段鎮(zhèn)淳，張昭陽，林擁軍

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家植物基因研究中心，武漢 430070

生長素在植物的生長和發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用。植物可以快速感知并響應(yīng)生長素水平的變化，這些應(yīng)答反應(yīng)主要涉及2類生長素應(yīng)答基因，即生長素/吲哚-3-乙酸(Aux/IAA)基因家族和生長素應(yīng)答因子(auxin response factor,ARF)基因家族[1]。研究表明，Aux/IAA家族蛋白可以與ARF形成多個(gè)二聚體，在植物發(fā)育中具有多種作用，例如根系發(fā)育、枝條生長和果實(shí)成熟[2]。AUX/IAA家族的成員已被鑒定為短壽命核蛋白，包含4個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)[3]。AUX/IAA家族蛋白具有與ARF相互作用或抑制或激活A(yù)RF基因轉(zhuǎn)錄的特定結(jié)構(gòu)域。在低生長素濃度條件下，Aux/IAA蛋白與ARF因子結(jié)合并阻止生長素應(yīng)答基因的激活。在高生長素水平下，Aux/IAA蛋白被泛素化，隨后通過與生長素信號(hào)傳遞受體F-BOX(TIR1/AFB)相互作用的26S蛋白酶體結(jié)合而降解[4]。被釋放的ARF因子可調(diào)節(jié)下游生長素應(yīng)答基因的表達(dá)。通常,不同的TIR1/AFB與AUX/IAA蛋白組合具有不同的生長素結(jié)合親和力，并且生長素水平在不同的組織和發(fā)育階段有所不同，從而導(dǎo)致不同的生長素感應(yīng)作用[5]。生長素水平的時(shí)空動(dòng)態(tài)變化可以轉(zhuǎn)化為基因重編信號(hào)，精確地調(diào)節(jié)植物生長和發(fā)育的過程。OsIAA10基因的功能缺失突變體在經(jīng)過30 d的暗光誘導(dǎo)培養(yǎng)后，無法形成正常愈傷組織，且下胚軸不受生長素抑制而伸長[6]。但是其下游作用于哪個(gè)ARF因子，ARF因子下游作用的具體基因，尚不清楚。

CRL1啟動(dòng)子區(qū)域包含2個(gè)推定的生長素反應(yīng)元件(AuxRE)。AuxRE基序特異性作用于水稻ARF，并充當(dāng)CRL1表達(dá)的順式基序[7]。CRL1基因編碼1個(gè)側(cè)根形成正調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)受生長素信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的ARF直接調(diào)節(jié)，但具體的ARF因子還未知。在CRL1的根起始功能模型中，生長素調(diào)控AUX/IAA的降解，并且AUX/IAA與ARF相互作用，釋放的ARF與CRL1啟動(dòng)子中的AuxRE相互作用，觸發(fā)側(cè)根起始區(qū)域的CRL1基因轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致根形成起始[8]。本研究通過基因敲除、超表達(dá)結(jié)合誘導(dǎo)、酵母雜交等研究方法，確定生長素通路中的相互作用因子，揭示水稻愈傷組織形成與其根發(fā)育途徑的關(guān)聯(lián)性，以期為進(jìn)一步研究愈傷發(fā)生機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采用粳稻品種中花11進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，并以中花11黃化幼苗用于原生質(zhì)體分離。載體構(gòu)建過程中用到的菌株與載體參見文獻(xiàn)[6]。

rTaq酶、dNTP等常用PCR試劑與限制性內(nèi)切酶購于TaKaRa公司，組培試劑乙酰丁香酮、潮霉素、水解酪蛋白和2,4-D 等購自Sigma公司，引物合成和測(cè)序等工作均由生工生物工程(上海)公司 承擔(dān)，詳見文獻(xiàn)[6]。

1.2 CRL1基因敲除載體的構(gòu)建

選擇CRL1基因序列上 CDS 區(qū)的2個(gè)靶位點(diǎn)，分別為pYLCRISPR/Cas9-MH 多靶點(diǎn)載體構(gòu)建體系的U3靶點(diǎn)和 U6a 靶點(diǎn)，構(gòu)建gRNA表達(dá)盒，核酸序列為GGCCACCATGAACAACTGGCTGG，ACGACGGCGACGATGGCTGGTGG(核酸序列5′-3′) 。

