王瓊仙，楊騏睿，李成，王金偉，吳春妍，吳林雄

（1 昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部,云南 昆明；2 云南省骨科醫(yī)院,云南 昆明；3 昆明醫(yī)科大學(xué)公衛(wèi)學(xué)院,云南 昆明；4昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,云南 昆明)

0 引言

骨康靈液是一種院內(nèi)制劑，是由昆明醫(yī)學(xué)院科研中試中心研發(fā)，經(jīng)由云南省藥監(jiān)局批準(zhǔn)生產(chǎn)。由10 多味中藥經(jīng)炮炙、加工、提取其有效成份后，對(duì)其進(jìn)行一系列的制備，而最終形成的一種藥液，是一種外用藥物[1，2]。骨康靈液經(jīng)過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在接骨生新方面具有較好的效果，而且對(duì)于骨折患者恢復(fù)中的骨痂生長(zhǎng)具有有效的促進(jìn)作用，從而更好地幫助骨折患者康復(fù)，另外在外傷性閉合骨折及跌打損傷、關(guān)節(jié)紅腫疼痛等疾病中，還可有效發(fā)揮其活血化瘀、消腫止痛的效用。

1 骨康靈液發(fā)揮療效作用的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究

1.1 材料與方法

儀器：普通醫(yī)用診斷X 攝線機(jī)（本部門(mén)實(shí)驗(yàn)室）及手術(shù)器械等。

藥品：本院原制劑室提供，骨康靈液的批準(zhǔn)文號(hào)為滇藥制字(z)20092434A。

1.2 動(dòng)物模型的建立與評(píng)價(jià)

（1）分組：200只成年SD 大鼠，雌雄各半，體重（200±20）g，隨機(jī)分為四組。sham 組( 空白對(duì)照組),骨折組66只, 對(duì)照組( 骨折+95% 酒精組)66只和治療組(骨折+骨康靈液)68只，其中空白對(duì)照組均為各組的SD 大鼠股骨左側(cè)，其他3 組均為各組SD 大鼠股骨的右側(cè)，每組多用幾只動(dòng)物備用。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)于昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SYSK(滇)2005-0004，許可證號(hào)SCXK(滇)2011-0004。

（2）制備骨折模型：隨機(jī)選擇右側(cè)股骨制造股骨中段骨折，利用X 線技術(shù)觀察患肢的具體情況，最后進(jìn)行傷口的縫合處理(術(shù)后連續(xù)3d 每天按15萬(wàn)/kg 劑量的青霉素進(jìn)行肌肉注射，有效預(yù)防感染)。

（3）給藥：造模成功后，將藥棉或紗布上浸滿骨康靈液后，將其對(duì)治療組的患處進(jìn)行充分的包纏，并利用小夾板對(duì)其進(jìn)行有效的固定處理，需要注意的是，要保證患處的藥棉經(jīng)常處于比較濕潤(rùn)的狀態(tài)，每日可間隔6h 定時(shí)浸濕藥棉1次，4次/d，從而有效幫助患處的藥物吸收。分別于骨折造模成功給藥后第7、15、21、30、42、50d 各組每次分別大鼠行腹腔麻醉后10只做X-線攝片觀察骨折愈合情況及骨痂生長(zhǎng)情況。對(duì)照組、治療組骨折給藥后1個(gè)月分別各取4只骨折斷端的骨組織放入-80℃冰箱保存，干冰運(yùn)輸送檢?；蛐酒偷鞍踪|(zhì)譜檢測(cè)篩選骨康靈液發(fā)生療效的上下調(diào)基因及目標(biāo)分子。對(duì)照組用西醫(yī)常規(guī)治療（95%酒精）。

1.3 X-線影像評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1分：骨折斷端邊緣呈現(xiàn)出一種趨向性模糊，骨膜輕度反應(yīng)，無(wú)骨痂可見(jiàn)；2分：斷端邊緣模糊，骨膜反應(yīng)淺淡，骨痂少量，密度較淡，邊緣不整齊；3分：通過(guò)觀察可以發(fā)現(xiàn)仍然可以看到接近消失的斷端邊緣，骨膜反應(yīng)較深，骨痂增加，但缺損未完全填充，密度較深，邊緣呈現(xiàn)出清晰的狀態(tài)；4分：斷端邊緣完全消失，骨膜反應(yīng)密度與骨影相似，骨痂未填滿缺損，與骨皮質(zhì)密度相同并未相互連接；5分：骨折恢復(fù)良好，斷端邊緣完全消失[3-5]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。X 線影像評(píng)分等為計(jì)量資料，對(duì)其使用（±s）表示，組間的數(shù)據(jù)對(duì)比采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)，P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組造模后7-50d X 線分析

