張 琨， 徐宗偉*， 陳傳松， 房豐洲

1. 天津大學(xué)， 精密測試技術(shù)及儀器國家重點實驗室， 微納制造實驗室， 天津 300072 2. 山東師范大學(xué)物理與電子科學(xué)學(xué)院， 山東 濟(jì)南 250014

引 言

人體由鈣(Ca)、 鈉(Na)、 鎂(Mg)、 鐵(Fe)、 銅(Cu)、 鋅(Zn)等50多種元素組成。 化學(xué)元素在生物體細(xì)胞的生理穩(wěn)態(tài)中起著核心作用， 其失調(diào)可能導(dǎo)致一定數(shù)量的病理變化。 例如， 金屬元素及其化合物可誘導(dǎo)生物分子(如： 酶和DNA)構(gòu)象的變化， 改變細(xì)胞的平衡， 造成細(xì)胞損傷。 細(xì)胞的損害會引發(fā)細(xì)胞代謝環(huán)境的理化性質(zhì)和化學(xué)組成發(fā)生變化， 進(jìn)而導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生。 此外， 內(nèi)部環(huán)境的嚴(yán)重失衡會使細(xì)胞程序性死亡或異常增殖， 致使腫瘤的形成。 因此， 生物體中化學(xué)元素的分布可作為疾病診斷的重要信息來源， 及時監(jiān)測生物體中金屬元素含量對維持機體平衡起著重要作用。 表1顯示了部分金屬元素在生物體生命活動中所起的重要作用。

表1 部分金屬元素在生物體生命活動中所起的作用

激光誘導(dǎo)擊穿光譜(laser induced breakdown spectroscopy， LIBS)技術(shù)是一種基于原子發(fā)射光譜且激光作為激發(fā)源的新興物質(zhì)元素分析技術(shù)， 脈沖激光經(jīng)聚焦在靶材形成的等離子體衰減過程中發(fā)出的特定元素線通過光譜儀進(jìn)行檢測分析， 通過監(jiān)視其位置和強度可定性和定量的分析靶材， 在元素檢測和分析中具有獨特優(yōu)勢[1]。 首先， 測量范圍非常廣泛， 可以直接檢測固體、 液體和氣體。 其次， 樣品的制備和應(yīng)用過程簡便。 第三， 可以實現(xiàn)快速、 實時和長距離分析以及非接觸式測量。 第四， 實驗樣品消耗少， 對被測材料的破壞小。 第五， 空間分辨率高， 可達(dá)1～100 μm。 第六， 可以同時分析多種元素， 分析過程簡單、 迅速。 最后， 可以區(qū)分不同的材料、 組織， 具有良好的敏感性， 可以進(jìn)行痕量分析。 20世紀(jì)60、 70年代， 受到激光器價格和探測器性能的限制， LIBS技術(shù)研究只停留在基礎(chǔ)理論方面， 在實際應(yīng)用方面沒有取得實質(zhì)性的進(jìn)展。 直到20世紀(jì)80年代新型光譜探測器的發(fā)明， 光譜質(zhì)量明顯提高， LIBS技術(shù)才得到實質(zhì)性的進(jìn)展。

為了LIBS技術(shù)進(jìn)一步的實用化， 出現(xiàn)了多種激光誘導(dǎo)擊穿光譜探測的新技術(shù)， 例如： 納秒LIBS、 飛秒LIBS、 偏振分辨LIBS、 雙脈沖LIBS以及時間分辨LIBS等。 為了獲取樣品盡可能全面的信息， 一般可以通過兩種或更多種互補的分析技術(shù)來實現(xiàn)。 LIBS與一種或多種光譜技術(shù)(熒光光譜、 高光譜成像、 拉曼光譜、 X射線熒光等)的組合具有明顯協(xié)同作用， 比應(yīng)用單一技術(shù)獲得的信息更多。 此外， 將化學(xué)計量學(xué)、 機器學(xué)習(xí)、 多元數(shù)據(jù)分析等方法與LIBS光譜相結(jié)合為復(fù)雜的光譜數(shù)據(jù)的定量和定性分析提供了強大的工具。 常見的方法包括偏最小二乘(PLS)、 主成分分析(PCA)、 線性判別分析(LDA)、 支持向量機(SVM)、 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)等。 當(dāng)前， LIBS技術(shù)獲得了新的發(fā)展， 如多元素編碼測定LIBS； 將金屬納米粒子用于增強激光燒蝕技術(shù)， 即納米粒子增強LIBS； 基于光學(xué)顯微鏡， 掃描樣品的目標(biāo)區(qū)域表面時同時連續(xù)產(chǎn)生激光誘導(dǎo)的等離子體， 獲得具有高空間分辨率的三維(3D)成分圖， 即元素成像LIBS。

