劉占圣，郭軍，韓冉，徐文競，傅曉藝，劉任糠，潘凱琳，李豪圣，劉建軍，汪曉璐，劉成

（1.山東省農業(yè)科學院作物研究所／農業(yè)農村部黃淮北部小麥生物學與遺傳育種重點實驗室／小麥玉米國家工程實驗室，山東 濟南 250100；2.煙臺大學生命科學學院，山東 煙臺 264005；3.石家莊市農林科學研究院，河北 石家莊 050049；4.江蘇大學，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

小麥是世界上最重要的糧食作物之一。小麥近緣物種中含有豐富的抗病、抗逆和抗蟲等優(yōu)異基因，是改良小麥抗病、抗逆等性狀的珍貴基因庫［1-4］。將近緣植物與小麥雜交，創(chuàng)制小麥遺傳改良材料是小麥遠緣雜交的重要內容［5］。隨著小麥遠緣雜交和染色體工程研究的深入開展，含優(yōu)異基因的外源染色體或染色體片段被導入小麥［6］，創(chuàng)制出了一大批優(yōu)良的中間材料［7］，為豐富普通小麥的遺傳基礎和性狀遺傳改良提供了重要的物質基礎。

分子標記是鑒定小麥遠緣雜交種質的有效工具。在小麥近緣植物特異標記建立方面，劉旭等［8］利用RAPD引物對高大山羊草及對照進行分析，建立了可以用于檢測小麥背景中高大山羊草染色體的RAPD標記。王春梅等［9］利用STS引物對中國春、黑麥、普通小麥-黑麥1R-7R二體異附加系進行分析，建立了黑麥1R染色體特異STS標記。Zhang等［10］根據小麥EST序列設計引物對小麥、簇毛麥以及小麥-簇毛麥漸滲系進行擴增，建立了簇毛麥5VS特異EST標記。Mattera等［11］利用EST引物對智利大麥和小麥等材料進行擴增，建立了智利大麥7Hch染色體EST標記。Liu等［12］利用一套小麥-擬斯卑爾脫山羊草附加系和代換系為材料，開發(fā)了擬斯卑爾脫山羊草S基因組染色體特異EST標記和SSR標記。

上述標記主要是建立某一小麥近緣物種特異標記，或者是建立小麥近緣物種某一條染色體（臂）特異分子標記［8-12］，但可用于同時區(qū)分不同小麥近緣物種的分子標記，以及可同時用于檢測小麥背景中不同近緣物種的通用標記還未見報道。鑒于此，本研究通過篩選小麥A、B和D染色體共線性基因某一內含子三個亞基因組間長度差異超過10 bp的區(qū)域，在該內含子上下游的外顯子保守序列處設計引物，利用小麥為對照，小麥近緣物種、小麥-近緣物種雜交種質為材料，進行PCR擴增，建立了能檢測小麥近緣物種的通用標記，對篩選鑒定小麥外緣材料、小麥-外緣物種雜交種質、分離群體以及選育含外緣物種血緣的小麥品系（種）均具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

中國春（Chinese Spring，CS）、N-編號和A6-4材料由電子科技大學生命科學與技術學院楊足君教授提供。7047和15n-21由山西省農業(yè)科學院作物研究所張曉軍研究員提供。XX030由英國約翰英納斯中心Steve M Reader教授提供。濟麥21、濟麥22、濟麥23、濟麥44、濟麥229和濟麥262由山東省農業(yè)科學院小麥研究團隊自主培育。PI編號材料由美國種質資源庫Harold Bockelman博士提供。AE編號材料和NGB編號材料分別源自德國IPK和北歐遺傳資源中心，由江蘇大學何華綱教授引進并提供。TA編號材料由美國堪薩斯州立大學小麥遺傳與資源中心Bernd Friebe教授提供，材料具體信息見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 序列分析與選擇 利用BLASTN對中國春小麥參考基因組及其注釋信息IWGSC RefSeq Annotation v1.0中的A∶B∶D＝1∶1∶1同源基因信息進行分析，保留微觀共線性良好并且均來自相同同源群的基因（參數設置E-value≤1E-10），保留含有內含子并且A、B和D亞基因組之間相對應內含子大小差別均超過10 bp的基因。在上一步篩選出的內含子信息基礎上，分別獲取每個內含子上下游的外顯子序列，長度小于50 bp外顯子序列將被去除。

