張 旺 冼俊霖 孫 超 王春明 石 麗 于為常

CRISPR/Cas9編輯花生FAD2基因研究

張 旺 冼俊霖 孫 超 王春明 石 麗 于為常*

深圳大學(xué)生命與海洋學(xué)院/ 廣東省植物表觀遺傳學(xué)重點實驗室, 廣東深圳 518071

油酸脫氫酶(D12FAD或FAD2)是催化油酸(OA)的C12位上脫氫生成雙不飽和亞油酸(LA)的關(guān)鍵酶, 它控制油酸、亞油酸的含量及其比值(O/L)。研究表明,是油酸生成亞油酸的關(guān)鍵基因, 決定花生種子中油酸和亞油酸的相對含量。本研究根據(jù)基因序列, 設(shè)計了相應(yīng)sgRNA序列, 并構(gòu)建了旨在敲除FAD2A和FAD2B兩個花生油酸脫氫酶的CRISPR/Cas9基因編輯載體。經(jīng)花生基因轉(zhuǎn)化后, 通過對轉(zhuǎn)基因花生突變位點基因組序列分析找出基因突變體。對靶基因分析發(fā)現(xiàn), 16株轉(zhuǎn)基因花生含有29個基因突變, 其中16個突變引起蛋白質(zhì)序列變化; 11株轉(zhuǎn)基因花生含有30個基因突變, 其中17個突變引起蛋白質(zhì)序列變化。FAD2A和FAD2B蛋白質(zhì)序列的變化可影響花生油酸脫氫酶的活性, 改變油酸催化脫氫, 使亞油酸合成受阻, 油酸含量增加。本研究為研究花生脂肪酸合成及高油酸花生育種提供了寶貴的基因突變體材料。

花生; 油酸; 亞油酸; FAD2; 基因組編輯

花生(L.)又名落花生、長生果, 主要生長在半干旱和熱帶國家, 是我國產(chǎn)量豐富、食用廣泛的一種堅果[1]。同時, 它是世界上重要的食用植物油和蛋白質(zhì)來源, 在全球油脂生產(chǎn)中具有舉足輕重的地位。目前, 我國花生產(chǎn)量約占油料總產(chǎn)量的一半, 是我國產(chǎn)值最大的油料作物[2-3]。營養(yǎng)學(xué)家將花生評為“A+”級別的農(nóng)作物, 原因是花生包含40%~56%的油脂、20%~30%的蛋白質(zhì)、10%~20%的碳水化合物、以及維生素E、煙酸、多酚、鈣、鎂、磷、鋅、鐵、鉀、核黃素、硫胺素、植物甾醇和膳食纖維等多種營養(yǎng)成分, 對平衡膳食、改善人們的營養(yǎng)與健康狀況具有重要作用[4-5]。

花生油主要由單不飽和脂肪酸油酸(oleic acid, C18:1, Δ9)、多不飽和脂肪酸亞油酸(linoleic acid, C18:2, Δ9, Δ12)、飽和脂肪酸棕櫚酸(palmitic acid, C16:0)和硬脂酸(stearic acid, C18:0)組成。不飽和脂肪酸約為80%, 其中油酸36%~67%、亞油酸15%~43%, 飽和脂肪酸占20%, 其中棕櫚酸6%~11%、硬脂酸2%~6%、花生酸5%~7%、山崳酸2%~3%。脂肪酸的組成是決定花生油質(zhì)量的重要因素, 也是衡量其品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)[6]。其中油酸和亞油酸的含量及比值(油/亞比)對花生及其制品的穩(wěn)定性起決定性作用。亞油酸屬多不飽和脂肪酸, 其油酰殘基易氧化而導(dǎo)致油脂腐敗劣變, 嚴(yán)重影響油脂儲存期, 而油酸分子結(jié)構(gòu)只含有1個不飽和鍵, 化學(xué)結(jié)構(gòu)相對比較穩(wěn)定, 抗氧化能力強[7]。油酸的自氧化性比亞油酸穩(wěn)定10倍, 油酸/亞油酸(O/L)比例高的花生更耐儲存, 在精煉、儲藏和煎炸時不易變質(zhì), 與普通花生相比, 高油酸含量的花生制品具有更長的氧化誘導(dǎo)期和貨架期[8]。在食品健康越來越受重視的今天, 高油酸比例的食用油是眾多食品加工和非飽和脂肪酸使用的一個良好選擇, 其開發(fā)和應(yīng)用的前景十分廣闊。

