黃丹娜 陳 路

(1 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱市 150040，電子郵箱:dhuang202@126.com；2 廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，西南瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室，南寧市 530023)

新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)疫情的迅速蔓延給人類社會帶來巨大的威脅，其已成為當今全球關(guān)注的主要問題。目前尚無針對COVID-19的特效藥物，因此對現(xiàn)有藥物的重新利用研究可能會為遏制這一流行病帶來希望[1]。COVID-19的臨床表現(xiàn)主要為發(fā)熱、干咳和乏力[2]，在中醫(yī)學(xué)中其屬于“寒疫”[3]“寒濕疫”[4]“濕毒疫”[5]病范疇。張伯禮院士提出，應(yīng)在化濕解毒、辟穢化濁的基礎(chǔ)上對COVID-19患者因證施治[4]。芳香化濕之品具有祛濁避穢功效，因此古法防治瘟疫多用香囊[4]。八角茴香是一種藥食同源的常用香料，為木蘭科植物八角茴香的干燥成熟果實，性味辛溫，歸肝、腎、脾、胃經(jīng)，有溫陽散寒、理氣止痛之功效[6]。八角茴香具有抗菌、抗病毒和抗氧化的特性，不僅長期在我國的中醫(yī)藥領(lǐng)域中得到應(yīng)用，在印度傳統(tǒng)醫(yī)藥阿育吠陀體系也被用于治療腸胃氣脹、痢疾、咳嗽、哮喘、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病[7]。八角茴香主要含揮發(fā)油，是其發(fā)揮藥效的重要成分，也是其最有商業(yè)價值的部分[8]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是近年來新興的一門學(xué)科，是基于系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)的研究方法，其將生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)與藥物作用網(wǎng)絡(luò)整合，在藥物與疾病和靶點之間構(gòu)建“多成分、多靶點、多途徑”協(xié)同作用關(guān)系，從而揭示藥物治療疾病的作用機制[9-10]。本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合分子對接方法，研究八角茴香揮發(fā)油有效成分及其靶點、疾病及生物通路的相互作用關(guān)系，預(yù)測其干預(yù)COVID-19的可能分子機制，為后續(xù)藥物研究提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 八角茴香揮發(fā)油主要活性成分與靶點的篩選 本課題組前期已采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對八角茴香揮發(fā)油的成分及含量進行了分析[11]，從該實驗結(jié)果中選取了4個相對含量≥1%且具有生物活性的化合物作為研究對象，分別是松油烯、萜品油烯、桉葉油醇、反式茴香腦(見表1)。通過TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)和TCMID(http://119.3.41.228:8000/tcmid/)數(shù)據(jù)庫，檢索主要活性成分的靶蛋白，并剔除沒有靶點的化學(xué)成分。同時，通過UniProt數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)，限定物種為“human”，查詢靶蛋白對應(yīng)的基因，進行基因名稱標準化并去重。

表1 八角茴香揮發(fā)油4個活性成分的信息

1.2 八角茴香揮發(fā)油干預(yù)COVID-19的作用靶點預(yù)測 以Corona Virus Disease 2019和COVID-19為檢索詞，分別在GeneCards(www.genecards.org)、OMIM(https://omim.org/)和CTD(http://ctdbase.org/)數(shù)據(jù)庫進行檢索，檢索時間為建庫至2020年7月31日。將3個數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果合并，去除重復(fù)，獲取COVID-19相關(guān)靶點，利用微生信線上軟件(http://www.bioinformatics.com.cn/)將獲取的靶點與八角茴香揮發(fā)油化學(xué)成分靶點映射，得到共同靶點作為八角茴香揮發(fā)油干預(yù)COVID-19的潛在作用靶點。將八角茴香揮發(fā)油的活性成分與其干預(yù)COVID-19的潛在作用靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件，構(gòu)建其成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)。

1.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 將八角茴香揮發(fā)油干預(yù)COVID-19的潛在作用靶點導(dǎo)入STRING在線分析系統(tǒng)(https://string-db.org)，種屬選擇“Homo sapiens”，最低置信度分值設(shè)置為0.4，獲得蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)關(guān)系，以TSV文件格式保存。再將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件進行可視化處理和拓撲分析，篩選關(guān)鍵靶點。

