張 波 裴瑞琴 楊維豐 朱海濤 劉桂富 張桂權 王少奎

利用單片段代換系鑒定巴西陸稻IAPAR9中的粒型基因

張 波 裴瑞琴 楊維豐 朱海濤 劉桂富 張桂權 王少奎*

廣東省植物分子育種重點實驗室/ 亞熱帶農業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室/ 華南農業(yè)大學, 廣東廣州 510642

水稻粒型是由多基因控制的復雜數量性狀, 是稻米產量和品質的重要影響因子, 水稻粒型基因的定位與遺傳研究有助于稻米產量與品質的協(xié)同改良。本研究利用巴西陸稻IAPAR9為供體、以華南地區(qū)高產秈稻品種華粳秈74為受體, 構建的153份水稻單片段代換系材料, 連續(xù)兩季通過單因素方差分析和鄧肯氏多重比較, 結合代換片段重疊群作圖, 定位了13個控制水稻粒型及粒重的QTL。這13個位點分別分布于水稻1、2、4、5、6、7、9和11號染色體上, 包括9個控制谷粒長的QTL、1個控制谷粒寬的QTL和3個控制千粒重的QTL。其中,-、-和為新鑒定的QTL位點。新的粒型QTL定位將為進一步的基因克隆與粒型遺傳調控網絡解析提供依據和線索, 也可為稻米產量與品質協(xié)同改良提供新的種質資源。

水稻; 單片段代換系; 粒型; QTL定位

水稻是世界上最重要的糧食作物之一, 有超過半數的人口以稻米為食。隨著現代生活水平逐步提高, 人們對稻米品質的要求也日益增高, 培育高產、優(yōu)質的水稻品種已成為水稻育種重要目標。水稻粒型直接決定稻米外觀品質, 同時也是影響稻谷千粒重的重要因素, 因此, 粒型是水稻高產優(yōu)質育種的重要靶標性狀, 粒型的遺傳分析與分子機制研究備受關注。

水稻粒型是受多基因控制的復雜農藝性狀。伴隨著近代遺傳學與基因組學的不斷發(fā)展, 通過構建F2、重組自交系(recombinant inbreed line, RIL)等初級作圖群體以及染色體片段代換系(chromosome segment substitute line, CSSL)等次級作圖群體, 大量控制水稻粒型的QTL (quantitative trait locus)陸續(xù)被定位[1-8]; 近年來, 全基因組關聯分析(genome-wide association study, GWAS)、突變位點圖譜(MutMap)等技術更是加快了水稻粒型QTL定位的速度與效率[9-12]。截至目前, 已經有超過600個粒型相關的QTL被鑒定, 涵蓋粒寬、粒長、粒厚、長寬比和粒重等, 被鑒定到的QTL遍布于水稻12條染色體[1,13]。但目前已被克隆的水稻粒型基因數量還較少, 其中, 利用自然變異材料克隆到的粒型基因, 僅有[14]、[15]、[16]、[17]、/[18-20]、[21-22]、[23]、[24]、[25]、[26]/[27]、[28]、[29]和[30]等十余個。

已克隆的粒型基因數量遠遠低于已定位的QTL數量, 這與定位群體的復雜性密切相關。傳統(tǒng)定位中用到的F2、RIL等群體背景較為復雜, 后代往往持續(xù)分離, 對基因的精細定位造成一定的干擾。近年來, GWAS技術被廣泛用于QTL定位, 它能夠將目標QTL定位在某一區(qū)間, 但由于實驗材料的復雜多樣, 且缺乏必要的遺傳材料對基因進行功能解析, 獲得的優(yōu)良基因也難以直接運用到水稻育種實踐中。水稻單片段代換系(single segment substitution lines, SSSL)材料經過多代回交和分子標記輔助選擇培育而成, 通常只攜帶一段來自供體親本的染色體片段, 遺傳背景與受體親本高度相似, 是鑒定復雜農藝性狀QTL, 解析目的基因功能的理想材料[31]。經過長期積累, 本團隊已構建供體親本2360份, 包括亞洲栽培稻、非洲栽培稻以及AA基因組野生稻的SSSL材料[31], 但尚未針對單一親本為供體的SSSL材料系統(tǒng)考察粒型相關QTL。巴西陸稻IAPAR9谷粒較大, 千粒重較高, 本研究利用以其為供體的153份SSSL材料鑒定粒型QTL, 并對鑒定到的QTL進行初步定位和遺傳分析。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為華南地區(qū)高產秈稻品種華粳秈74 (HJX74)、巴西陸稻IAPAR9和153份以華粳秈74為受體親本、IAPAR9為供體親本的水稻單片段代換系材料。水稻材料由本團隊水稻種質資源庫低溫保存。2份親本材料及153份單片段代換系材料分別于2018年晚季、2019年早季在廣州市華南農業(yè)大學啟林北試驗農場種植。每個材料3個重復, 每個重復1個雙壟(20株), 按照10 cm × 15 cm單株插秧, 常規(guī)管理。

