金”[5]之稱，已被作為高營養(yǎng)價(jià)值的蔬菜開發(fā)利用[6]。

酵素，廣義上是一種酶，狹義上是指具有豐富的有益菌及代謝產(chǎn)物酶、維生素、活性物質(zhì)等營養(yǎng)成分的功能性微生物發(fā)酵產(chǎn)品。酵素一般是微生物發(fā)酵一種或多種新鮮蔬菜、水果、菌菇、中草藥等原料，這樣不僅保存了原料中原有的營養(yǎng)物質(zhì)，而且還通過發(fā)酵代謝產(chǎn)生新的活性物質(zhì)[7]。

目前，酵素是一種風(fēng)靡日本和我國臺(tái)灣的植物功能食品，我國大陸地區(qū)對(duì)酵素的研究甚少，主要開發(fā)的產(chǎn)品有木瓜酵素、糙米酵素、火龍果酵素等，都起到了很好的保健作用。董銀卯等[8]研究發(fā)現(xiàn)火龍果酵素具有很強(qiáng)的超氧陰離子自由基、羥自由基、DPPH自由基清除能力，酵素內(nèi)SOD活力為300 U/mL，并且也有一定的淀粉酶和脂肪酶的活性。李志江等[9]以糙米為主要原料經(jīng)微生物發(fā)酵制成的糙米酵素，提高了糙米的食用特性和功能特性。蔣增良[10]研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓酵素在發(fā)酵過程中抗氧化性能明顯提高。

辣木葉是一種高蛋白、高鈣、富含活性成分的喬木類新資源食品，但蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分利用率低，微生物發(fā)酵是提高其利用率的有效途徑。辣木葉酵素具有一定的開發(fā)利用前景，而有關(guān)辣木葉酵素的研究等未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此，以辣木葉粉為主要材料，通過微生物發(fā)酵劑發(fā)酵，篩選最佳的工藝配方，并對(duì)酵素產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設(shè)備

1.1.1 試驗(yàn)材料

辣木葉粉：50 μm直徑的辣木粉和超微辣木葉粉，購自昆明七彩云花生物科技有限公司；脫脂奶粉：市售。

辣木葉發(fā)酵劑（通過對(duì)四株酵母菌進(jìn)行梯度馴化，以及蛋白質(zhì)、草酸降解等指標(biāo)篩選得到熱帶假絲酵母；乳酸菌為實(shí)驗(yàn)室已馴化的植物乳桿菌、干酪乳桿菌共2株，參考潘新杰[11]的研究）。

1.1.2 主要試劑

MRS培養(yǎng)基，北京陸橋；麥芽汁培養(yǎng)基，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；麥芽提取粉，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA），青島科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-6），國華電器有限公司；超聲儀（KRU-1800），濟(jì)南科爾超聲波設(shè)備有限公司；高速冷凍離心機(jī)（H2100R），上海趙迪生物科技有限公司；恒溫恒濕箱（MGG-300H），上海一恒科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

辣木葉粉→加純凈水浸泡→添加輔料→加水溶解→均質(zhì)→巴氏滅菌→冷卻→接種乳酸菌→培養(yǎng)→接種熱帶假絲酵母菌→培養(yǎng)→冷卻→后熟→成品

1.2.2 發(fā)酵劑的選擇

參照潘新杰[11]的方法，確定發(fā)酵劑的接種比例為m（植物乳桿菌）：m（干酪乳桿菌）：m（酵母菌）=3：3：1；乳酸菌和酵母菌的總接種量為3%。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

選取奶粉添加量（5%，10%，15%，20%和25%）、辣木葉粉添加量（10%，15%，20%，25%和30%）、白砂糖添加量（20%，25%，30%，35%和40%）、藕粉添加量（9%，17%，25%，33%和41%）為單因素，以感官評(píng)分為指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以奶粉、辣木葉粉、白砂糖、藕粉添加量為四因素，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，確定最佳的產(chǎn)品配方。因素和水平見表1。

表1 主要原料組成及其添加量的L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表 單位：%

1.2.5 復(fù)合穩(wěn)定劑的選擇

試驗(yàn)通過查閱資料以及多次試驗(yàn)篩選，最后采用黃原膠（0.010%，0.015%和0.020%）、魔芋膠（0.05%，0.15%和0.25%）為復(fù)合穩(wěn)定劑，并同時(shí)添加配合大豆軟磷脂2.4%、β-環(huán)狀糊精0.3%、抹茶香精和酸奶香精0.15%，研究其配比對(duì)辣木酵素質(zhì)地的影響。

1.2.6 產(chǎn)品質(zhì)量分析

1.2.6.1 感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

由表2可知，辣木酵素的感官質(zhì)量由感官評(píng)定小組進(jìn)行評(píng)定，評(píng)定小組由9位有關(guān)的專業(yè)人士組成。根據(jù)產(chǎn)品的色澤、氣味、口感、組織狀態(tài)幾個(gè)方面進(jìn)行感官評(píng)分，評(píng)分為百分制，綜合結(jié)果取平均值。