1.4 靶點的富集分析 將八角茴香揮發(fā)油干預(yù)COVID-19的潛在作用靶點導(dǎo)入Metascape在線分析系統(tǒng)(http://metascape.org)進行基因富集分析，閾值設(shè)定為P≤0.05，得到基因本體論(Gene Ontology，GO)功能富集分析結(jié)果和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析結(jié)果。

1.5 主要活性成分與靶點分子對接驗證 采用SwissDock在線軟件(http://www.swissdock.ch/)進行分子對接，使用UCSF Chimera軟件對分子結(jié)構(gòu)進行處理，評價活性成分與新型冠狀病毒3CL水解酶(Mpro)、新型冠狀病毒受體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)之間的對接效果，選取抗病毒藥利巴韋林作為對比；選取PPI網(wǎng)絡(luò)中Degree值排名前2的兩個關(guān)鍵靶點(PTGS2、JUN)，分析活性成分與關(guān)鍵作用靶點之間的對接效果。

2 結(jié) 果

2.1 八角茴香揮發(fā)油的活性成分及靶點 利用TCMSP和TCMID在線數(shù)據(jù)庫，獲得松油烯、萜品油烯、桉葉油醇、反式茴香腦這4種活性成分所對應(yīng)的靶蛋白共76個，輸入UniProt數(shù)據(jù)庫進行基因名稱標準化并刪除重復(fù)值，得到52個靶點。

2.2 八角茴香揮發(fā)油干預(yù)COVID-19的作用靶點 從GeneCards、OMIM和CTD數(shù)據(jù)庫中篩選出與COVID-19相關(guān)的基因共5281個，與八角茴香揮發(fā)油活性成分的52個靶點相映射，得到 26個八角茴香揮發(fā)油干預(yù)COVID-19的潛在作用靶點(圖1-A)。將疾病、活性成分、潛在作用靶點導(dǎo)入 Cytoscape軟件構(gòu)建活性成分—靶點—疾病網(wǎng)絡(luò)(圖1-B)。

圖1 八角茴香揮發(fā)油與COVID-19之間的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析 利用STRING 數(shù)據(jù)庫，針對八角茴香揮發(fā)油干預(yù)COVID-19的26個潛在作用靶點構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(圖2-A)，尋找靶點之間的直接及間接作用關(guān)系。利用Cytoscape軟件分析和處理數(shù)據(jù)(圖2-B)，網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點的顏色深淺和大小與Degree值成正比，Degree值越大表示參與的生物功能越多；前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)、JUN、核受體亞家族3C組成員1(nuclear receptor subfamily 3 group C member 1，NR3C1)、一氧化氮合酶3(nitric oxide synthase 3，NOS3)、RELA、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)9、MMP2、腎素等靶點的Degree值≥10，明顯高于平均值7.77，因此可能是關(guān)鍵作用靶點。

圖2 潛在作用靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 靶點富集分析 由GO功能富集分析結(jié)果(圖3)可知，生物過程與有機羥基化合物轉(zhuǎn)運、對有毒物質(zhì)的反應(yīng)、胚胎著床、行為、神經(jīng)遞質(zhì)代謝過程等相關(guān)；細胞組分與細胞膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、微小洞穴、質(zhì)膜筏等相關(guān)；分子功能與核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體、RNA聚合酶Ⅱ 近端啟動子序列特異性DNA結(jié)合、近端啟動子序列特異性DNA結(jié)合等相關(guān)。KEGG通路富集分析結(jié)果(圖4)顯示，差異基因主要富集在癌癥通路、白細胞介素17信號通路、Th17細胞分化、腫瘤壞死因子信號通路、可卡因成癮、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、小細胞肺癌通路、Th1和Th2細胞分化通路、恰加斯病(美洲錐蟲病)、T細胞受體信號通路等。