1.3 CRL1基因超表達(dá)載體的構(gòu)建

以pCAMBIA1300s(35S啟動(dòng)子)超表達(dá)載體作為克隆載體的骨架,在載體的多克隆位點(diǎn)處插入CRL1基因的基因組全長序列。PCR擴(kuò)增出的目的片段使用試劑盒純化回收，以BamHⅠ、KpnⅠ雙酶切載體及目的片段，回收酶切產(chǎn)物[1]。之后再通過NEB T4-連接酶的連接體系將目的片段連接至線性化載體。得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)過夜后挑取生長健康的單克隆菌落至對(duì)應(yīng)抗性的3 mL LB液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，抽出質(zhì)粒后測(cè)序鑒定[9]。

1.4 農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化水稻

將測(cè)序無誤的終載體電轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，通過挑取單克隆抽提質(zhì)粒，測(cè)序鑒定陽性菌落，篩選培養(yǎng)過程參見文獻(xiàn)[6]。

1.5 轉(zhuǎn)化植株分子檢測(cè)

取CRL1基因敲除并過表達(dá)轉(zhuǎn)化植物的葉片，CTAB法提取DNA[9]。

1)對(duì)轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行陽性檢測(cè)。以提取的DNA樣品為模板，引物為潮霉素通用引物， PCR程序參見文獻(xiàn)[6]。

2)植物基因組編輯檢測(cè)。在2個(gè)目標(biāo)點(diǎn)外側(cè)200～400 bp處設(shè)計(jì)引物，通過擴(kuò)增出來的條帶的大小判斷基因敲除是否成功[6]。

1.6 CRL1純合敲除和超表達(dá)T1種子的愈傷組織誘導(dǎo)

選擇成熟飽滿一致的CRL1基因純合敲除和過表達(dá)的T1種子，以野生型作為對(duì)照。在正常的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，除去穎殼并挑選狀況良好且無病原體感染的種子。 將40粒種子浸泡于75%乙醇30 s，然后用無菌蒸餾水洗滌[2]。 加入0.15%HgCl2溶液，浸泡15～30 min，最后用無菌蒸餾水沖洗，直到白色泡沫消失。每瓶培養(yǎng)基中接種8粒種子，每個(gè)處理接種5瓶；在黑暗中于28 ℃培育30 d[6]。

1.7 OsIAA10的亞細(xì)胞定位

取生長15 d左右的水稻幼苗制備原生質(zhì)體細(xì)胞，并構(gòu)建OsIAA10-GFP融合表達(dá)載體。參照文獻(xiàn)[9]，于激光共聚焦顯微鏡下觀察融合蛋白在原生質(zhì)體中的表達(dá)部位。

1.8 OsIAA10互作蛋白篩選

構(gòu)建OsIAA10基因的誘餌載體，并與空文庫載體PPR3-N共轉(zhuǎn)化酵母菌株NMY51，在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培養(yǎng)基中培養(yǎng)，進(jìn)行自激活檢測(cè)[1]，膜蛋白文庫篩選過程參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行。

1.9 酵母雜交點(diǎn)對(duì)點(diǎn)互作驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

構(gòu)建的重組質(zhì)粒AD-OsARF和BD-OsIAA10共轉(zhuǎn)化至酵母AH109中，涂布于SD/-Trp/-Leu平板上[1]。菌落生長后，選擇少量單個(gè)菌落，并將其溶解在一定量的滅菌ddH2O中?；旌虾螅靡埔浩魑? μL的菌液點(diǎn)于SD/-Trp/-Leu和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade篩板(3個(gè)生物學(xué)重復(fù)樣本)。在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后，觀察酵母的生長。如果白色菌落在SD/-Trp/-Leu和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上生長，則表明OsARF和OsIAA10蛋白存在相互作用。如果白色菌落僅能在SD/-Trp/-Leu平板上生長，而不能在另外的平板上生長，則表明OsARF與OsIAA10蛋白沒有相互作用[1]。

2 結(jié)果與分析

2.1 CRL1敲除和超表達(dá)載體的構(gòu)建與檢測(cè)

CRISPR終載體質(zhì)粒構(gòu)建(圖1A)成功后,陽性質(zhì)粒串聯(lián)的gRNA表達(dá)盒用MluⅠ酶切(圖1B)，驗(yàn)證無誤后再測(cè)序確認(rèn)。將擴(kuò)增的CRL1基因全長序列插入到超表達(dá)載體(圖1C)，以KpnⅠ、BamHⅠ酶切檢測(cè)。

A.CRISPR 載體構(gòu)建; B.MluⅠ酶酶切CRISPR 終載體質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳; C.超表達(dá)終載體示意圖; D.瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)表達(dá)終載體。A. CRISPR vector diagram; B. Agarose gel electrophoresis image of CRISPR final vector plasmid digested by MluⅠ; C.Schematic diagram of overexpression final vector; D. Agarose gel electrophoresis image of overexpression final vector restriction detection.