油酸脫氫酶(Δ12FAD或FAD2)是催化油酸的C12位上脫氫生成雙不飽和亞油酸的關(guān)鍵酶[9-10], 它控制油酸、亞油酸的含量及其比值(O/L)。在花生中該酶由基因編碼。花生高油酸性狀主要由基因突變產(chǎn)生,基因編碼區(qū)序列變化所引起編碼蛋白活性的差異與花生籽粒油酸、亞油酸含量密切相關(guān), 它決定了花生仁中油酸和亞油酸的含量[11]。栽培種花生中AhFAD2由位于不同亞基因組上的2對非等位同源基因和共同編碼。在普通油酸含量花生品種中這2個基因或者其中之一能正常表達, 而在高油酸品種中,和基因均突變造成功能缺陷, 共同導(dǎo)致高油酸性狀的產(chǎn)生[11]。普通花生的不飽和脂肪酸中含有約45%的油酸和35%的亞油酸, 而含有和基因突變的高油酸花生中油酸含量可達80%, 而亞油酸的含量則減少到2%~3%[12]。因此, 高油酸花生育種的關(guān)鍵是油酸脫氫酶(FAD2)基因的突變。

基因組編輯技術(shù)的發(fā)展為創(chuàng)造高油酸花生突變體提供了新的途徑?；蚪M編輯技術(shù)主要是利用序列特異性核酸酶 (sequence specific nucleases, SSNs)在特定基因位點產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂, 借助編輯受體自身的DNA修復(fù)系統(tǒng)在非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)過程中產(chǎn)生隨機的Indels (small insertions and deletions)或在同源重組(homologous recombination)修復(fù)過程中插入或替換相應(yīng)的基因片段, 最終實現(xiàn)堿基突變、DNA片段缺失和插入等現(xiàn)象, 使原本的基因不能正常表達。CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)具有突變效率高、準(zhǔn)確度高、設(shè)計構(gòu)建表達載體較為簡單等特點, 成為當(dāng)前主流的基因組編輯方法。目前該技術(shù)已成功應(yīng)用于人類細胞、小鼠、斑馬魚、果蠅、線蟲、大鼠、水稻、擬南芥、小麥、煙草等基因組精確修飾(包括堿基突變, 插入突變和缺失突變)[13-14]。本研究利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù), 創(chuàng)造花生基因突變體材料, 旨在為研究花生脂肪酸合成及高油酸花生育種提供寶貴的種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

栽培花生(L.)魯花11, 2018— 2020年種植于深圳市龍華區(qū)深圳大學(xué)研究基地。

1.2 試驗方法

1.2.1 花生和基因的克隆 根據(jù)栽培花生delta-12 fatty acid desaturase (FAD) mRNA序列(GenBank: EF186911.1)設(shè)計引物: FAD2F: 5￠-ATGGGAGCTGGAGGGCGTGTCACT-3′和FAD 2R: 5￠-TCAGAACTTGTTCTTGTAC CAATA-3￠。取1 g花生幼嫩葉片, 放液氮中快速冷凍并研磨, 用植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化北京科技有限公司)提取基因組DNA, 通過高效高保真PCR擴增試劑盒(天根)擴增和基因。PCR反應(yīng)體系包含5 μL 200 ng基因組DNA、引物1 (10 μmol L-1)和引物2 (10 μmol L-1)各2 μL、10 μL 5′buffer、1 μL Fast HiFidelity DNA聚合酶、2.5 μL 20× Fast PCR Enhancer, 加ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)條件為94℃ 2 min; 94℃15 s, 60℃10 s, 68℃60 s, 35個循環(huán); 68℃5 min。PCR產(chǎn)物利用Hieff Clone Plus一步法快速克隆試劑盒(翊圣生物科技(上海)有限公司)克隆后測序。