圖3 GO功能富集分析結(jié)果

圖4 KEGG通路富集分析(顯示前20條結(jié)果)

2.5 分子對接結(jié)果 結(jié)果顯示，八角茴香揮發(fā)油有效成分與目標受體之間最低結(jié)合能均小于-5.0 kCal/mol，表明均有較好的對接活性[12-13]，見表2。在4個活性成分中，桉葉油醇與PTGS2、JUN、ACE2的對接效果最好，松油烯與Mpro的對接效果最好，見圖5。

表2 八角茴香揮發(fā)油主要活性成分與相關(guān)蛋白的對接效能(kCal/mol)

圖5 分子對接結(jié)構(gòu)圖

3 討 論

八角茴香是芳香類藥用植物，性味辛溫，而辛入肺，辛能通氣、開腠理?，F(xiàn)代藥理研究顯示植物揮發(fā)油在抗炎、抗菌、抗病毒等方面有優(yōu)勢[14]，因此芳香類中藥可以用于改善COVID-19導(dǎo)致的呼吸道及消化道的有關(guān)癥狀。有研究表明，植物揮發(fā)油可與病毒包膜直接相互作用并減輕宿主的炎癥反應(yīng)，例如桉葉油醇[15]；萜品油烯和松油烯為單萜物質(zhì)，均具有較強的抗氧化性[16-17]；而作為八角茴香揮發(fā)油的主要成分，反式茴香腦也已被證實具有抑制病毒的活性[18]。因此，本研究選取了八角茴香揮發(fā)油中4個活性化合物——松油烯、萜品油烯、桉葉油醇、反式茴香腦進行分析。

本研究結(jié)果顯示，八角茴香揮發(fā)油干預(yù)COVID-19的主要作用靶點為PTGS2、JUN、NR3C1、NOS3、RELA、MMP9、MMP2、腎素等。其中，PTGS2又名環(huán)氧化酶2，是引起炎性反應(yīng)的關(guān)鍵酶之一[19]，可通過直接調(diào)控p53功能活性抑制DNA損傷誘導(dǎo)的細胞凋亡[20]。近期一項對COVID-19患者肺形態(tài)蛋白質(zhì)組學(xué)和致病性特征研究顯示，在COVID-19患者肺的代表性切片中可觀察到環(huán)氧化酶2在肺泡細胞中表達[21]。JUN又稱為轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物 AP-1，是由Jun和Fos等蛋白亞家族形成的二聚體轉(zhuǎn)錄因子，主要參與細胞增殖、轉(zhuǎn)化和死亡[22]。AP-1在前列腺癌、甲狀腺癌、胰腺癌等腫瘤中表達失調(diào),參與腫瘤形成和發(fā)展。另外，AP-1的過度活化也已被確定為哮喘發(fā)病過程中糖皮質(zhì)激素抵抗的機制[23]。而在炎癥反應(yīng)中，糖皮質(zhì)激素可以抑制促炎性細胞因子的產(chǎn)生并刺激抗炎細胞因子的產(chǎn)生，其作用由NR3C1基因編碼的糖皮質(zhì)激素受體介導(dǎo)[24]。糖皮質(zhì)激素受體還能與核因子κB、AP-1作用，從而抑制這些轉(zhuǎn)錄因子在炎癥反應(yīng)過程中對促炎靶基因的轉(zhuǎn)錄[25]。RELA為核因子κB p65亞單位，可對核因子-κB通路進行精準調(diào)控，在核因子κB介導(dǎo)的炎癥、癌癥等多種疾病發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[26]。MMP家族是鋅依賴性的內(nèi)肽酶，在炎癥、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移以及通過降解細胞外基質(zhì)和基底膜生成血管過程中發(fā)揮重要作用[27]。NOS3基因多態(tài)性與一些由血管病變引起的疾病密切相關(guān)，如急性心肌梗死、原發(fā)性高血壓、冠心病和股骨頭缺血性壞死等[28]。腎素是研究原發(fā)性高血壓病因?qū)W的一個靶標基因，腎素將血管緊張素原裂解為血管緊張素1，進而被催化為血管緊張素2，從而影響血壓和電解質(zhì)平衡[29]。以上提示，八角茴香揮發(fā)油的活性成分可能通過抗炎、抗癌、影響心血管系統(tǒng)等對COVID-19起到干預(yù)作用。

