伊 冉，黃曉琴*，姜忠磊，楊小青，于 敏，劉亭亭

1.山東農業(yè)大學 園藝科學與工程學院，山東 泰安 271018；2.日照市嵐山區(qū)茶業(yè)技術推廣服務中心，山東 日照 276800；3.山東泰山茶溪谷農業(yè)發(fā)展有限公司，山東 泰安 271022

γ-氨基丁酸（GABA）是一種具保健作用的非蛋白質氨基酸，具有降血壓、降低膽固醇、改善心率和睡眠、增強記憶力、抗焦慮、抗疲勞[1-8]等作用。自1987年日本開始研究γ-氨基丁酸茶葉以來，國內的許多專家也相繼開展高γ-氨基丁酸茶葉的研究，大多是通過一些厭氧技 術[1、9]的處理來提高茶葉中γ-氨基丁酸的含量，而針對茶葉自身中γ-氨基丁酸含量及其影響因素的研究較少。

目前，對茶葉中γ-氨基丁酸（GABA）的研究多集中在白茶[10-11]、綠茶和紅茶[12]，近幾年也有對巖茶[13]等的研究，而對黃茶的研究還比較少見。黃茶被稱為最適合人體飲用的茶[14]，近年來隨著消費水平的提高和消費習慣的改變，黃茶也逐漸興起。黃茶由于其獨特的“悶黃”工序成就了“黃湯黃葉”的品質特點，而在黃茶“悶黃”工序過程中，本身就存在一定的厭氧環(huán)境，本文擬對影響黃茶中γ-氨基丁酸含量的因素進行研究，通過設置不同的工藝參數（如搖青時間、悶黃時間、悶黃溫度等）、采摘不同季節(jié)茶樹鮮葉加工成黃茶，比較不同條件下黃茶γ-氨基丁酸（GABA）含量的變化，為探究黃茶中γ-氨基丁酸（GABA）含量及其影響因素提供參考，為開發(fā)高品質且具一定保健功能的黃茶提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用鮮葉原料均為一芽二葉初展，品種為御金香，采自泰安市泰山茶溪谷農業(yè)發(fā)展有限公司茶園。

1.2 實驗所用試劑

十二水磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀，茚三酮，氯化亞錫；17種氨基酸標準品（sigma，純度≥99.9%），HPLC級乙腈，鹽酸（國藥集團化學試劑有限公司，優(yōu)級純，36.0% ～ 38.0%），正亮氨酸，三乙胺（國藥集團化學試劑有限公司，優(yōu)級純，純度≥99.0%），異硫氰酸苯酯（sigma，純度≥99.9%），正己烷（國藥集團化學試劑有限公司，優(yōu)級純，純度≥97.0%），冰醋酸（生工，純度≥98%），無水乙酸鈉（國藥集團化學試劑有限公司，優(yōu)級純，純度≥99%）。

1.3 試驗儀器

分析天平；島津UV－2450型分光光度計；RIGOL L3000高效液相色譜儀（紫外檢測器波長 254 nm）。

1.4 試驗處理與方法

本試驗黃茶加工工藝流程為增加了搖青工序的新工藝：鮮葉→攤放→搖青→殺青→揉捻→悶黃→干燥。通過預實驗確定黃茶加工工藝為：搖青時間2 min；滾筒殺青溫度260℃；揉捻 20 min；40℃進行悶黃 14 h；干燥溫度為初烘130℃，足干90℃，80℃提香2 h。各試驗樣品工藝參數在此基礎上進行不同的變量設置。

搖青時間處理：選用7月份采摘的御金香一芽二葉初展鮮葉作為原料，搖青時間分別設置為 1 min、2 min、3 min，其他加工參數同預試驗工藝進行處理。

悶黃時間處理：選用7月份采摘的御金香一芽二葉初展鮮葉作為原料，悶黃時間分別按梯度設置為 4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h，其他加工參數同預試驗工藝處理。

悶黃溫度處理：選用7月份采摘的御金香一芽二葉初展鮮葉作為原料，悶黃溫度分別設置為35℃、40℃、45℃，其他加工參數同預試驗工藝進行處理。

不同季節(jié)黃茶加工試驗：選用5月份、7月份、9月份采摘的御金香一芽二葉初展鮮葉作為原料，加工流程同預試驗工藝進行處理。

1.5 測定條件與方法

游離氨基酸測定方法參照GB/T 8314—2013。GABA測定方法：γ-氨基丁酸（GABA）測定采用HPLC法，色譜柱為賽分Amethyst C18-H（250 mm*4.6 mm, 5 μm）。

供試液的準備：0.1 mol/L鹽酸：取900 uL濃鹽酸加入100 mL水，混勻；三乙胺乙腈溶液：取2.8 mL三乙胺加入17.2 mL乙腈，混勻；異硫氰酸苯酯乙腈溶液：取125 uL異硫氰酸苯酯加入10 mL乙腈，混勻；正亮氨酸內標溶液：稱取正亮氨酸2 mg，加入0.1mol/L鹽酸水溶液2 mL 溶解，混勻。