表2 感官評(píng)定表

1.2.6.2 產(chǎn)品活菌數(shù)

在MRS固體培養(yǎng)基中添加10 mg/L的納他霉素和1 000 mg/L山梨酸鉀來抑制酵母菌的生長[12]。在改良的酵母菌固體培養(yǎng)基（PDA）中添加氯霉素，能夠排除乳酸菌生長對(duì)酵母菌總菌數(shù)檢測的干擾，采用稀釋平板計(jì)數(shù)法（國標(biāo)）測定乳酸菌和酵母菌總活菌數(shù)。

1.2.6.3 產(chǎn)品酶及活性物質(zhì)

1.2.6.3.1 總超氧化物歧化酶（T-SOD）活力的測定

SOD的提?。毫咳?5 mL混勻發(fā)酵液，按7 000 r/min離心過濾，取上清液備用（50 μL）。SOD的測定：南京建成生物工程SOD試劑盒

1.2.6.3.2 過氧化氫酶（CAT）活力的測定

過氧化氫酶的提?。簻?zhǔn)確量取15 mL混勻發(fā)酵液，按7 000 r/min離心過濾，取上清液備用。

過氧化氫酶的測定：南京建成生物工程過氧化氫酶試劑盒。

1.2.6.3.3 谷胱甘肽（GSH）的測定

谷胱甘肽（GSH）的提?。簻?zhǔn)確量取15 mL混勻發(fā)酵液，按7 000 r/min離心過濾，取上清液備用。

谷胱甘肽（GSH）的測定：南京建成生物工程谷胱甘肽（GSH）試劑盒。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣木酵素的配方篩選

2.1.1 單因素對(duì)辣木酵素感官評(píng)分的影響

由圖1所示，當(dāng)奶粉添加量為15%，辣木葉粉添加量為20%，白砂糖添加量為35%，藕粉添加量為17%時(shí)，四者可以獲得最高的感官評(píng)分。

圖1 單因素對(duì)辣木酵素感官評(píng)分的影響

2.1.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，根據(jù)極差分析結(jié)果，4種主料添加量對(duì)辣木酵素感官品質(zhì)的影響：最主要的因素是辣木葉粉添加量，其次是奶粉添加量，再是白砂糖添加量，即影響辣木酵素感官品質(zhì)的順序?yàn)锽＞A＞C＞D。由此可知，辣木酵素配方中4種主料的最優(yōu)組合為A2B3C1D2，即奶粉15%、辣木葉粉20%、白砂糖35%、藕粉17%。按該配方組合進(jìn)行3次平行試驗(yàn)加以驗(yàn)證，產(chǎn)品的感官評(píng)分的均值為97.00分，制得的辣木酵素，色澤呈淡綠色，具有辣木特有的清香，呈半固體狀，實(shí)物感強(qiáng)，口感爽滑，風(fēng)味濃郁，因此，選擇A2B-3C1D2組合為最佳配方。

表3 主要原料配比L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

2.1.3 復(fù)合穩(wěn)定劑選擇

辣木酵素中辣木葉粉是辣木葉經(jīng)過烘干、超微粉碎制成，含有大量的不溶性纖維素及二價(jià)離子，會(huì)造成體系穩(wěn)定性較差，必須外加膠體物質(zhì)及磷酸鹽以幫助形成懸浮穩(wěn)定體系。黃原膠和卡拉膠形成凝膠網(wǎng)絡(luò)懸浮結(jié)構(gòu)，可防止不可溶的顆粒沉降，配合大豆軟磷脂、β-環(huán)狀糊精、抹茶香精和酸奶香精賦予酵素較好的香味和細(xì)膩爽滑口感。結(jié)果見表4。

表4 穩(wěn)定劑的添加量對(duì)辣木酵素質(zhì)地的影響

由表4可知，5號(hào)即黃原膠3%、魔芋膠7%、大豆軟磷脂2.4%、β-環(huán)狀糊精0.3%、抹茶香精和酸奶香精0.15%為最佳的復(fù)配穩(wěn)定劑，按該復(fù)配量進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，產(chǎn)品的穩(wěn)定性較好，可有效解決辣木酵素分層、辣木過稠等現(xiàn)象，使產(chǎn)品達(dá)到最佳口感。趙謀明等[13]研究表明，黃原膠是由微生物發(fā)酵產(chǎn)生的雜多糖類物質(zhì)，黃原膠在水中溶解時(shí)，能形成一種共聚體，這種共聚體構(gòu)成類似膠體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能夠抓取乳劑中不溶顆粒和油脂分子，能夠使乳液的粒度和Zeta保持不變，對(duì)乳劑中不溶性顆粒和油脂分子的液滴具有良好的穩(wěn)定作用。浮吟梅等[14]研究表明：卡拉膠是一種親水膠體，能夠在乳劑中與蛋白質(zhì)發(fā)生作用，形成三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可以結(jié)合并固定水分子和不溶顆粒，卡拉膠分子帶有負(fù)電荷，能夠吸附在油脂分子表面，增加油脂分子的排斥力，從而起到穩(wěn)定作用。由此可見，穩(wěn)定劑的添加對(duì)辣木酵素的質(zhì)地顯得尤為重要。