近年來， 隨著激光技術(shù)和光學(xué)檢測技術(shù)的發(fā)展， 研究人員對LIBS技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用前景產(chǎn)生了極大的興趣， 并在疾病檢測方面獲得了長足的發(fā)展。 因此， 在查閱近幾年來國內(nèi)外最新文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上， 總結(jié)了LIBS在幾種常見疾病和腫瘤診斷領(lǐng)域的研究進(jìn)展。 希望本文能夠使LIBS技術(shù)在疾病檢測中具有更廣闊的研究空間和應(yīng)用價值， 并使這一新的光譜檢測技術(shù)日臻完善。

1 LIBS在疾病診斷領(lǐng)域中的應(yīng)用

LIBS技術(shù)作為一種直接光譜檢測和分析技術(shù)， 可以通過生物樣品的檢測獲得大量目標(biāo)元素的光譜信息。 在本節(jié)中， 我們回顧LIBS在疾病診斷領(lǐng)域的應(yīng)用。 這一研究的首要目標(biāo)是利用人類和動物標(biāo)本產(chǎn)生的等離子體發(fā)射光譜來確定疾病的演變特征。 部分文獻(xiàn)中選擇的樣品以及測量到的化學(xué)元素如表2所示。

表2 部分文獻(xiàn)中選擇的樣品和測量元素

1.1 LIBS在常見疾病診斷中的應(yīng)用

1.1.1 LIBS分析硬組織和軟組織

進(jìn)行LIBS分析的臨床樣本主要涉及硬組織(牙齒、 骨頭等)和軟組織(皮膚、 皮下組織等)。 Gazmeh等證明了LIBS在牙穿孔和牙菌斑中區(qū)分健康組織和腐爛組織的可能性[2]。 采用PLS判別分析法， 根據(jù)Ca， Mg， Zn， K， Sr和Na等元素的32條原子和離子發(fā)射譜線， 對受試者不同的牙組織進(jìn)行分類。 結(jié)果表明， 該方法對未知牙組織有較好的鑒別和預(yù)測能力， 證實了LIBS識別健康牙齒和蛀牙的能力。 LIBS還可用于表征處于不同纖維化階段的小鼠肝組織[17]。 已知Ca會增加纖維間隔中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的交聯(lián)。 隨著纖維化的加劇， LIBS信號顯示Ca強度增加了三倍， 這意味著Ca是肝纖維化的關(guān)鍵參與者。 此外， 利用LIBS技術(shù)還可對皮膚慢性炎癥引起的表皮增生或角化過度進(jìn)行研究[18]。

1.1.2 LIBS分析結(jié)石疾病

2015年， Jaswal等對膽結(jié)石和尿路結(jié)石患者進(jìn)行了LIBS分析， 證明LIBS在結(jié)石診斷的準(zhǔn)確性、 靈敏度、 樣品消耗量和分析時間上具有優(yōu)勢[5]。 此外， 相關(guān)研究人員還使用LIBS進(jìn)行了膽囊結(jié)石和腎結(jié)石中微量元素的定性和定量分析， 不同部位結(jié)石的確定以及泌尿系統(tǒng)結(jié)石內(nèi)部不同元素的空間分布[19-21]。 這些相關(guān)研究證明了LIBS在結(jié)石診斷中的巨大潛力。

1.1.3 LIBS分析脫發(fā)癥

Hamzaoui等利用LIBS技術(shù)驗證雄激素性脫發(fā)對12例男性患者的頭發(fā)基質(zhì)的影響[3]。 研究表明， 枕骨和頂葉區(qū)域的頭發(fā)樣品富含微量元素和礦物質(zhì)(Mg 285.21 nm， Ca 445.47 nm， Na 588.99 nm和CN發(fā)射帶)。 對于Ca和Na元素， 來自枕骨區(qū)的發(fā)射帶要比頂葉區(qū)的強。 對于K元素， 頂部區(qū)域中的發(fā)射帶比后枕區(qū)域中的更密。