1.2.2 CRISPR/Cas9基因組編輯載體的構(gòu)建 通過NCBIblast比對找到花生和基因序列保守區(qū)域。利用CRISPR設(shè)計程序Cas-Designer根據(jù)上述和基因保守區(qū)域序列, 以野生花生()基因組序列(PeantBase v1.0)為參考基因組, 設(shè)計2條sgRNA序列, 分別為T1-TCAAACCCTCCATTCAGTGT()和T2-TCA TATAACTGATACGCATG()。設(shè)計2條PCR引物, 分別為引物1: 5￠-ATATATGGTCTCGATTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT-3￠; 引物2: 5￠-ATTATTGGTCTCT AAACCAATCTCTTAGTCGACTCTACCAAT-3￠, 下畫線部分為T1和T2 sgRNA靶點序列, 黑體部分為BSAI酶識別位點, 引物1和2的3￠端分別與pCBC-DT1T2的gRNA-Sc和U6-29p配對(圖1)。以pCBC-DT1T2為模板, 利用上述引物進行PCR擴增, PCR片段通過BSAI位點克隆到pSKE401載體[15], 構(gòu)建含T1和T2兩個靶點的CRISPR載體FAD2T1T2 (圖1)。

合成含有g(shù)RNA1和gRNA2序列的引物1和引物2, 以pCBC-DT1T2載體為模版合成sgRNA片段, 并通過引物1和引物2上的I酶切位點, 克隆到pSKE401載體, 獲得含2個靶點的基因組編輯載體FAD2T1T2。LB、RB分別為農(nóng)桿菌T-DNA的左右邊界; U6-26p、U6-29p為擬南芥U6基因啟動子; U6-29T、U6-26T為轉(zhuǎn)錄終止子; 35Sp--NosT、35Sp--polyA分別為和基因表達框。

Primer 1 and primer 2 containing gRNA1 and gRNA2 sequences, are used to synthesize sgRNA by PCR with pCBC-DT1T2 as template. The synthesized sgRNA was cloned into pSKE401 plasmid byI restriction enzyme sites to obtain FAD2T1T1 genome editing construct. LB, RB denote T-DNA left and right border sequences; U6-26p, U6-29p are promoters while U6-29T and U6-26T are terminators ofU6 gene; 35Sp--NosT, 35Sp--polyA are gene expression cassettes ofandgenes.

1.2.3 花生基因轉(zhuǎn)化 花生的基因轉(zhuǎn)化參考Livingstone和Birch的方法[16]。成熟花生種子用20% Clorox (含1% w/v次氯酸鈉)表面消毒2次, 每次20 min, 無菌水沖洗3次。在超凈臺中切去花生胚芽, 去掉子葉及胚根, 放在MS5PG (4.4 g L-1MS basal salts, 蔗糖30.0 g L-1, 谷氨酰胺1.0 g L-1, Picloram 5.0 mg L-1, 瓊脂粉8 g L-1, pH 5.8)花生愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上, 26~28℃暗培養(yǎng), 誘導(dǎo)胚性愈傷組織。胚性愈傷組織每2~3周繼代1次, 4~6周后轉(zhuǎn)入MS3PG (4.4 g L-1MS basal salts, 蔗糖30.0 g L-1, 谷氨酰胺1.0 g L-1, Picloram 3.0 mg L-1, 瓊脂粉8 g L-1, pH 5.8)花生愈傷組織繼代培養(yǎng)基上, 進行胚狀體的擴增及保持。