2.2 敲除和超表達(dá)載體的遺傳轉(zhuǎn)化

將構(gòu)建的CRL1基因的CRISPR/Cas9 載體和超表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株 EHA105,轉(zhuǎn)化中花11愈傷，經(jīng)過2輪潮霉素篩選，得到的轉(zhuǎn)化苗進(jìn)行hpt陽性檢測(cè),CRL1基因敲除轉(zhuǎn)化苗進(jìn)行基因編輯檢測(cè)。CRL1基因的基因敲除突變體 T0代得到8個(gè)大片段缺失突變家系，超表達(dá)突變體T1代得到113株陽性突變苗(圖2)。

A.基因敲除突變體編輯結(jié)果的PCR檢測(cè)結(jié)果；B.超表達(dá)突變體PCR檢測(cè)結(jié)果。A.PCR detection results of the editing results of gene knockout mutants；B.PCR positive detection results of overexpression mutants.

2.3 CRL1純合敲除和超表達(dá)水稻種子的愈傷誘導(dǎo)

愈傷誘導(dǎo)結(jié)果顯示，CRL1的純合超表達(dá)家系種子并無顯著的誘導(dǎo)率與誘導(dǎo)速率變化；CRL1基因敲除家系種子表現(xiàn)出明顯不同表型，在誘導(dǎo)15 d后CRL1突變體種子未出現(xiàn)不規(guī)則的細(xì)胞團(tuán)，只有下胚軸的伸長。在誘導(dǎo)30 d后，對(duì)照組已產(chǎn)生健康的愈傷組織，而CRL1敲除突變體的種子沒有完整的愈傷組織(圖3)。暗示著CRL1基因可能是水稻種子愈傷誘導(dǎo)中的關(guān)鍵因子。

A:誘導(dǎo)15 d后的野生型種子與敲除突變體種子; B:誘導(dǎo)30 d后的野生型種子和敲除突變體種子;C:誘導(dǎo)30 d后的野生型種子和超表達(dá)突變體種子。 A:Wild-type seeds and knockout mutant seeds 15 days after induction; B:Wild-type seeds and knockout mutant seeds 30 days after induction;C:Wild-type seeds and overexpression mutant seeds 30 days after induction.

2.4 OsIAA10的亞細(xì)胞定位

將融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化中花11原生質(zhì)體,在培養(yǎng)12～16 h后，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察,結(jié)果顯示OsIAA10蛋白定位于細(xì)胞核與細(xì)胞膜上(圖4)。

圖4 OsIAA10在水稻原生質(zhì)體中的亞細(xì)胞定位Fig.4 Subcellular localization of OsIAA10 in rice protoplasts

2.5 OsIAA10互作蛋白篩選

DUAL膜系統(tǒng)文庫中使用的cDNA是野生型中花11在整個(gè)生長期的各種器官和組織的cDNA[1]。由于不清楚蛋白的N端、C端定位情況，直接對(duì)3個(gè)載體進(jìn)行自激活檢測(cè)，結(jié)果顯示OsIAA10只在pBT3-SUC載體中沒有自激活現(xiàn)象(圖5)。 對(duì)從相互作用陽性克隆中提取的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，并與水稻基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，以排除假陽性序列,獲得了4個(gè)主要的候選相互作用蛋白(表1)，都是OsARF家族的成員。

圖5 pGBKT7-OsIAA10自激活檢測(cè)Fig.5 pGBKT7 - OsIAA10 self activated test

表1 篩庫的候選互作蛋白信息Table 1 Screening library candidate interaction protein information

2.6 候選互作蛋白的驗(yàn)證

將OsARF5、OsARF17、OsARF21和OsARF23基因全長序列分別插入文庫載體pPR3-N,構(gòu)成4個(gè)篩選載體,與誘餌載體共轉(zhuǎn)至酵母AH109菌株中，于SD/-Ade/-His/-Ura/-Trp平板培養(yǎng)。結(jié)果顯示，OsARF5、OsARF17、OsARF21和OsARF23在酵母點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中均能夠和OsIAA10發(fā)生互作。

分別稀釋10倍與100倍，第1行至第5行分別為：陽性對(duì)照、陰性對(duì)照、BD-IAA10加AD空載、 AD-ARF5加BD空載、BD-IAA10與AD-ARF5。Diluting 10 times and 100 times,the first row to the fifth row of the figure are:positive control,negative control,BD-IAA10 plus AD no-load,AD-ARF5 plus BD no-load,BD-IAA10 and AD-ARF5.

