張偉鵬，周道靖，林澤鵬，戴雪娟，柯 亮，謝欣宇，陳志群，程麗憲（通訊作者）

（廈門醫(yī)學(xué)院機(jī)能與臨床轉(zhuǎn)化福建省高校重點實驗室 福建 廈門 361023）

脂聯(lián)素（adiponectin, APN）是由脂肪細(xì)胞分泌的一種重要脂肪因子，有趣的是血清脂聯(lián)素水平與肥胖呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系。脂聯(lián)素除具有增加胰島素敏感性、抗炎、抗動脈粥樣硬化等作用[1]外，與生殖內(nèi)分泌也息息相關(guān)。我國婦女的不孕癥發(fā)生可能是多方面因素的作用結(jié)果。卵源性不孕目前是輔助和非輔助生殖醫(yī)學(xué)界面臨的一大難題，其原因可能與原始卵泡激活和卵泡發(fā)育過程的信號調(diào)控異常會導(dǎo)致早發(fā)性卵巢功能不足、卵泡生長遲緩、卵母細(xì)胞質(zhì)量下降、排卵障礙等卵源性不孕事件的發(fā)生有關(guān)。卵泡在發(fā)育的過程中主要受到下丘腦—垂體調(diào)控的激素和多種信號通路的作用[2-3]。脂聯(lián)素主要通過與兩種主要的受體AdipoR1和AdipoR2結(jié)合發(fā)揮多效作用，而且脂聯(lián)素與其受體在顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞中均有表達(dá)[4-5]。研究顯示脂聯(lián)素可能影響卵巢的類固醇生成、卵泡發(fā)育和排卵，其基因表達(dá)的變化受到與卵泡發(fā)育相關(guān)激素的影響。而且在接受FSH治療的婦女，其血清脂聯(lián)素水平與體內(nèi)獲得的卵母細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)[6]。這些研究表明，脂聯(lián)素可能與卵泡的發(fā)育成熟和閉鎖有關(guān)。

事實上，在脂聯(lián)素調(diào)節(jié)卵巢功能的潛在作用研究中尚存在一定的分歧。例如通過體外培養(yǎng)的豬顆粒細(xì)胞，脂聯(lián)素可以通過激活MAPK-ERK1/2途徑，使卵泡發(fā)育和類固醇合成酶相關(guān)基因的表達(dá)增加[7]。相反，另一項研究認(rèn)為在黃體生成素存在的情況下，脂聯(lián)素可以抑制體外牛卵泡膜細(xì)胞類固醇的生成[8]。因此，本次研究以脂聯(lián)素缺失小鼠為模型研究脂聯(lián)素水平降低對于卵巢卵泡發(fā)育成熟的影響，為臨床女性不孕提供新的致病基礎(chǔ)。

1.資料與方法

1.1 實驗動物

實驗中所有使用的小鼠均為雌性。脂聯(lián)素基因缺失小鼠由廣東工業(yè)大學(xué)的趙子建教授惠贈；清潔級C57BL/6小鼠購自福建吳氏動物實驗中心，于廈門大學(xué)動物實驗中心飼養(yǎng)繁殖。廈門醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會動物試驗倫理審批件（批件號：20190504001）。

1.2 實驗試劑

小鼠脂聯(lián)素血清ELISA試劑盒購自美國Millipore公司，蘇木素、伊紅購自珠海貝索公司，石蠟購自美國Sigma公司，石蠟塊切刀片購自德國Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠血清脂聯(lián)素水平鑒定 在2019年6月—2020年11月將健康繁育的20周齡雌性C57BL/6（WT），脂聯(lián)素缺失雜合（APN+/-）和脂聯(lián)素缺失純合（APN-/-）小鼠各組10只，摘眼球取血，并低溫分離血清，于-80℃保存樣本。對于不同基因型小鼠血清中脂聯(lián)素的濃度的測定，利用小鼠脂聯(lián)素ELISA試劑盒說明書上的方法進(jìn)行。

1.3.2 雌性小鼠生育率評估 健康繁育的8周齡WT,APN+/-和APN-/-雌鼠每種基因型各8只，與健康可育的C57BL/6雄性小鼠交配28周。并記錄28周期間每只雌鼠總產(chǎn)仔數(shù)。

1.3.3 卵巢蘇木精-伊紅（HE）染色和連續(xù)切片

卵巢固定于4%中性福爾馬林中過夜，常規(guī)石蠟包埋，于切片機(jī)上行厚為5μm的連續(xù)切片。間隔10張切片，取一張做HE染色，顯微鏡下計數(shù)每個卵巢所有HE切片中的原始卵泡、初級卵泡、竇前卵泡、竇狀卵泡和閉鎖卵泡的數(shù)量。卵泡總數(shù)包括原始卵泡、初級卵泡、竇前卵泡、竇狀卵泡和閉鎖卵泡[9]。計算方式為：各級卵泡所占比例=各級卵泡數(shù)目/卵泡數(shù)目×100%，上述所有卵泡類型均以卵泡總數(shù)的百分比表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