花生胚性愈傷組織在MS3PGO (MS3PG + 甘露醇0.2mol L-1+ 山梨醇0.2 mol L-1)滲透壓培養(yǎng)基上進行預(yù)處理4 h, 利用基因槍PDS-1000/HE進行轉(zhuǎn)化, 金粉顆粒為0.6mm, 每個轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA用量為2mg, 轉(zhuǎn)化壓力為650 PSI, 轉(zhuǎn)化距離為6 cm。轉(zhuǎn)化后在MS3PGO培養(yǎng)基上保留過夜, 然后重新轉(zhuǎn)到MS3PG培養(yǎng)基上, 26~28℃暗培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基MS3PGK50 (MS3PG + 卡那霉素50 mg L-1), 26~28℃暗培養(yǎng)8~10周, 每3~4周換1次培養(yǎng)基。

篩選8~10周后, 抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到MSC (4.4 g L-1MS basal salts, 蔗糖20.0 g L-1, 活性炭1.0 g L-1, 卡那霉素50 mg L-1, 瓊脂粉8 g L-1, pH 5.8)分化培養(yǎng)基, 26~28℃光照培養(yǎng)(每日16 h光照) 4~6周, 胚狀體轉(zhuǎn)移到MS10 (4.4 g L-1MS basal salts, 蔗糖20.0 g L-1, BAP 10 mg L-1, 卡那霉素50 mg L-1, 瓊脂粉8 g L-1, pH 5.8)培養(yǎng)基, 26~28℃光照培養(yǎng)(每日16 h光照), 每3~4周繼代1次, 直至長成小苗, 然后將小苗轉(zhuǎn)入MSOR (4.4 g L-1MS basal salts, 蔗糖20.0 g L-1, NAA 1.0 mg L-1, 卡那霉素50 mg L-1, 瓊脂粉8 g L-1, pH 5.8)生根培養(yǎng)基, 26~28℃光照培養(yǎng)(每日16 h光照), 誘導(dǎo)生根, 三至四葉大的生根幼苗移栽到花盆土中, 在培養(yǎng)室中光照培養(yǎng)直至開花結(jié)果。

移栽成活的幼苗, 取幼苗葉片, 用植物基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。根據(jù)pKSE401載體上Cas9基因序列, 設(shè)計PCR引物Cas9F: 5￠-GACAAGAAGTACTCGATCGGCCTCG-3￠和Cas9R: 5￠-TCGTAGGGTACTTCTCGTGGTAGGC-3￠。以花生幼苗基因組DNA為模板, 通過PCR進行轉(zhuǎn)基因驗證。

以轉(zhuǎn)基因花生基因組DNA為模板, FAD2F和FAD2R為引物進行PCR擴增。將擴增PCR片段進行克隆, 然后挑選單克隆進行測序。每個基因轉(zhuǎn)化植株挑選10個單克隆進行測序, 測序結(jié)果通過NCBI網(wǎng)站BLAST程序和野生型植株基因序列比對, 鑒定突變基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 FAD2A和FAD2B基因序列分析

花生和基因編碼序列皆為1140 bp, 各編碼1個379氨基酸的蛋白?；蛐蛄斜葘Πl(fā)現(xiàn),基因和EF186911.1序列完全一致,基因和EF186911.1序列相比有10個SNP, 蛋白質(zhì)序列有3個氨基酸的變化, 同源性均大于99%。分別在5￠和3￠端核酸序列同源區(qū)設(shè)計2個sgRNA靶點T1和T2 (圖2), 用于CRISPR載體的構(gòu)建。

黑點表示相同序列, T1和T2標(biāo)記基因組編輯靶點位置, 紅色下畫線標(biāo)記PAM (NGG)序列。

Black dots denote identical nucleotides; T1 and T2 indicate the target sequences of genome editing; PAM sequences are underlined with red lines.