1.1.4 LIBS分析阿爾茨海默氏病

Gaudiuso等使用LIBS和機器學(xué)習(xí)分析了來自阿爾茨海默氏病患者和健康對照人群的血漿微滴， 并著重使用基于LIBS差異光譜的數(shù)據(jù)分析方法來區(qū)分這兩種不同類型的樣本[22]。 結(jié)果表明， 使用LIBS和機器學(xué)習(xí)可以對阿爾茨海默氏病患者和健康對照樣本進(jìn)行可靠的分類， 準(zhǔn)確度為80%， 特異性為75%， 敏感性為85%。 該研究驗證了LIBS診斷阿爾茨海默氏病的潛力。

1.1.5 LIBS分析Graves眼病

Graves眼病的診斷是一項重大挑戰(zhàn)。 通過LIBS與機器學(xué)習(xí)相結(jié)合的方法， Li等對Graves眼病組織和健康對照組織進(jìn)行了識別[4]。 選擇了金屬元素(Na， K， Al， Ca)， 非金屬元素(O)和分子帶(C—N， C—O)來診斷Graves眼病。 結(jié)合LDA， SVM，k最近鄰模型和廣義回歸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的分析結(jié)果表明， LIBS結(jié)合非線性模型在識別Graves眼病方面具有更高的準(zhǔn)確率。 因此， LIBS與機器學(xué)習(xí)方法相結(jié)合可以成為區(qū)分Graves眼病的有效方法。

1.2 LIBS在腫瘤診斷中的應(yīng)用

金屬元素參與細(xì)胞的異常表達(dá)(異常分裂、 異常分化、 異常增殖)， 在腫瘤的生長、 侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。 LIBS可以通過測量正常和癌性樣本中微量元素的強度對樣品進(jìn)行診斷和分類[16, 23]。

1.2.1 LIBS分析皮膚癌

黑色素瘤是一種常見的皮膚癌。 Han等使用LIBS實時檢測系統(tǒng)分析了黑素瘤和周圍皮膚中檢測生物標(biāo)志物Ca和Mg[6]。 此外， PCA和LDA的結(jié)果表明， LIBS對黑色素瘤的檢測具有高度靈敏性。

Moon等研究人員使用小鼠黑色素瘤組織切片證明了飛秒LIBS區(qū)分皮膚黑色素瘤區(qū)域與真皮區(qū)域的可能性(圖1)[8]。 研究顯示， 黑色素瘤和周圍組織的C Ⅰ 247.85 nm的強度基本相同， 黑色素瘤中Mg Ⅱ 279.55 nm， 280.27 nm和Mg Ⅰ 285.21 nm的強度明顯高于周圍組織。 由于細(xì)胞密度和代謝強度的差異， 黑色素瘤腫瘤區(qū)域的Mg濃度較高， 并逐漸降低至周圍組織。 以C強度作為Mg元素信號歸一化的標(biāo)準(zhǔn)， 建立強度比圖像， 可以清楚地區(qū)分皮膚癌區(qū)域和真皮區(qū)域， 且與形態(tài)學(xué)和組織學(xué)特征相吻合。 這項研究表明， LIBS是一種快速確定皮膚癌部位的有效工具， 可以縮短組織病理學(xué)診斷所需的時間。

圖1 從色黑色素瘤， 周圍組織和硅片基底測量的LIBS光譜強度[8]

Moncayo等證明LIBS成像在人類健康皮膚組織、 轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、 默克爾細(xì)胞癌(MCC)和鱗狀細(xì)胞癌(SCC)活檢中的適用性[9]。 這項研究檢測了P， Cu， Zn， Fe， Al， Mg和Na等元素， 發(fā)現(xiàn)腫瘤中化學(xué)元素的含量和空間分布存在差異。 在MCC中， 最靠近腫瘤區(qū)域的Ca和Zn濃度較高。 在SCC中， Na， P， Mg和Zn信號在腫瘤的左側(cè)區(qū)域更強。 皮膚的外部區(qū)域由Na， Mg， Ca， P和Zn組成。 SCC或MCC的底部區(qū)域顯示出高Fe含量， 證明該區(qū)域存在血液或大血管。 另外， SCC和MCC組織的側(cè)邊緣可以看到很高濃度的Fe， Cu， Ca和Zn。

1.2.2 LIBS分析肝腫瘤

El-Sherbini等利用LIBS技術(shù)簡單鑒定了人肝組織表面血漿中的元素(Mg， K， Ca， Na， Fe， Mn和Cu)[24]。 結(jié)果顯示， 在肝組織中， 元素Mg， K， Ca， Na， Fe， Mn和Cu的增加與X6.5， 2.5， 7， 4.5， 7， 6.5， 2.5的因子有關(guān)。 換句話說， 元素濃度的增加與肝臟中聚集的鈣化可能是相關(guān)的。 此外， 即使已識別的不同微量元素的濃度無窮小地增加， 癌癥也開始發(fā)生惡化。 將LIBS結(jié)果反饋到ANN中來驗證癌癥的分類。 大約80%的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)的國際記錄值相一致， 表明， 利用ANN對正常和惡性肝組織進(jìn)行分類是有效的。