前處理：稱取約0.1 g樣品，加入1 mL水，研磨成漿后移入EP管中，過夜浸提，10000 g離心，取上清，過濾膜待衍生。

氨基酸的衍生：取上述待衍生的清液200 μL，氨基酸標準品溶液200 μL，分別置于2 mL EP管中；往每個離心管中準確加入正亮氨酸內標溶液20 μL；依次向每個EP管中加入三乙胺乙腈溶液 100 μL（確保 PH > 7）和異硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL，混勻后25℃下放置1 h。然后加入正己烷400 μL至每個EP管中，搖晃后放置10 min。取下層溶液，0.45 μm針式過濾器過濾后上機檢測。

流動相：流動相A：稱取7.6 g無水乙酸鈉，加水925 mL,溶解后用冰醋酸調節(jié)pH至6.5，然后加入乙腈70 mL,混勻，用0.45 μm濾膜過濾。流動相B：80%乙腈水溶液。

色譜條件：進樣量10 μL；流速1.0 mL/min； 柱溫40℃；走樣時間為45 min。

1.6 數據處理

采用Excel 2003統(tǒng)計分析軟件進行基礎的數據整理與收集，并利用 IBM SPSS Statistics 26軟件對數據進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 HPLC 法測定 GABA 結果

在試驗方法中所述的高效液相色譜條件下，對 GABA 的單標和待測樣品（春季“御金香”黃茶樣品）進行測定，GABA標樣和待測樣品經衍生后獲得的圖譜如下圖1、圖2所示。由圖1 GABA標品譜圖所知，出峰時間在12.26 min左右。在此色譜條件下，經處理后的待測樣品在12.32 min左右時檢測到GABA（圖2）。

圖1 實驗標品HPLC譜圖Figure 1 HPLC spectrum of experimental standard

圖2 春季御金香黃茶樣GABA HPLC譜圖Figure 2 HPLC spectrum of GABA in Yujinxiang yellow tea in spring

表1 流動相梯度Table 1 Gradient of mobile phase

2.2 不同搖青時間對黃茶GABA含量的影響

為使加工成的黃茶更有特色，香氣顯花香，在傳統(tǒng)黃茶加工工藝的基礎上，增加了搖青工藝，并設置 1 min、2 min、3 min 的不同搖青時間處理。通過對加工成的干茶中游離氨基酸總量和γ-氨基丁酸（GABA）含量的測定，結果表明（表2）：游離氨基酸含量與搖青時間成反 比，在搖青1 min時含量最高，但與搖青2 min處理無顯著差異，二者與搖青3 min處理有顯著差異；γ-氨基丁酸（GABA）含量隨著搖青時間增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在搖青2 min時含量最高，各處理之間差異顯著。

表2 不同搖青時間黃茶游離氨基酸、GABA含量Table 2 Content of free amino acids and GABA in yellow tea at different time of shaking

2.3 不同悶黃時間對黃茶GABA含量的影響

結果表明（表3）：游離氨基酸含量隨著悶黃時間加長呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，8 h、10 h與12 h樣品間含量無顯著差異，在悶黃12 h左右時含量最高。γ-氨基丁酸（GABA）含量隨著悶黃時間延長呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在6 h左右出現(xiàn)最大值，與其他組之間有著顯著差異，且其他各處理間均有顯著差異。從數據分析可得，在悶黃 4 ～ 6 h 這一范圍內，γ-氨基丁酸（GABA）含量較其他時間段有著明顯的增加趨勢，而6 ～ 8 h時段相對其他時間段含量要高。

表3 不同悶黃時間黃茶游離氨基酸、GABA含量Table 3 Content of free amino acids and GABA in yellow tea at different time of yellowing

2.4 不同悶黃溫度對黃茶GABA含量的影響

結果表明（表4），游離氨基酸的含量與悶黃溫度成反比，在35℃含量最高，各處理之間有顯著差異；而γ-氨基丁酸（GABA）呈現(xiàn)相同變化趨勢，各處理之間存在顯著差異。

表4 不同悶黃溫度黃茶游離氨基酸、GABA含量Table 4 Content of free amino acids and GABA in yellow tea at different temperature of yellowing

2.5 不同季節(jié)鮮葉對黃茶GABA含量的影響

結果表明（表5），游離氨基酸總量隨著季節(jié)變化逐漸降低，各季節(jié)之間存在明顯差異，春季含量最高。γ-氨基丁酸（GABA）含量在三個季節(jié)樣本之間均有顯著差異，且春季含量最高，夏季最低，含量隨季節(jié)變化較為明顯。

表5 不同季節(jié)黃茶游離氨基酸與GABA含量Table 5 Content of free amino acids and GABA in yellow tea in different seasons