GO功能富集分析結(jié)果顯示，八角茴香揮發(fā)油可能在細胞膜筏、膜微區(qū)等位置，通過有機羥基化合物轉(zhuǎn)運、對有毒物質(zhì)反應(yīng)等生物學(xué)過程與核受體及轉(zhuǎn)錄因子等結(jié)合而發(fā)揮作用。KEGG富集結(jié)果顯示，八角茴香揮發(fā)油可能主要是通過癌癥通路作用于PTGS2、JUN、核因子κB相關(guān)蛋白、MMP家族(MMP9、MMP2)等靶點達到干預(yù)COVID-19 的目的。在前20個主要富集的KEGG通路中，涉及了與癌癥相關(guān)的信號通路如癌癥通路、腫瘤壞死因子信號通路、小細胞肺癌、前列腺癌等，以及白細胞介素17信號通路、Th17細胞分化、Th1和Th2細胞分化、核因子κB信號通路、T細胞受體信號通路、B細胞受體信號通路等與免疫和炎癥相關(guān)的多條通路，還涉及其他如乙型肝炎、恰加斯病(美洲錐蟲病)、利什曼病等傳染病的信號通路。臨床研究顯示，COVID-19重癥患者出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征的原因可能與細胞因子風(fēng)暴有關(guān)，細胞因子風(fēng)暴表現(xiàn)為過激的炎癥反應(yīng)，COVID-19患者體內(nèi)可能存在Th1與Th2反應(yīng)失衡[30]。因此，除控制病毒復(fù)制外，阻止COVID-19患者出現(xiàn)細胞因子風(fēng)暴也是治療的關(guān)鍵。另外，臨床上發(fā)現(xiàn)部分新型冠狀病毒感染患者出現(xiàn)了心肌損傷臨床征象，發(fā)病機制可能與病毒感染直接引起心肌細胞損傷、細胞因子風(fēng)暴以及ACE2等有關(guān)[31]。ACE2是新型冠狀病毒結(jié)合的靶標蛋白，我國研究人員發(fā)現(xiàn)許多腫瘤中出現(xiàn)ACE2突變、拷貝數(shù)異常擴增等多種遺傳學(xué)異常；同時，ACE2在肺腺癌、胰腺癌、胃腺癌等惡性腫瘤中表達顯著上調(diào)并伴有ACE2啟動子區(qū)DNA低甲基化[32]。由此可見，基因富集分析與PPI網(wǎng)絡(luò)拓撲分析的結(jié)果相符。本研究認為八角茴香揮發(fā)油干預(yù)COVID-19的可能機制主要是通過抗腫瘤、抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、保護心血管等途徑發(fā)揮作用。

本研究通過分子對接分析八角茴香揮發(fā)油有效成分分別與關(guān)鍵作用靶點PTGS2和JUN的結(jié)合能，以及與SARS-CoV-2靶蛋白3CL水解酶和ACE2的結(jié)合活性，各分子對接結(jié)果的最低結(jié)合能均小于-5.0 kCal/mol，說明分子對接穩(wěn)定，并有可能影響新型冠狀病毒感染和復(fù)制的潛力。八角茴香揮發(fā)油可通過協(xié)同作用以發(fā)揮更大的防治效果，或者作為輔助藥用于增強其他抗病毒藥的作用，或者用于緩解COVID-19的癥狀。

綜上所述，八角茴香揮發(fā)油活性主要通過抗腫瘤、抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、保護心血管等通路，作用于PTGS2、JUN等關(guān)鍵作用靶點達到防治COVID-19的作用，這或可為八角茴香揮發(fā)油的后續(xù)深入研究以及防治COVID-19天然產(chǎn)物的篩選提供思路和方法，但結(jié)果的準確性仍需要臨床及基礎(chǔ)實驗研究進一步驗證。