運用GraphPadPrism 5.0統(tǒng)計分析，計量資料以表示，組間行t檢驗。計數(shù)資料以n%表示，組間行χ2檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 脂聯(lián)素缺失小鼠血清脂聯(lián)素水平降低

利用小鼠血清脂聯(lián)素ELISA試劑盒分別檢測三組小鼠血清脂聯(lián)素的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)WT小鼠血清脂聯(lián)素水平為（13.37±1.358）ng/mL, APN+/-小鼠血清脂聯(lián)素濃度（5.481±0.7063）ng/mL約為WT小鼠的50%，而APN-/-小鼠血清中則無法檢測到脂聯(lián)素（圖1）。

圖1 三組小鼠血清脂聯(lián)素水平檢測（***P＜0.001）

2.2 脂聯(lián)素缺失純合雌鼠的生育能力受損

8周齡的三組雌鼠各10只，分別與12周齡C57/BL6雄鼠按照1：1的比例交配，周期為28周，統(tǒng)計28周內(nèi)各組雌鼠所生小仔數(shù)目。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，APN-/-雌鼠所生仔數(shù)平均為18.2土3.3只，與WT雌鼠（30.5土3.7只）相比產(chǎn)仔數(shù)明顯減少，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。雖然APN+/-雌鼠平均所生仔數(shù)與WT相比，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，但是數(shù)目卻有減少的趨勢，見表1。

表1 各組雌鼠生育力比較（ ± s，只）

表1 各組雌鼠生育力比較（ ± s，只）

與WT相比，*P＜0.05

組別 只數(shù) 產(chǎn)仔數(shù)WT 10 30.5±3.7 APN+/- 10 23.5±2.1 APN-/- 10 18.2±3.3*

2.3 脂聯(lián)素缺失小鼠卵泡發(fā)育異常

對不同基因型小鼠卵巢各級卵泡發(fā)育情況的分析結(jié)果顯示，WT小鼠卵巢各階段卵泡卵母細(xì)胞均清晰可見，其外具有完整的透明帶和排列規(guī)則的顆粒細(xì)胞。然而APN-/-小鼠的閉鎖卵泡顯著增加，腔前和腔卵泡數(shù)量顯著減少。具體為：APN-/-小鼠閉鎖卵泡的百分比為（19.6±0.9）%，顯著高于WT小鼠閉鎖卵泡的百分比（（8.7±0.6）%）（P＜0.001），此外，APN-/-組小鼠竇前卵泡和竇狀卵泡的比例分別為（14.7±1.1）%和（8.9±0.8）%，顯著低于WT小鼠的竇前卵泡（24.5±2.5）%和竇狀卵泡（13.6±0.3）%的比例（P＜0.01）。而在這三組基因型中，原始卵泡和初級卵泡的百分比則基本相同。

3.討論

脂肪組織對女性生育力調(diào)節(jié)起重要的作用，是因為它不僅可以進(jìn)行能量儲備，同時還具有內(nèi)分泌作用。脂聯(lián)素是一種重要脂肪因子，但肥胖癥患者的血清脂聯(lián)素水平反而是降低的。研究認(rèn)為脂聯(lián)素對于雌性卵泡發(fā)育，甚至是雄性的精子獲能方面均有保護(hù)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素缺失可導(dǎo)致雌性小鼠生育力下降，特別是APN-/-組，每只雌鼠的產(chǎn)仔數(shù)量均顯著減少。與WT組相比，APN-/-組閉鎖卵泡比例明顯增加，同時竇前卵泡和竇狀卵泡比例顯著減少。說明脂聯(lián)素水平的降低可以導(dǎo)致雌性生育力下降，脂聯(lián)素對卵泡的發(fā)育成熟具有保護(hù)作用。卵泡發(fā)育是一個復(fù)雜過程，由多種激素控制，如雌激素、卵泡刺激素、黃體生成素和孕激素。研究表明可能影響卵巢的類固醇生成、卵泡發(fā)育和排卵，其基因表達(dá)的變化受到與卵泡發(fā)育相關(guān)激素的影響。而且在接受FSH治療的婦女，其血清脂聯(lián)素水平與體內(nèi)獲得的卵母細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)。雖然在月經(jīng)周期中脂聯(lián)素濃度沒有變化，但在雌二醇和黃體酮的產(chǎn)生、顆粒細(xì)胞增殖、卵母細(xì)胞成熟和死亡中發(fā)揮重要作用。這些研究表明，脂聯(lián)素可能與卵泡的發(fā)育成熟和閉鎖有關(guān)。因此我們推測，脂聯(lián)素缺失導(dǎo)致的卵泡發(fā)育不良可能與卵泡發(fā)育相關(guān)激素水平的下降有關(guān)。與人類不同，小鼠有很高的繁殖能力，而在我們的研究中APN-/-小鼠表現(xiàn)出明顯的生育力降低。因此，我們推斷維持較高的血清脂聯(lián)素水平對人類女性生育力尤其重要，其具體的作用機(jī)制也將是我們下一步研究的重點。