3 討論

研究表明，搖青能夠改變鮮葉內酶的活性，增加水浸出物含量，并產生更多的芳香物質[15]。因此，近年來，在許多茶的加工工藝中都引入了搖青工藝，如花香型綠茶、黃茶、紅茶、白茶等的生產[16-19]。通過本試驗的研究發(fā)現(xiàn)，搖青在增加茶葉香氣物質的同時，還能夠提高黃茶中γ-氨基丁酸（GABA）的含量。劉冠卉[11]等人在研究桑葉紅茶時曾提出，搖青工藝增大葉片之間的摩擦振動，能夠給葉片造成輕微的機械損傷，從而激活谷氨酸脫羧酶（GAD）活性。GAD是催化谷氨酸生成γ-氨基丁酸的催化酶，是一種逆境酶,植物在低溫、厭氧及機械損傷等逆境條件下可激活酶促反應[20]，而搖青處理造成的機械損傷打破了底物與酶之間的間隔使得接觸增大、加速葉片的無氧呼吸和內部環(huán)境的酸化，同時，搖青造成的振蕩促進了葉片內水分、物質的運輸與重新分布，這些動態(tài)反應均有利于GAD的酶促反應，進而使得葉片中GABA含量增加[21]。但在搖青時也需注意，雖然隨著搖青時間的增加，GABA含量會有上升過程，但超過閾值會產生相反效果，且因原料嫩度較低，易造成葉底紅邊，同時也會對滋味與香氣產生不良影響，造成茶葉品質的降低，所以搖青時間也不可一味的增加，要根據實際情況進行調整。

本試驗選用濕悶工藝進行悶黃，文帥[22]等人在對悶黃工藝進行研究時發(fā)現(xiàn)濕悶有利于游離氨基酸含量的增加。范方媛[23-24]等人在研究悶黃工藝因子對黃茶品質滋味影響時發(fā)現(xiàn)，γ-氨基丁酸（GABA）含量會隨著悶黃溫度的提高而增加，本文的試驗結果與其相一致。一些研究表明，在悶黃溫度變化上，隨著悶黃時間的增加，前期大分子蛋白質物質在濕熱和酶促作用下水解[25]，導致氨基酸含量的增加，而后期氨基酸和可溶性糖等物質結合發(fā)生孟拉德反應[26-28]，含量會相應的減少，本文試驗結果也與此相一致。且有研究顯示，雖然多酚氧化酶等酶類在殺青之后會大幅下降, 但隨著悶黃過程的深入,多酚氧化酶、過氧化氫酶和纖維素酶的活性會顯著增加，增加至一定程度, 隨后逐步減少[28]，相應地在GABA合成機制中起到重要作用的谷氨酸脫羧酶（GAD）可能也具有同種變化規(guī)律，從而造成其含量在增加到某一時刻后開始減少，從而使得其GABA含量也呈現(xiàn)相同的變化規(guī)律。

與其他茶樹品種相比，“御金香”呈現(xiàn)出明顯的品種特點，“御金香”是典型的光照敏感型黃色系白化茶品種[29-30]，以氨基酸含量高、酚氨比低為優(yōu)勢，成為近些年來綠茶鮮葉原料的熱門選擇，而將其作為黃茶加工的原料還少見報道。在本次試驗中發(fā)現(xiàn)，采摘自春季的“御金香”鮮葉所加工成的黃茶，氨基酸總量與γ-氨基丁酸（GABA）的含量與其他季節(jié)差異顯著，達到所有樣本的最大值，品種優(yōu)勢極為明顯，加上其特殊的鮮葉色澤特點，不失為黃茶原料的新選擇，為高品質黃茶的加工提供了新思路。Zhao[31]等人對常規(guī)白茶、綠茶、烏龍茶和黑茶中的γ-氨基丁酸（GABA）含量做了測定，其中白茶含量最高，為 45.7 mg/100 g[32]，而本研究中利用春季御金香茶樹品種加工成的黃茶中γ-氨基丁酸（GABA）的含量為121.24 mg/100 g，遠遠高于常規(guī)工藝中加工成的各類茶，可見利用高氨基酸含量的茶樹品種加工γ-氨基丁酸茶具有一定優(yōu)勢。由于本試驗其他工序處理選用的鮮葉均采自夏季，氨基酸含量明顯下降，這是由于山東地區(qū)夏季日照強，茶園通常都會做遮蔭處理，而“御金香”茶樹的另一特征是遮蔭處理后氨基酸含量明顯下降，從而造成其結果的出現(xiàn)。

本次研究發(fā)現(xiàn)，鮮葉采摘季節(jié)與加工工藝均會對成品黃茶中γ-氨基丁酸（GABA）的含量產生不同程度的影響。引入搖青工藝、選擇適當的悶黃時間和悶黃溫度都有利于黃茶中γ-氨基丁酸（GABA）含量的增加。在本研究的基礎上，如何進行高γ-氨基丁酸（GABA）含量黃茶的生產是值得進一步研究的內容，但本研究的試驗結果也為高γ-氨基丁酸（GABA）含量黃茶的生產提供了一定理論基礎。