1.2 材料的鑒定

插秧7 d后, 按照單株取水稻幼嫩葉片, 利用TPS法[32]提取基因組DNA。以合格的DNA樣品作為模板, 使用SSR標記進行PCR擴增, 結合6%聚丙烯酰胺變性凝膠電泳進行檢測。帶型與HJX74帶型一致的標記為“1”, 與IAPAR9帶型一致的標記為“3”, 據此判定代換片段的位置與長度, 并選取攜帶純合代換片段的材料用于表型分析。

1.3 材料表型考察

種子完熟后, 按單株收種, 充分晾干后, 考察粒長、粒寬和千粒重。粒長和粒寬的考察: 按照不同材料編號隨機挑選發(fā)育健康、大小均一的種子100粒, 利用彩色平臺式掃描儀(MICROTER MRS- 9600TFU2L)掃描記錄; 采用種子外觀分析軟件(萬深SC-E型)進行圖像處理, 讀取粒長和粒寬等數據。千粒重考察方法為: 充分晾干谷粒, 隨機取出500粒飽滿健康的種子進行稱重, 重復3次(每次重量之差小于平均值的3%), 折算成千粒重。

1.4 數據分析與QTL定位

實驗數據采用SPSS 23.0以及Microsoft Excel 2016進行統(tǒng)計與分析; 圖表繪制采用MapChart、Origin 2018和Photoshop CS進行。利用單因素方差分析(ANOVA)和鄧肯氏(Duncan’s)多重比較分析單片段代換系材料和HJX74目的性狀的差異顯著性。在0.01水平下進行多重比較, 與HJX74在同一組別的SSSL材料不攜帶粒型相關QTL, 而與HJX74不在同一組別的SSSL材料則攜帶粒型QTL; 在2個測試季節(jié)均被檢測到表型變異的SSSL被認為攜帶穩(wěn)定遺傳的QTL, 僅在一個季節(jié)檢測到的表型變化不記為QTL。采用重疊群作圖法, 對代換片段存在重疊區(qū)間的粒型QTL進行初步定位[33]。加性效應計算方法為HJX74的表型值與攜帶粒型基因的SSSL的表型值的差值的一半[34]。

2 結果與分析

2.1 IAPAR9的粒型與攜帶的粒型基因

HJX74是本團隊育成的高產品種, 籽粒大小適中。IAPAR9由巴西農業(yè)科學院稻豆研究中心于1970年育成, 1992年由中國農業(yè)科學院檢疫、試種并陸續(xù)在江西、貴州和北京等地審定。該品種谷粒長為(9.65 ± 0.05) cm, 較HJX74增長約17.60%, 粒寬增加約4.20%, 千粒重也比HJX74重約10.50%, 相關性狀差異均達到極顯著水平(圖1)。以二者為親本構建定位群體, 鑒定水稻粒型QTL切實可行。

a, b: HJX74和IAPAR9的粒型, 標尺為5 mm; c: HJX74和IAPAR9的粒長; d: HJX74和IAPAR9的粒寬; e: HJX74和IAPAR9的粒重。**表示HJX74的粒長、粒寬和千粒重與IAPAR9之間的差異達到極顯著水平(< 0.01),檢驗。

a, b: the grain shape of HJX74 and IAPAR9, Bar: 5 mm; c: the grain length of HJX74 and IAPAR9; d: the grain width of HJX74 and IAPAR9; e: the grain weight of HJX74 and IAPAR9. ** means significant difference in grain length, grain width and grain weight between HJX74 and IAPAR9 by Student’s-test (< 0.01).