2.2 最佳配方工藝流程

由表5可知，通過單因素和正交試驗(yàn)，篩選最佳的工藝配方和復(fù)配穩(wěn)定劑，并結(jié)合篩選的微生物發(fā)酵劑發(fā)酵，得到最佳的工藝技術(shù)。

辣木超微粉碎粉20%→加純凈水浸泡（1：1）1 h→添加輔料（奶粉15%、藕粉17%、白砂糖35%、黃原膠3%、魔芋膠7%、大豆軟磷脂2.4%、β-環(huán)狀糊精0.3%、抹茶香精和酸奶香精0.15%等混勻）→加水溶解（料液比1：10 g/mL）→均質(zhì)→巴氏滅菌（80℃，15 min）→冷卻→接種乳酸菌（干酪乳桿菌、植物乳桿菌各1.29%）→培養(yǎng)3 h→接種熱帶假絲酵母菌0.42%→培養(yǎng)15 h→冷卻→后熟4 h→成品

表5 辣木酵素研制的最佳工藝流程

2.3 酵素產(chǎn)品質(zhì)量

2.3.1 感官品質(zhì)

由表6可知，辣木酵素呈良好的半固態(tài)，黏度適中，無絮狀分層現(xiàn)象；色澤鮮亮、爽目，呈均勻一致的淡綠色，不透明；風(fēng)味濃郁飄香，奶香味中帶有辣木味，氣味協(xié)調(diào)，無異味；口感細(xì)膩潤滑，味道柔和，酸甜適中。感官評(píng)分為87.375分。莫大美等[15]通過研究獲得了玫瑰酵素的最佳工藝，利用該工藝制備的玫瑰酵素具有玫瑰紅色和玫瑰花味，淡淡酒香、酸甜適宜。南竹等[16]對(duì)菠蘿皮渣酵素發(fā)酵工藝的研究表明，當(dāng)發(fā)酵溫度23 ℃、酵母接種量0.3%、發(fā)酵時(shí)間16.5 h時(shí)，制得的酵素顏色均勻，有光澤，酸甜適口，并伴有發(fā)酵香味。由此可見，此次研究的酵素產(chǎn)品感官品質(zhì)較好，酸甜適中，味道柔和。

2.3.2 功能活性成分

由表7可知，發(fā)酵組均大于未發(fā)酵組，SOD酶活性達(dá)4 520.79 U/g，CAT活性達(dá)3.522 U/g，GSH活性達(dá)48.026 mg GSH/g。通過增長百分比可以看出過發(fā)酵后的SOD酶活性、過氧化氫酶活性及谷胱甘肽含量增長百分比分別為55.41%，128.70%和77.53%，其中過氧化氫酶發(fā)酵后增長量最大。通過活菌數(shù)指標(biāo)可以看出乳酸菌活菌數(shù)達(dá)8.91×108CFU/mL，酵母菌活菌數(shù)達(dá)4.76×106CFU/mL，與復(fù)合發(fā)酵辣木液的活菌數(shù)相比，酵母菌和乳酸菌均有不同程度的增大。

目前，食用酵素中被研究最多的活性酶主要包括SOD（超氧化物歧化酶）、淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶四類，尤以SOD為代表。SOD活性已成為抗衰老藥物和抗衰老保健食品的一個(gè)重要指標(biāo)[17]。林冰等[18]對(duì)刺梨酵素、梁貴秋等[19]對(duì)桑葚酵素、劉鑫等[20]對(duì)藍(lán)莓酵素也獲得了相同的結(jié)論。說明微生物發(fā)酵均能產(chǎn)生SOD。除此之外，酵素還有很多的功能作用，比如改善腸胃功能[21]、治療腹瀉[22]、抗壓與抗疲勞[23]等。然而，研究的辣木酵素不僅含有SOD，還含有過氧化氫酶、谷胱甘肽、乳酸菌、酵母菌等豐富的功能活性成分。

表7 辣木酵素的活性成分表

3 結(jié)論

篩選得到辣木葉酵素的最佳工藝配方：辣木葉粉的添加量為20%，1：1加水浸泡1 h，添加輔料為80%，乳酸菌和酵母菌的總接種量為3%。由此工藝生產(chǎn)的辣木酵素產(chǎn)品呈淡綠色半固態(tài)狀，酸甜適中有辣木清香，含有豐富的益生菌、酶及活性成分。通過對(duì)辣木葉酵素的研制，可為后續(xù)辣木產(chǎn)品的深加工，提供理論依據(jù)，并提高辣木的附加值及促進(jìn)辣木產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。