趙聚萍 羅世菊 李曉捷 王利芹

摘 要：為確定海帶（Saccharina japonica）配子體紫外線輻射的適合劑量范圍，利用紫外線對(duì)東方海洋種質(zhì)庫保存的2個(gè)海帶配子體克隆系進(jìn)行輻射試驗(yàn)。通過三次預(yù)試驗(yàn)，輻射條件設(shè)置為：輻射距離12 cm，輻射時(shí)間分別為10、20、30、40、50、60、90、120 s。結(jié)果顯示：輻射時(shí)間10、20 s配子體細(xì)胞未發(fā)生明顯變化，但受輻射影響，克隆約2個(gè)月的時(shí)間不生長;輻射時(shí)間30 s細(xì)胞存活率約為50%～55%;隨著輻射時(shí)間的增加，細(xì)胞死亡增多;輻射時(shí)間120 s下，兩個(gè)克隆系只有極個(gè)別細(xì)胞存活。在輻射距離12 cm時(shí)，輻射時(shí)間10～120 s作用范圍內(nèi)，雄配子體耐受力明顯高于雌配子體。

關(guān)鍵詞：誘變育種;紫外線輻射;海帶（Saccharina japonica）;配子體

海帶（Saccharina japonica）屬于冷水性大型海藻，是我國海水養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)藻類，在我國養(yǎng)殖面積很廣。從上世紀(jì)50年代開始，我國開始進(jìn)行海帶大規(guī)模人工養(yǎng)殖，經(jīng)過幾十年的發(fā)展，目前已經(jīng)形成了較為成熟的養(yǎng)殖技術(shù)體系和較為完善的產(chǎn)業(yè)鏈[1]。配子體克隆技術(shù)的建立，使海帶的種質(zhì)得以長久保存，并且通過配子體雜交技術(shù)培育海帶新品種，解決了傳統(tǒng)育苗育種選育周期長、優(yōu)良性狀容易退化等問題。為了豐富育種素材，采用物理誘變等方式誘導(dǎo)海帶配子體產(chǎn)生變異，能縮短獲得優(yōu)良變異植株的時(shí)間。

海帶常規(guī)育種方法有定向選擇、誘變、雜交結(jié)合連續(xù)自交等。由于常規(guī)育種方法自然突變的發(fā)生率低[2]，因此經(jīng)常利用物理、化學(xué)等誘變手段，提高突變率，加速育種進(jìn)程。紫外線輻射是物理誘變的一種，具有操作安全、簡單、對(duì)環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)。紫外線輻照影響DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，引起基因突變和染色體畸變，產(chǎn)生各種各樣的變異[3]。目前，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，已有多個(gè)利用紫外線輻射誘變育種的報(bào)道[4-7]。

本研究利用紫外線對(duì)種質(zhì)庫保存的2個(gè)配子體克隆系進(jìn)行4次輻射試驗(yàn)，通過觀察輻照后海帶配子體細(xì)胞狀態(tài)及細(xì)胞死亡情況，判斷紫外線輻射對(duì)海帶配子體的作用范圍，以確定海帶配子體紫外線輻射的適合劑量范圍，為豐富育種素材，進(jìn)一步進(jìn)行海帶紫外線輻射育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選用的材料為山東東方海洋科技股份有限公司海藻實(shí)驗(yàn)室中保存的海帶配子體克隆RC571104004（♀）、RC571104005（♂）共2個(gè)克隆系。

1.2 試驗(yàn)方法

將2個(gè)克隆系的克隆分別用厚玻璃板壓磨，將壓磨后的克隆經(jīng)400目篩絹過濾，得到1～4個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞段濾液，倒入直徑9 cm的培養(yǎng)皿中，預(yù)培養(yǎng)5～7 d。用預(yù)培養(yǎng)后的克隆進(jìn)行試驗(yàn)。將15 W紫外線燈管固定在低溫冷藏箱內(nèi)，冷藏箱溫度為8～12 ℃。將培養(yǎng)皿內(nèi)的水倒掉，放在紫外線燈管下輻射，輻射完成后，加入低溫培養(yǎng)液，將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱內(nèi)暗光下培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度為8～12 ℃。65 d后，轉(zhuǎn)入弱光下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為6～10 μmol·m-2·s-1，光照周期為L∶D=24 h∶0。每天換水、鏡檢一次，觀察克隆狀態(tài)。

試驗(yàn)首先對(duì)試驗(yàn)輻射距離與輻射時(shí)間進(jìn)行探索，預(yù)試驗(yàn)的輻射距離與輻射時(shí)間見表1。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明在輻射距離為6 cm和12 cm;輻射時(shí)間為240～600 s的情況下，4～5 d時(shí)絕大部分細(xì)胞死亡;40～45 d時(shí)試驗(yàn)組細(xì)胞全部死亡。當(dāng)輻射距離為12 cm;輻射時(shí)間為60、120 s的情況下，9 d時(shí)部分細(xì)胞開始死亡;25 d時(shí)絕大部分細(xì)胞死亡，但克隆系之間與輻射組別之間均無差異;60 d時(shí)試驗(yàn)組的存活細(xì)胞開始逐漸恢復(fù)生長。通過這三次預(yù)試驗(yàn)，重新設(shè)置試驗(yàn)：輻射距離為12 cm，輻射時(shí)間為：10、20、30、40、50、60、90、120 s，以不輻射的樣本為對(duì)照。試驗(yàn)每個(gè)輻射劑量設(shè)3個(gè)平行，對(duì)照組3個(gè)平行。