1.2.3 LIBS分析胃腫瘤

Aida等使用LIBS方法鑒定了胃腫瘤組織和非腫瘤組織[10]。 兩種組織中元素的比較顯示， 所有腫瘤組織樣品中Ca和Mg譜線的強度顯著高于非腫瘤組織。 對于Ca元素， 選擇315.92， 317.96， 393.32和396.8 nm的發(fā)射線進(jìn)行研究； 對于Mg元素， 選擇279.56和280.3 nm的發(fā)射線進(jìn)行分析。 直方圖(圖2)顯示了胃腫瘤和非腫瘤組織中Ca和Mg元素的平均發(fā)射強度。 與正常樣品相比， 腫瘤樣品中Mg元素譜線的強度顯著增加。 Mg在蛋白質(zhì)生物合成中的主要作用可以解釋這種增加， 而且Mg在細(xì)胞增殖強度中起關(guān)鍵作用。 癌癥疾病會破壞Mg的分布， 導(dǎo)致非腫瘤組織中的Mg減少。

圖2 直方圖比較了從5名患者的腫瘤(橙色)和非腫瘤(藍(lán)色)胃組織獲得的6條基本譜線的平均歸一化強度

1.2.4 LIBS分析乳腺癌

Ghasemi等在LIBS和聲波響應(yīng)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了長期實驗來區(qū)分正常和癌變的乳腺組織[25]。 惡性組織中微量元素(Ca， Na和Mg)顯著增加， 這是由激光誘導(dǎo)的微等離子體中的Mg Ⅰ， Mg Ⅱ， Ca Ⅰ， Ca Ⅱ， Na Ⅰ和Na Ⅱ決定。 此外， 由于物質(zhì)強烈的原子/離子特性發(fā)射， 伴隨著更高的聲學(xué)水平， 癌變組織上產(chǎn)生了更多的高能微等離子體。 不健康組織上的等離子體特征發(fā)射向檢測器移動的速度稍微快一些， 導(dǎo)致音頻藍(lán)移差異。 腫瘤組織中微量元素含量較高， 激光誘導(dǎo)微等離子體中的等離子體溫度和電子密度較高， 聲信號進(jìn)一步強化。

1.2.5 LIBS分析宮頸癌

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤。 Wang等使用LIBS技術(shù)對石蠟包埋的健康組織(n=54)和宮頸癌組織(n=90)樣本進(jìn)行了初步討論， 并結(jié)合PCA-SVM法對健康組織和宮頸癌組織進(jìn)行了分類[11]。 收集健康組織和宮頸癌組織從240～860 nm的144條LIBS光譜。 所有光譜數(shù)據(jù)在C 247.86 nm峰的基礎(chǔ)上進(jìn)行歸一化， 結(jié)果表明健康組織和宮頸癌組織中的Ca， Na， Cl， Mg和K等微量元素具有明顯的差異。 其中宮頸癌組織中的Na， Mg和K的歸一化強度明顯高于健康組織， 而Ca的歸一化強度明顯低于健康組織。 此外， 研究顯示PCA-SVM的識別精度優(yōu)于SVM， 其識別精度從93.06%提高到94.44%， 建模時間從21.55 s降低到1.97 s。 因此， 可以合理地得出結(jié)論， LIBS技術(shù)和PCA-SVM的組合可以作為一種實時診斷宮頸癌組織的有效方法。

1.2.6 LIBS分析淋巴瘤和骨髓瘤

Chen等采用LIBS聯(lián)合PCA、 LDA等方法快速、 可靠地診斷和鑒別了影響淋巴和造血系統(tǒng)的淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤(MM)[15]。 從淋巴瘤、 MM患者和健康對照樣本的LIBS差異譜中選擇Ca， Na， K和N等元素的24條原子線進(jìn)行診斷。 結(jié)果表明， 主要的特征光譜位于Ca， Na， K， H， O和N的原子譜線上， 與健康對照組相比， 癌癥患者血清樣本的Ca譜線較強， 而Na， K， H， O和N譜線較弱。