第7d 時(shí)，治療組與對(duì)照組影像學(xué)無(wú)明顯差異，治療組骨折端符合X-線影像評(píng)分中1分的標(biāo)準(zhǔn)；第15d 時(shí)，治療組有少量骨痂生長(zhǎng)，邊緣明顯模糊，而對(duì)照組無(wú)骨痂生長(zhǎng)；第21d 時(shí)，治療組骨折斷端骨密度有所增加，骨膜反應(yīng)漸深，生成較多骨痂，斷端邊緣仍可見(jiàn)，對(duì)照組僅有少量骨痂生長(zhǎng)；第30d 時(shí)，治療組骨密度進(jìn)一步增加，骨膜反應(yīng)較深，骨痂量已包繞骨折斷端，但骨折線清晰，對(duì)照組出現(xiàn)較多骨痂；第42d 時(shí)，治療組骨折線基本消失，骨膜密度接近骨質(zhì)，骨痂填滿骨缺損，骨小梁力學(xué)結(jié)構(gòu)漸為合理，對(duì)照組骨折線仍清晰，骨痂量較多，骨小梁雜亂；第50d 時(shí)X 線攝片，治療組大部分符合5分的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果:治療組與對(duì)照組在造模第7d 的X 影像學(xué)無(wú)明顯差異(P＞0.05)，在造模50d 時(shí)治療組骨痂明顯多于對(duì)照組(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組造模后7-50d X 線影像評(píng)分[（±s）/分]

表1 各組造模后7-50d X 線影像評(píng)分[（±s）/分]

組別 n 7d 14d 21d 30d 42d 50d治療組 68 1.67±0.52 2.28±0.39 3.44±0.46 4.00±0.50 4.20±0.30 4.50±0.50對(duì)照組 66 1.00±0.55 2.00±0.27 3.00±0.33 3.50±0.11 3.60±0.34 3.70±0.30骨折組 66 0.2±0.11 0.3±0.22 0.4±0.33 0.5±0.39 0.7±0.40 0.9±0.50 sham 組 66 0.1 0.3 0.4 0.5 0.7 0.9

2.2 基因表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物SD 大鼠治療組4只（骨折+骨康靈液，2 雌，2 雄，樣品編號(hào)A、B、C、D）；對(duì)照組4只（骨折，2 雌，2 雄，樣品編號(hào)E、F、G、H）。表2 中可見(jiàn)，篩選出上調(diào)基因650個(gè)，下調(diào)基因157個(gè)，差異基因總數(shù)807個(gè)。A vs E 比較，篩選出上調(diào)基因2149個(gè)，下調(diào)基因1418個(gè)，差異基因總數(shù)3567個(gè)，其他的依此類(lèi)推。

表2 兩組差異基因統(tǒng)計(jì)比較

3 討論

骨折愈合是一個(gè)相對(duì)較為復(fù)雜的過(guò)程，是骨折斷端間的一種組織修復(fù)反應(yīng)，在這個(gè)過(guò)程中，有較多的細(xì)胞及細(xì)胞因子參與其中，并起到協(xié)調(diào)的作用。而且該過(guò)程的實(shí)質(zhì)是骨細(xì)胞的再生以及骨折的完全修復(fù)，局部骨生長(zhǎng)因子在其中起著重要的調(diào)控作用，其對(duì)于愈合速度和質(zhì)量意義重大[6-10]，但最終的目標(biāo)是恢復(fù)骨骼的正常結(jié)構(gòu)和功能。如何促進(jìn)骨折愈合一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要課題，中醫(yī)藥促進(jìn)骨折愈合也是中醫(yī)骨傷學(xué)的一個(gè)重要研究方向。

在本研究中，治療組與對(duì)照組相比，在造模第7d X 影像學(xué)無(wú)明顯差異(P＞0.05)，在造模50 天治療組骨痂明顯多于對(duì)照組(P＜0.05)。骨康靈液制劑可促使骨痂生長(zhǎng)，骨康靈液對(duì)骨折愈合有修復(fù)作用[11,12]；基因芯片檢測(cè)篩選上下調(diào)基因結(jié)果已經(jīng)篩選出來(lái)了，而目標(biāo)基因和分子的篩選檢測(cè)實(shí)驗(yàn)還在準(zhǔn)備中。有待于下一步進(jìn)一步研究骨康靈液制劑發(fā)生療效作用的愈合機(jī)制。