2 結(jié)果

輻射完成后，每天鏡檢輻射克隆。不同鏡檢時(shí)間觀察對(duì)照組均生長正常，沒有明顯變化。輻射組前期鏡檢沒有明顯變化;15 d鏡檢部分輻射組出現(xiàn)死亡;50 d鏡檢各輻射組死亡情況趨于穩(wěn)定。輻射時(shí)間30 s組，雌、雄兩個(gè)克隆系細(xì)胞存活率均約為50%～55%;90 d鏡檢各輻射劑量存活細(xì)胞開始生長?！狻醿蓚€(gè)克隆系不同鏡檢時(shí)間鏡檢結(jié)果見表2，♀♂各輻射劑量存活情況見表3，♀♂各輻射劑量存活情況趨勢(shì)圖見圖1。

3 討論

試驗(yàn)材料的處理：先將海帶配子克隆利用厚玻璃板壓磨，過濾，得到1～4個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞段濾液，預(yù)培養(yǎng)5～7 d，待克隆附著牢固，細(xì)胞狀態(tài)恢復(fù)后進(jìn)行輻射。首先試驗(yàn)考慮到紫外線輻射的穿透性，避免因克隆細(xì)胞重疊，照射不到，影響試驗(yàn)結(jié)果;其次待克隆狀態(tài)恢復(fù)后進(jìn)行輻射，避免因壓磨對(duì)克隆細(xì)胞的損傷影響試驗(yàn)結(jié)果。

從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，利用15 W紫外線燈管對(duì)海帶配子體克隆進(jìn)行輻射，輻射距離為12 cm時(shí)，輻射時(shí)間10、20 s配子體細(xì)胞未發(fā)生明顯變化，但受輻射影響，克隆約2個(gè)月的時(shí)間不生長;輻射時(shí)間30 s細(xì)胞存活率約為50%～55%;隨著輻射時(shí)間的增加，細(xì)胞死亡增多;輻射時(shí)間120 s下，兩個(gè)克隆系只有極個(gè)別細(xì)胞存活。

輻射時(shí)間長時(shí)，雌、雄兩個(gè)克隆系均沒有存活細(xì)胞，雌、雄配子體沒有明顯區(qū)別;在輻射距離12 cm時(shí)，輻射時(shí)間10～120 s作用范圍內(nèi)，海帶雄配子體受輻射后表現(xiàn)晚于雌配子體，且細(xì)胞存活率高于雌配子體，因此海帶雄配子體對(duì)紫外線的耐受力明顯高于雌配子體。紫外線輻射時(shí)冷藏箱溫度為8～12 ℃，進(jìn)行試驗(yàn)操作時(shí)動(dòng)作迅速，輻射完成后加入低溫培養(yǎng)液等均為減少人為操作對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。另外，海帶配子體自身的狀態(tài)、外部環(huán)境等因素可能對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有一定的影響。

紫外線輻射可能誘導(dǎo)海帶配子體產(chǎn)生大量變異，對(duì)輻射后的海帶配子體克隆進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)、海帶配子體克隆育苗，期待能在較短時(shí)間內(nèi)獲得具有優(yōu)良性狀的變異植株，分離、保存與優(yōu)良性狀相關(guān)的新基因;還可以結(jié)合海帶配子體克隆細(xì)胞雜交技術(shù)獲得數(shù)量多、種類多的突變植株[8]。同時(shí)，利用海帶配子體克隆培養(yǎng)方法分離和培養(yǎng)目標(biāo)植株的配子體細(xì)胞，可以作為新的海帶遺傳資源進(jìn)行保存，豐富海帶種質(zhì)資源庫。另外，紫外線輻射操作安全、簡單，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)就可以進(jìn)行，不需要特殊儀器，因此還可以嘗試對(duì)海帶孢子體、海帶幼苗進(jìn)行輻射，觀察其突變情況，以期獲得新的具有優(yōu)良性狀的變異植株。

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Effects of ultraviolet radiation on the gametophyte clones of Saccharina japonica

ZHAO Juping， LUO Shiju， LI Xiaojie， WANG Liqin

（Shandong Oriental Ocean Sci-tech Co. Ltd.， National Algae and Sea Cucumber Engineering and Technique Research Center， Shandong Algae and Sea Cucumber Technology Innovation Center， Shandong Key Laboratory of Genetic Improvement & Efficient Culture of Marine Alage， Yantai 264003， China）

Abstract：Four ultraviolet radiation experiments were carried out on two gametophyte clones of Saccharina japonica， preserved in the germplasm bank of Shandong Oriental Ocean Sci-tech Co. Ltd. to screen the suitable dose range of ultraviolet radiation for mutation breeding. After three pre-tests， the experiment was set 12 cm for radiation distance， and 10 s， 20 s， 30 s， 40 s， 50 s， 60 s， 90 s， 120 s for radiation time， respectively.The results showed that no cell survived when the radiation distance was 6 cm. The gametophyte cell did not change significantly for 10 s and 20 s when the radiation distance was 12 cm， but the clones did not grow during a period of approximately 2 months; the survival rates of clones were about 50%～55% for 30 s; the number of death cells increased with the increase of radiation time; only a few cells survived for 120 s. The tolerance of male gametophytes was significantly stronger than that of female gametophytes when the radiation distance was 12 cm and the radiation time was 10～120 s.

Key words：mutation breeding; ultraviolet radiation; Saccharina japonica;gametophyte

（收稿日期：2021-02-22;修回日期：2021-03-23）

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“藍(lán)色糧倉科技創(chuàng)新”重點(diǎn)專項(xiàng)（2018YFD0901500）;現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金（CARS-50）;煙臺(tái)市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2018LJRC067）;山東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室專項(xiàng)建設(shè)計(jì)劃（SDKL2017009）;山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（SDAIT-26-11）。

作者簡介：趙聚萍（1983-），女，工程師，碩士，研究方向：海藻育種。E-mail：857946447@qq.com。