2.2 轉(zhuǎn)基因花生分析

利用CRISPR載體FAD2T1T2 (圖3-A)通過基因槍轉(zhuǎn)化魯花11胚性愈傷組織, 經(jīng)過含卡那霉素的培養(yǎng)基篩選, 共獲得16株抗性花生植株(圖3- B)。取轉(zhuǎn)基因花生幼葉提取基因組DNA, 利用CAS9序列引物, 通過PCR對轉(zhuǎn)基因花生植株進行驗證發(fā)現(xiàn), 其中12株含有轉(zhuǎn)基因成分(圖3-C)。為研究基因組編輯載體對花生基因的編輯情況, 以12株轉(zhuǎn)基因花生的基因組DNA為模板, FAD2F和FAD2R為引物進行PCR擴增, 并對克隆的PCR產(chǎn)物進行測序, 發(fā)現(xiàn)和基因的突變(圖3-D, 表1, 表2)。

A: 轉(zhuǎn)基因載體, T1、T2分別為gRNA1和gRNA2靶點序列; B: 轉(zhuǎn)基因愈傷及再生植株, 左側(cè)為抗性愈傷組織, 右側(cè)為轉(zhuǎn)基因植株; C: 轉(zhuǎn)基因植株鑒定, 擴增條帶為基因片段, 箭頭指示400 bp PCR擴增產(chǎn)物; D: 突變體序列分析, 轉(zhuǎn)基因植株通過測序檢測基因編輯突變體。

A: gene transformation vector. T1 and T2 are gRNA1 and gRNA2 target sites; B: transgenic calli (left) and plantlets (right); C: PCR identification of transgenic plants. The amplified band isgene fragment, and the arrow denotes 400 bp DNA marker; D: sequence analysis of genome editing mutants.

表1 FAD2A基因突變

表2 FAD2B基因突變

基因共產(chǎn)生29個位點的突變, 16個引起蛋白質(zhì)序列的變化。其中突變體12-6在第451位的堿基G突變?yōu)門, 使得原來編碼谷氨酸(E)的密碼子GAA變?yōu)榻K止密碼子TAA, 使得FAD2A蛋白合成提前終止。另外在第668位插入7個堿基CTCAGGA, 使得該基因產(chǎn)生移碼突變, 這些無義突變將產(chǎn)生FAD2A功能性缺失, 影響酶活性。其他單個氨基酸的突變包括已經(jīng)報道的在第448位的單堿基替換(G→A), 使編碼的蛋白質(zhì)第150位氨基酸由天冬氨酸(D)轉(zhuǎn)變?yōu)樘於０?N), 而D150殘基在所有FAD2中是絕對保守的, 是高油酸性狀的關(guān)鍵位點, 突變導(dǎo)致AhFAD2A酶活性降低, 不能催化油酸向亞油酸轉(zhuǎn)變的過程[17]。該突變在2株花生中被發(fā)現(xiàn)(148-1和149-3)。

基因有30個突變。其中13個突變不造成編碼蛋白質(zhì)序列的變化, 17個突變引起蛋白質(zhì)序列的變化(表2)。其中突變體12-2、13-5、148-2、149-6、148-10、149-4、150-12在451位的堿基由G變?yōu)門引起相應(yīng)的密碼子由GAA變?yōu)榻K止密碼子TAA, 使蛋白質(zhì)翻譯提前終止, 產(chǎn)生150個氨基酸的蛋白質(zhì); 突變體12-2、12-5、13-5、148-2、148-6、148-9、148-10在第668位插入7個堿基CTCAGGA, 可引起蛋白質(zhì)的移碼突變。其他突變都為單個氨基酸突變, 但沒有發(fā)現(xiàn)在448位的單堿基替換(G→A)。