Busser等通過常規(guī)光學(xué)顯微鏡結(jié)合LIBS多元素成像對福爾馬林固定和石蠟包埋的淋巴結(jié)標(biāo)本進(jìn)行了組織病理學(xué)評估[13]。 實驗檢測到腫瘤中多種金屬的存在， 例如皮膚肉芽腫

和皮膚假性淋巴瘤中存在Al， 淋巴結(jié)和皮膚標(biāo)本中存在Ti， W， Cr和Cu。 此外， LIBS多元素調(diào)查顯示， P元素分布可正確顯示淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)， 而在淋巴結(jié)的不同區(qū)域中存在高含量的Ti， 這與組織病理學(xué)檢查后報道的黑色素形態(tài)相對應(yīng)。

Chen等對早期淋巴瘤和健康對照組的全血樣本進(jìn)行LIBS測試， 觀察到CN B-X譜帶、 弱發(fā)射線以及Ca， Na， K， H， O和N為主的強發(fā)射線[14]。 研究顯示， 淋巴瘤全血中的Fe Ⅰ， Na Ⅰ和K Ⅰ濃度較低， 而Ca Ⅰ和Mg Ⅰ的強度與健康對照組相似。 此外， 金屬元素Ca Ⅰ和Na Ⅰ峰的光譜強度在不同癌癥階段之間相對穩(wěn)定， 而Mg Ⅰ， Fe Ⅰ和K Ⅰ的光譜強度隨著腫瘤階段的增加而逐漸降低。

1.2.7 LIBS分析其他腫瘤

Melikechi等對卵巢癌進(jìn)行了LIBS和多變量統(tǒng)計分析[12]。 通過這項工作， 發(fā)現(xiàn)Fe具有許多特征譜線， 還證明LIBS可用于轉(zhuǎn)基因(癌)和野生(非癌)小鼠的自動識別。 Gaudiuso等人從患病小鼠的肺、 淋巴結(jié)、 脾臟血清和組織勻漿中獲得了LIBS光譜[7]。 研究顯示正常血清樣品的Ca Ⅰ和Mg Ⅰ強度略高于腫瘤樣品， 而Na I卻沒有觀察到相似的趨勢。 Ghasemi等分析了人類乳房、 結(jié)腸、 喉和舌器官的正常和癌癥體外組織的LIBS光譜[16]。 結(jié)果表明， 癌組織中Ca， Mg和Na等微量元素的含量明顯高于健康組織。 癌性乳房組織中的Mg濃度明顯高于喉嚨、 舌頭和結(jié)腸癌性組織。 健康組織中Ca Ⅱ/K， Ca Ⅰ/K和Na Ⅰ/K的歸一化強度要比四種癌癥組織樣本更高。 此外， 他們還通過電感耦合等離子體發(fā)射光譜和四極質(zhì)譜法對微量元素的識別進(jìn)行了驗證。 研究人員采用激光燒蝕電感耦合等離子體質(zhì)譜法和LIBS相結(jié)合的方式對惡性胸膜間皮瘤樣品的微量和痕量元素進(jìn)行分析， 其結(jié)果與組織學(xué)染色有良好的相關(guān)性[26]。 這些信息有助于元素分析結(jié)果在藥物開發(fā)和治療中更具價值。

2 結(jié) 論

LIBS作為一種元素分析技術(shù)正處于蓬勃發(fā)展的階段， 尤其是在疾病診斷研究中的應(yīng)用。 本文重點討論了LIBS在幾種常見疾病和腫瘤診斷中的實用性。 LIBS具有既簡單又快速的多元素分析優(yōu)勢， 隨著不斷發(fā)展， LIBS分析技術(shù)從簡單的單次顯微分析、 二維表征(空間映射)分析發(fā)展到材料元素的3D成像功能(如深度剖析)。 此外， LIBS成像與其他成像方式(例如拉曼光譜、 激光誘導(dǎo)的熒光光譜、 光學(xué)顯微鏡等)結(jié)合使用， 有助于通過光譜學(xué)、 解剖學(xué)和病理學(xué)相結(jié)合的多模式方法收集臨床樣本的診斷信息。 尤其是LIBS與機器學(xué)習(xí)、 納米技術(shù)的融合可作為精密醫(yī)學(xué)診斷的新工具。 將來， 疾病檢測領(lǐng)域可能是LIBS潛在的研究興趣領(lǐng)域。 從這個意義上說， LIBS在疾病診斷領(lǐng)域中的研究將進(jìn)入新階段， 將為醫(yī)學(xué)事業(yè)做出更加杰出的貢獻(xiàn)和創(chuàng)造更高的應(yīng)用價值。