利用水稻自然變異已克隆了[14]、[16]等十余個粒型基因。本研究利用本團隊重測序數據結合Sanger測序, 系統(tǒng)分析了IAPAR9和HJX74中相關粒型基因的功能位點。結果表明, IAPAR9和HJX74二者中的[14]、[24][25][28]和[30]等基因在功能位點上序列一致。而[35][16]、[17][21-22]、[23]、[26]和[29]等粒型基因在二者中存在功能位點上的序列差異, 上述基因位點在IAPAR9中均為功能變異類型。針對存在功能變異的位點, 開發(fā)了功能基因緊密連鎖標記(引物序列見附表1), 相關標記可明確區(qū)分HJX74和IAPAR9中粒型基因的不同等位變異(圖2)。盡管IAPAR9中存在[16]、[21-22]和[26]等多個粒型基因功能變異, 但粒型是極為復雜的數量性狀位點, 繼續(xù)解析造成IAPAR9和HJX74粒型差異的其他基因位點將為系統(tǒng)理解水稻粒型的遺傳調控網絡提供更多證據。

2.2 SSSL材料的代換片段

本團隊經過長期積累, 已經建成了供體來源豐富的水稻單片段代換系材料文庫, 其中以IAPAR9為供體的材料總計153份。材料中所攜帶的來自IAPAR9的代換片段分布于水稻12條染色體上, 覆蓋了約52.99%的水稻染色體, 每條染色體上的代換片段總長度變幅在3.45～123.65 cM之間, 9號染色體覆蓋率最高, 12號染色體覆蓋最低(圖3和附表2)。每個材料中攜帶的代換片段長度大小不一, 代換片段平均長度為20.95 cM; 每條染色體上的代換片段數量不同, 位于1號染色體的代換片段最多, 達到30個, 而12號染色體上的代換片段最少, 僅有1個(附表2)。

白色線段指示相關引物經PCR擴增獲得的目的條帶, 其余帶紋為引物非特異性擴增條帶。

The white lines indicate the target bands obtained by PCR, and the other bands are non-specific amplifications.

遺傳距離(單位: cM)見左側標尺; 染色體上黑色部分代表該區(qū)域可以被來自IAPAR9的代換片段所覆蓋; 藍色字體突出顯示相關位點上已克隆的水稻粒型基因。

The genetic distance (cM) is shown as rulers on the left margin. Filled and open bars represent chromosomal segments homozygous for IAPAR9 and HJX74 alleles, respectively. The cloned genes are shown in blue font.

2.3 親本與群體的粒長、粒寬和千粒重

在2018年晚季和2019年早季, 連續(xù)兩季的粒型分析表明, 153份SSSL材料的粒長、粒寬和千粒重性狀變幅很大, 粒寬變幅在2.23～2.87 mm之間, 粒長為7.53～9.04 mm, 千粒重變化區(qū)間為14.00～25.44 g。粒長、粒寬和千粒重均變現為連續(xù)變異, 接近正態(tài)分布; 其中, 粒寬和千粒重在2個種植季節(jié)均存在超親分離; 粒長在2019年早季也觀測到超親分離現象(圖4)。

2.4 QTL定位分析

利用153份SSSL對水稻的粒長、粒寬和千粒重進行QTL檢測, 共檢測到13個QTL。分別分布在水稻1、2、4、5、6、7、9和11號染色體上(圖5和表1), 其中包括9個粒長QTL、1個粒寬QTL和3個控制千粒重的QTL。

控制水稻粒長的9個QTL, 分布于水稻1、2、4、5、6、7、9和11號染色體, 2018晚季對粒長的貢獻率在2.12%～4.55%, 2019年早季為1.96%～5.32%。其中, 有6個QTL加性效應為負, 其他3個QTL加性效應為正。本研究在水稻2號染色體上檢測到1個控制粒寬的QTL, 其加性效應為正值, 顯著增加水稻粒寬, 連續(xù)兩季對粒型的貢獻率均在3.00%以上。檢測到的3個千粒重QTL中, 有2個位于水稻1號染色體, 1個位于4號染色體, 其中位于1號染色體長臂端的-加性效應為正, 與控制粒長的-共定位;-與-共定位, 對表型貢獻率均表現為負效應 (表1)。該研究獲得的攜帶優(yōu)異粒型QTL的SSSL材料有望直接運用于本團隊搭建的水稻設計育種平臺, 也有助于克隆并解析新的粒型基因, 為闡明水稻粒型的遺傳調控網絡提供材料基礎和理論依據。