1.2.2 引物設計與合成 利用Primer 3（https://github.com／primer3-org／primer3）分別在上下游外顯子序列中設計正向和反向PCR引物，PCR引物的長度范圍19～23 bp。分別對每組內含子中A、B和D三個亞基因組的正向或反向引物去重，然后以組為單位分別統(tǒng)計正向或反向引物重復出現的次數，只保留重復次數為3，即在A、B和D三個亞基因組中均完全匹配的引物。利用BLASTN對上述引物進行整個基因組水平的特異性檢測，數據庫為中國春參考基因組TGAC v1.39，E-value設置為10，輸出格式設置為6；保留BLASTN輸出中100%匹配（匹配長度與引物長度相同）的結果，并統(tǒng)計每條引物匹配到基因組上的位置數目；只保留匹配位置數目為3的引物，即在每個亞基因組上有且只有唯一匹配的引物。利用BLASTN對上述引物在基因組上的位置進行檢索，去除未知染色體（ChrUn）以及不能成對的引物（即只有正向或只有反向引物）。利用A基因組的序列信息，選取每個基因中PCR產物最小或正反向引物相距最近的組合。將設計的引物序列遞交青島擎科天成生物技術有限公司合成。

表1 試驗材料

1.2.3 DNA提取及PCR擴增 基因組DNA的提取方法參照Liu等［13］，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取液的完整性和濃度。PCR反應體系（30μL）：DNA（25 ng／μL）2.0μL，Taq DNA polymerase（5 U／μL）0.3μL，dNTPs（200μmol／L）0.3μL，含Mg2＋的10×PCR buffer 3.0μL，上、下游引物（10μmol／L）各2μL，用無菌雙蒸餾水補充反應體系至30μL。PCR擴增程序：94℃3 min；94℃45 s，55℃45 s，72℃2 min，共35個循環(huán)；72℃10 min。4℃保存。

1.2.4 PCR產物電泳及檢測 PCR產物用聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）電泳檢測。PAGE每100 mL包括30%丙烯酰 胺 溶 液 （acrylamide-bisacrylamide，Acr-Bis，29∶1）20 mL，5×TBE緩沖液20 mL，10%過硫酸銨溶液（ammonium persulphate，AP）1 mL，四甲基乙二胺（N，N，N′，N′-tetramethylethylenediamine，TEMED）40μL，最后用無菌雙蒸餾水補充至100 mL。電泳完后，PAGE在1μg／mL溴化乙錠溶液中染色30 min，最后在GDS-Gel Dol 2000紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照保存。

2 結果與分析

2.1 引物篩選與外緣物種通用標記的獲得

通過生物信息學篩選，共獲得符合要求的引物2 189對，隨機選取并合成其中的36對，以濟麥21、濟麥22、濟麥23、濟麥44、濟麥229和濟麥262為材料，對其擴增效果進行篩選驗證。結果發(fā)現，36對引物均能在供試小麥中擴增出相同的2～3條清晰DNA條帶。其中，引物Triad＿24、Tri-ad＿82、Triad＿199、Triad＿220、Triad＿291和Triad＿352的擴增條帶如圖1所示。

為研究36對引物在小麥族物種間是否可以擴增出多態(tài)性，以中國春、野生一粒小麥、烏拉爾圖小麥、黑麥、擬斯卑爾脫山羊草、沙融山羊草、高大山羊草、小傘山羊草、簇毛麥和智利大麥為研究材料進行PCR擴增，結果發(fā)現，36對引物中有25對可以在供試材料間擴增出明顯多態(tài)性。這些引物不僅可以在同一物種不同亞種間擴增出多態(tài)性，還能在不同物種間擴增出多態(tài)性，因此，這些多態(tài)性標記可能可以應用于檢測小麥背景的外源染色質。篩選出的25對引物信息如表2所示。引物Triad＿24、Triad＿82、Triad＿199、Triad＿220、Triad＿291和Triad＿352的擴增結果如圖2所示。

圖1 Triad＿24等6對引物在普通小麥中擴增產物的PAGE電泳檢測圖譜

圖2 Triad＿24等6對引物在小麥近緣物種中擴增產物的PAGE電泳檢測圖譜

2.2 外緣物種通用標記的應用

為了驗證篩選出的25對引物擴增出多態(tài)性標記在檢測小麥背景的外源染色質的可行性，以中國春、硬粒小麥-簇毛麥雙二倍體、小麥-長穗偃麥草雙二倍體、小麥-中間偃麥草部分雙二倍體（7047）、小麥-多年生簇毛麥附加系、小麥-非洲黑麥雙二倍體、小麥-中間偃麥草部分雙二倍體（15n-21）、中國春-智利大麥雙二倍體、圓錐小麥-頂芒山羊草雙二倍體、圓錐小麥-單芒山羊草雙二倍體、小麥-偏凸山羊草部分雙二倍體、烏拉爾圖小麥-沙融山羊草雙二倍體、栽培一粒小麥-二角山羊草、小麥-無芒山羊草雙二倍體、中國春-希爾斯山羊草雙二倍體和小麥-尾狀山羊草雙二倍體為研究材料進行PCR擴增，結果發(fā)現，25對引物都可以在供試材料間擴增出明顯多態(tài)性。因此，這些多態(tài)性標記可以應用于檢測小麥背景的外源染色質。引物Triad＿24、Triad＿82、Triad＿199、Triad＿220、Triad＿291和Triad＿352的擴增結果如圖3所示。