3 討論

Norden等[12]于1987年在佛羅里達育種計劃中發(fā)現(xiàn)了第1個天然高油酸花生突變體F435, 從此打開高油酸花生育種和研究的序幕。F435種子油酸含量高達80%, 亞油酸含量僅為2%。美國大多數(shù)高油酸花生品種以F435為基礎(chǔ)進行研究和發(fā)展。高油酸的性狀由2個隱性突變基因(ol和ol)調(diào)控[3,12]。通過對普通油酸花生與F435序列比對發(fā)現(xiàn), 在的編碼區(qū)從起始密碼子起第448 bp堿基發(fā)現(xiàn)存在單堿基替換(G→A), 使編碼的蛋白質(zhì)第150位氨基酸由天冬氨酸(D)轉(zhuǎn)變?yōu)樘於０?N), 而D150殘基在所有FAD2中是絕對保守的, 是高油酸性狀的關(guān)鍵位點, 突變導(dǎo)致AhFAD2A酶活性降低, 不能催化油酸向亞油酸轉(zhuǎn)變的過程[17]; 在基因起始密碼子起第441_442 bp處存在單堿基插入(442insA), 造成移碼突變, 導(dǎo)致翻譯的蛋白質(zhì)序列提前終止, 產(chǎn)生無活性的蛋白[18-19]。隨后, 通過化學(xué)誘變和物理誘變獲得了一些高油酸花生材料, 如M2-225[20]、Mycogen-Flavo[21]、SPI098[22]和GAT2636M[23], 所有的這些突變都影響到了FAD2酶的活性。高油酸花生品種C458和M2-225在自然突變(G448A)基礎(chǔ)上, 誘變又使基因起始密碼子后第665 bp和997 bp處分別插入微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座元件MITE (205 bp), 導(dǎo)致肽鏈提前終止, 使蛋白功能喪失。的突變類型主要有2種: 441_442insA突變(F435及衍生系列、E16等)和MITE插入突變(C458、M2-225等)[24], 以上突變基因均屬于無義突變(nonsense mutation)[25], 使產(chǎn)生的蛋白不完全而喪失原基因的功能, 已成為花生高油酸育種的基因源。

國際上除上述最基本F435高油酸基因材料外, 美國科學(xué)家又鑒定出2個新的高油酸花生自然突變體PI342664和PI342666, 其基因編碼區(qū)448位G→A突變與先前報道相同, 而基因突變C301G導(dǎo)致氨基酸H101D改變屬于新的突變位點, 最終使突變體油酸含量達到79%以上[26]。印度花生育種家Nadaf等[27]用EMS和γ射線處理GPBD-4, 獲得2個高油酸系GM4-3和GM6-1, 通過克隆其基因和測序后發(fā)現(xiàn)了2個新的突變位點。GM6-1在第1085A→G和1111G→A位上發(fā)生堿基突變, GM4-3在1111G→A位上發(fā)生突變。1111G→A的突變使得基因的第371位氨基酸由甘氨酸轉(zhuǎn)變成絲氨酸, 1085A→G的突變使得基因的第362位氨基酸由絲氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦拾彼? 2個高油酸系油酸含量均在75%以上。國內(nèi)花生研究者Fang等[28]利用EMS化學(xué)誘變獲得基因新的突變位點C313T, 引起氨基酸序列H105Y突變, 使油酸含量由44%提高到60%以上。莊偉建[29]等公布通過γ射線誘變處理獲得一種花生高油酸隱性突變系A(chǔ)hfad2a-1植株, 陳四龍[30]公布一種自然突變產(chǎn)生的高油酸花生突變體C814T材料, 在基因第814位置包含1處有義堿基突變: 814C→T, 使得蛋白質(zhì)序列272氨基酸殘基由組氨酸(H)轉(zhuǎn)變?yōu)槔野彼?Y)。除上述F435為自然突變外, 其余高油酸品種均為人工誘變產(chǎn)生。這些高油酸花生的突變體為之后分子的遺傳機理提供重要的材料, 促進了花生油酸基因的分離和性狀遺傳的探究。