3 討論

本研究利用水稻SSSL材料定位了9個控制水稻粒長、1個控制水稻粒寬和3個影響千粒重的QTL。研究中用到的IAPAR9為耐旱性良好的粳型水稻, 我國已利用該材料育成多個審定品種, 挖掘和研究其中的粒型QTL/基因, 有助于我們深入了解粒型等位基因在水稻秈粳亞種間的遺傳特點, 也將直接為水稻外觀品質改良提供新的種質和基因資源。

a～c:2018晚季親本和SSSL的粒長、粒寬和千粒重的頻次分布; d～f:2019早季親本和SSSL的粒長、粒寬和千粒重的頻次分布。

a–c: the frequency distribution of grain length, width, and 1000-grain weight in SSSLs and the parents in later season of 2018; d–f: the frequency distribution of grain length, width, and 1000-grain weight in SSSLs and the parents in early season of 2019.

遺傳距離見左側標尺; 染色體右側的黑色矩形代表QTL及其定位區(qū)間。

The genetic distance is shown as rulers on the left margin. Black bars on the right of each chromosome are the location intervals of QTLs for grain size with their names on the right.

表1 利用SSSL定位到的粒型QTL及其加性效應

本研究定位的多個QTL與前人已有的定位區(qū)間重疊, 部分QTL所定位的區(qū)間內已有控制水稻粒型的主效基因被克隆。定位于1號染色體上的-和-與前人定位到的[36]位于同一區(qū)間內, 可能為相同的QTL。定位于2號染色體上的與已有的研究中定位的[37]、[38]和-[39]等存在定位區(qū)間的重疊, 該區(qū)間里包含影響粒型的[40],編碼轉錄激活因子, 通過影響調控細胞增殖和伸長基因的表達, 調控水稻籽粒大小。本研究定位到的與-[2]-[41]等QTL所在區(qū)間重疊, 該區(qū)間存在一個已克隆的、負向調控水稻粒寬和粒重的[42], 該基因的編碼蛋白與調控細胞周期的KRP1蛋白存在互作, 影響細胞增殖和細胞生長, 但我們定位到的主要控制水稻粒長, 二者效應不同, 也有可能是一個控制水稻粒長的新位點。在我們定位的位于4號染色體上的所在區(qū)間, 已有[2]、-[43]以及[41]等QTL報道; 位于4號染色體上主要控制千粒重的則與已克隆的[44]位于同一區(qū)間內,調控水稻籽粒大小, 進而影響水稻的千粒重與單株產量, 二者遺傳效應相似, 極有可能為同一基因。5號染色體上的與鄒德堂等[37]定位的有重疊部分, 該區(qū)間涵蓋一個編碼轉錄因子的,是RPBF和GBSSI的直接調控因子, 能夠負調控水稻籽粒大小[40], 可能是的候選基因。定位于6號染色體, 其所在區(qū)間內有已被克隆的、調控水稻粒長和粒重的[24], 但IAPAR9的與HJX74并無功能位點上的序列變異, 這暗示了該區(qū)間內存在一個尚未被發(fā)現的水稻粒型新位點。[26]/[27]是位于水稻7號染色體, 控制粒長和粒寬的主效QTL, 序列分析表明, IAPAR9攜帶功能變異位點, 本研究定位的極有可能與[26]/[27]為同一位點。定位于9號染色體上的與已報道的[2]所在區(qū)間重疊。位于4號染色體長臂末端, 該位點沒有發(fā)現粒型、粒寬的變化, 千粒重的變化可能由于谷粒厚度或灌漿飽滿程度的影響造成的。-、-和等3個QTL所在區(qū)間尚未有利用作圖群體定位到粒型QTL的報道, 其中,-和-共定位于水稻1號染色體長臂末端, 該位點可能存在一個協(xié)同增加水稻粒長和千粒重的正效應因子, 有望為稻米產量與品質協(xié)同改良提供新的種質資源。上述發(fā)現豐富了我們對水稻粒型遺傳調控的認識。