圖3 Triad＿24等6對引物在小麥遠緣雜交種質中擴增產物的PAGE電泳檢測圖譜

表2 標記名稱及引物

3 討論與結論

小麥EST-SSR引物、SSR引物、STS引物和PLUG引物均可用于小麥近緣物種標記開發(fā)［14-20］。李 宏 偉［14］、李 飛［15］、陳 仕 勇［16］、徐鑫［17］和宿俊吉［18］等分別對小麥EST-SSR引物在小麥及近緣物種間遺傳多樣性、小麥和黑麥草間通用性、小麥和垂穗披堿草間通用性、小麥與長穗偃麥草間通用性、小麥與冰草間通用性進行了研究，認為部分引物可用于小麥近緣物種標記開發(fā)。徐鑫［17］、宿俊吉［18］、王黎明［19］、嚴學兵［20］等分別對小麥SSR引物在小麥與長穗偃麥草間通用性、小麥與冰草間通用性、小麥與中間偃麥草通用性、小麥與披堿草間通用性進行了研究，認為部分引物可用于小麥近緣物種標記開發(fā)。此外，徐鑫［17］還對小麥STS引物和PLUG引物在普通小麥和長穗偃麥草間的通用性進行了研究，認為部分STS引物和PLUG引物可以用于開發(fā)長穗偃麥草標記。上述研究均是利用其他已經發(fā)表文獻為基礎進行引物通用性研究，且所用小麥近緣物種為某一物種或某一屬的較少幾個物種。本研究通過自主篩選小麥A、B和D染色體共線性基因某一內含子三個亞基因組間長度差異超過10 bp的區(qū)域，在該內含子上下游的外顯子保守序列處設計引物，對小麥族黑麥屬、簇毛麥屬、大麥屬、偃麥草屬、山羊草屬等物種進行PCR擴增驗證，建立了能檢測小麥近緣物種的通用標記，為小麥近緣物種標記開發(fā)提供了新的研究思路。

不同類型引物在小麥近緣物種染色體特異標記開發(fā)效率方面，González等［21］利用RAPD引物開發(fā)黑麥染色體標記，開發(fā)效率為32.86%（46／140）。Liu［22］、劉曉明［23］、Gong［24］、Said［25］等分別利用EST-STS引物開發(fā)希爾斯山羊草、高大山羊草、尾狀山羊草和大麥染色體特異標記，開發(fā)效率分別為13.89%（20／144）、5.00%（6／120）、3.66%（15／410）和9.09%（4／44）。Liu［22］、Said［25］、Zhao［26］等分別利用SSR引物開發(fā)高大山羊草、大麥和簇毛麥染色體特異標記，開發(fā)效率分別為12.50%（2／16）、12.90%（8／62）和2.44%（2／82）。Gong等［24，27］分別利用COS引物開發(fā)尾狀山羊草和希爾斯山羊草染色體特異標記，開發(fā)效率分別為3.74%（4／107）和3.61%（3／83）。Gong［24，27］、Liu［28，29］等分別利用PLUG引物開發(fā)尾狀山羊草、希爾斯山羊草、無芒山羊草、頂芒山羊草染色體特異標記，開發(fā)效率分別為12.43%（23／185）、5.00%（3／60）、8.97%（13／145）和8.94%（47／526）。RAPD引物擴增效果非常不穩(wěn)定［30］，近十年來在小麥族物種研究中已被基本棄用。其它引物如SSR、COS和PLUG等對不同小麥近緣物種染色體特異標記開發(fā)效率從2.44%～13.88%不等。本研究利用新開發(fā)的內含子擴增引物對小麥族不同物種進行擴增，開發(fā)標記的比例為69.44%（25／36），顯著高于上述研究，因而，該方法可廣泛應用于小麥近緣物種染色體特異標記建立研究。

致謝：感謝山東農業(yè)大學倪飛教授和山東省農業(yè)科學院作物研究所張榮志副研究員在生物信息學分析方面給予的大力幫助，感謝江蘇大學何華綱在PAGE電泳技術中給予的指導和幫助。