隨著生物技術(shù)不斷發(fā)展和對高油酸遺傳機理的研究深入, 很多生物學(xué)家嘗試各種不同的方法來獲得目標(biāo)高油酸花生種子, 其中包括各種植物基因工程技術(shù)。徐霞[31]采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法, 將反義基因?qū)牖ㄉ? PCR檢測和Southern雜交檢測證實反義基因已經(jīng)整合入花生基因組。Yin等[32]對獲得的4份轉(zhuǎn)基因的花生種子進行品質(zhì)分析發(fā)現(xiàn), 油酸含量由野生型的37.87%提高到59.62%~70.01%; 李桂民[33]應(yīng)用雙鏈RNA基因沉默技術(shù)使T1代轉(zhuǎn)基因種子油酸含量由原來的38%提高到77%。Yuan等[34]最近報道了通過CRISPR/Cas9技術(shù)對花生基因的編輯, 并在原生質(zhì)體及毛狀根中獲得基因突變, 但由于轉(zhuǎn)基因花生原生質(zhì)體及毛狀根都無法再生植株, 因此沒有獲得可穩(wěn)定遺傳的花生材料。我們采用基因槍轉(zhuǎn)化花生胚性愈傷組織, 獲得轉(zhuǎn)基因植株, 并鑒定到多個花生基因突變?；驑屴D(zhuǎn)化是植物基因轉(zhuǎn)化的常用方法之一, 由于其操作簡單, 轉(zhuǎn)化效率高, 對于一些農(nóng)桿菌難浸染的植株尤其有效, 但基因槍轉(zhuǎn)化也經(jīng)常造成多個拷貝的轉(zhuǎn)基因現(xiàn)象。在基因組編輯中, 多拷貝轉(zhuǎn)基因有可能使得這些基因的表達提高, 從而有利于基因編輯, 增加突變效率。另一方面, 多拷貝轉(zhuǎn)基因也為將來轉(zhuǎn)基因成分的分離清除造成麻煩。本研究獲得多個可以穩(wěn)定遺傳的材料, 為運用基因組編輯系統(tǒng)進行高油酸花生的育種研究奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究通過CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)實現(xiàn)了對栽培花生和基因的突變, 得到了可以穩(wěn)定遺傳的高油酸花生突變體, 為高油酸花生的培育帶來了新的途徑。

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Preliminary study of genome editing of peanut FAD2 genes by CRISPR/Cas9

ZHANG Wang, XIAN Jun-Lin, SUN Chao, WANG Chun-Ming, SHI Li, and YU Wei-Chang*

College of Life Sciences and Oceanography, Shenzhen University / Guangdong Provincial Key Laboratory for Plant Epigenetics, Shenzhen 518071, Guangdong, China

Oleate dehydrogenase (Δ12FAD or FAD2) is the key enzyme catalyzing the dehydrogenation of oleic acid (OA) at the C12 position to produce diunsaturated linoleic acid (LA). It controls the contents and ratios (O/L) of oleic acid and linoleic acid in plants. Increasing evidences in molecular biology research indicate thatis the key gene for the conversion of oleic acid to linoleic acid, and determines the relative content of oleic acid and linoleic acid in peanut seeds. In this study, the corresponding sgRNA sequences were designed based ongene sequences, and a CRISPR/Cas9 gene editing vector was constructed to mutate the peanutandgenes. After peanut gene transformation, gene mutations were identified by genomic sequence analysis of transgenic peanut flanking the sgRNA target sites. Target gene analysis indicated that 29 mutationsgene in 16 transgenic peanut plants were obtained, among which 16 mutations caused protein sequence changes; 30 mutations in 11 transgenic peanut plants contained mutations ingene, among which 17 mutations caused changes in protein sequence. Changes in the protein sequences of theandgenes might affect the enzyme activity, change the catalytic dehydrogenation of oleic acid, hinder the synthesis of linoleic acid, and thus increase the content of peanut oleic acid. Thesegene mutants are valuable in the study of fatty acid metabolism and the breeding of high oleic peanuts.

peanut; oleic acid; linoleic acid; FAD2; genome editing

10.3724/SP.J.1006.2021.04214

本研究由國家自然科學(xué)基金項目(31671766)和深圳市科創(chuàng)委基礎(chǔ)研究項目(JCYJ20190808143207457, JCYJ20180305124101630, JCYJ20170818094958663)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31761766) and the Shenzhen Commission of Science and Technology Innovation Projects (JCYJ20190808143207457, JCYJ20180305124101630, JCYJ20170818094958663).

于為常, E-mail: wyu@szu.edu.cn

E-mail: zahngwang@foxmail.com

2020-09-19;

2021-01-13;

2021-02-25.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20210225.1139.002.html