IAPAR9攜帶[16]、[35]、[17]、[21-22]、[23]和[26]等多個粒型基因功能變異, 但是由于本研究所利用的SSSL材料中的代換片段未能完全覆蓋水稻的整個染色體組, 特別是[16]、[35]、[21,22]、[23]和[29]所在區(qū)間均未被代換片段覆蓋(圖3), 上述基因位點并未在本研究中被檢測出來; 而7號染色體上具有覆蓋粒型主效基因[26]/[27]所在區(qū)間的代換片段, 在該區(qū)間鑒定到控制粒長的,在2個檢測季節(jié)中均是具有最高貢獻率的粒長QTL。綜上, 只要具有足夠的代換片段覆蓋度, 利用SSSL材料可以全面解析控制相關農藝性狀的QTL。另外, SSSL也是研究復雜性狀QTL的理想材料, 與受體親本相比, SSSL只攜帶一個來自供體的染色體片段, 其遺傳背景與受體親本高度相似, 是受體親本的天然近等基因系, 能夠極大限度地排除遺傳背景干擾[31], 這將為后續(xù)基因的克隆與功能解析提供扎實的材料基礎。而且, 本團隊已經建成HJX74背景下, 供體涵蓋稻屬AA基因組7個種的SSSL文庫, 全部代換片段大約覆蓋水稻基因組29倍[30], 為功能基因的等位分析提供了充分的材料保障?；赟SSL材料建立的設計育種體系[45-46], 則進一步促進了發(fā)掘到的優(yōu)良基因資源在水稻設計育種中的應用。

4 結論

本研究利用153份以巴西陸稻IAPAR9為供體親本秈稻品種HJX74為受體親本構建的SSSL材料, 在2018年晚季和2019年早季鑒定水稻粒長、粒寬和千粒重QTL, 本研究共鑒定到13個在2個不同季節(jié)穩(wěn)定遺傳的QTL, 包括9個粒長QTL、1個粒寬QTL和3個千粒重QTL。其中, 僅和所在的定位區(qū)間有已克隆的粒型相關基因被報道。本研究結果為新粒型基因進一步精細定位、克隆和功能解析奠定了良好的基礎, 獲得的優(yōu)異種質資源將有助于高產優(yōu)質水稻設計育種。

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附表1 引物名稱及序列

Table S1 Primers and the sequence of the primers

附表2 單片段代換系代換片段分布

Table S2 The distribution of the substitution segment in the SSSLs

TL: total lengths of the substituted segments; CL: the coverage length of the substituted segments; CP (%): coverage percent. It means the ratio of the contig length of the substitution segments to the length of the same chromosome.

Mapping and identification QTLs controlling grain size in rice (L.) by using single segment substitution lines derived from IAPAR9

ZHANG Bo, PEI Rui-Qing, YANG Wei-Feng, ZHU Hai-Tao, LIU Gui-Fu, ZHANG Gui-Quan, and WANG Shao-Kui*

Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Molecular Breeding / State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources / South China Agricultural University, Guangzhou 510642, Guangdong, China

Rice grain size is a complex quantitative trait controlled by multiple genes. Grain size is an important factor affecting rice yield and quality. The mapping and genetic analysis of genes controlling rice grain size are essential for the concurrent improvement of rice yield and quality. Here 13 QTLs for grain size were detected using 153 rice single-segment substitution lines in rice, which were derived from HJX74 as the receptor parent, and IAPAR9 as the donor parent. One-way ANOVA and Duncan’s multiple comparison were employed to detect the genetic bases of rice grain size in two consecutive years. Based on the substitution mapping using overlapped substitution-fragment in the SSSLs, a total of 13 grain size-related QTLs were detected on chromosomes 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9, and 11, including nine QTLs controlling grain length, one QTL controlling grain width, and three QTLs controlling 1000-grain weight. Furthermore,-,-, andwere novel identified QTLs. This study provided new basis for cloning and functional analysis of genes regulating grain size.

rice; single segment substitution line; grain size; QTL mapping

10.3724/SP.J.1006.2021.02056

本研究由國家重點研發(fā)計劃項目(2016YFD0100406), 廣東省基礎與應用基礎研究重大項目(2019B030302006)和廣東省特支計劃項目(2016TX03N224)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2016YFD0100406), the Key Projects of Basic Research andAppliedBasic Research of Guangdong Province (2019B030302006), and the Special Support Program of Guangdong Province for High-level Talents (2016TX03N224).

王少奎, E-mail: shaokuiwang@scau.edu.cn

E-mail: zhangboscau@163.com

2020-08-17;

2021-01-13;

2021-02-25.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20210225.1147.006.html