2.7 CRL1與候選基因點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證

采用酵母ABA雜交系統(tǒng)，將構(gòu)建的含有轉(zhuǎn)錄因子基因的pGADT質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到誘餌菌株和突變誘餌菌株，pGAD-p53質(zhì)粒轉(zhuǎn)化為p53-ABAi菌株作為陽性對(duì)照[1]。 將轉(zhuǎn)化的酵母菌株涂在SD/-Leu培養(yǎng)基上，ABA的自激活抑制質(zhì)量濃度為500 ng/mL， 結(jié)果顯示，在沒有ABA的培養(yǎng)基上，包含所有轉(zhuǎn)化組合的酵母細(xì)胞可以正常生長。 在含有500 ng/mL ABA的培養(yǎng)基上，含有突變誘餌的酵母菌株根本無法生長，只有含有CRL1-ABAi+pGADT-OsARF5或CRL1-ABAi+pGADT-OsARF21或陽性對(duì)照組合的酵母細(xì)胞才可以生長。 基于此結(jié)果可以推斷，轉(zhuǎn)錄因子OsARF5和OsARF21可以結(jié)合酵母中CRL1基因的啟動(dòng)子區(qū)域的基序并激活抗性基因的表達(dá)。

圖7 酵母單克隆點(diǎn)對(duì)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)(陽性克隆驗(yàn)證)Fig.7 Yeast single-clone point-to-point experiments(proof of positive clone)

3 討 論

本研究通過基因敲除、超表達(dá)突變體結(jié)合突變體種子誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，證明了CRL1在調(diào)控水稻愈傷組織的形成中發(fā)揮重要作用，通過酵母雙雜交篩庫實(shí)驗(yàn)，篩選并驗(yàn)證了OsIAA10和OsARF5、OsARF17、OsARF21、OsARF23存在相互作用關(guān)系。通過酵母單雜交點(diǎn)對(duì)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了其中的OsARF5、OsARF21能和CRL1啟動(dòng)子區(qū)的特定元件結(jié)合，以此調(diào)控CRL1基因的轉(zhuǎn)錄。初步證明了CRL1基因是生長素通路中OsIAA10基因下游的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控基因，初步探明了一條在水稻愈傷組織誘導(dǎo)初期發(fā)揮重要作用的生長素調(diào)控通路。CRL1基因下游對(duì)生理生化過程的影響機(jī)制仍然未知，但是單從表型足以認(rèn)識(shí)到它的重要性。同時(shí)本研究中對(duì)CRL1基因的研究將生長素響應(yīng)的愈傷組織誘導(dǎo)途徑與冠根原基發(fā)育起始途徑兩者直接聯(lián)系了起來[10]。這與同家族的LBD16、LBD18等同源基因在擬南芥中發(fā)揮的作用類似。同時(shí)超表達(dá)突變體種子誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)異常，說明可能存在著未知的反饋調(diào)節(jié)通路[10-13]。

有研究顯示水稻CRL1基因下游調(diào)控基因超過600個(gè)[14-15]，許多基因和參與側(cè)根形成的擬南芥基因同源，但是其中大約有四分之一是水稻所特有的[16-18]。600多個(gè)基因中被上調(diào)表達(dá)的主要是涉及甲基化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、ROS和脂質(zhì)代謝以及細(xì)胞壁水解與合成等反應(yīng)過程的相關(guān)基因，下調(diào)的主要是與光合作用等反應(yīng)相關(guān)的基因[19-21]，這與愈傷誘導(dǎo)過程中的相關(guān)生化反應(yīng)比較吻合。

進(jìn)一步的研究可以從以下幾個(gè)方面進(jìn)行:(1)本研究結(jié)果顯示CRL1與OsIAA10、OsARF5、OsARF21之間存在調(diào)控關(guān)系,而IAA家族與ARF家族之間存在著保守的互作模式，CRL1上游是否還存在與OsIAA17等因子的調(diào)控關(guān)系？我們將繼續(xù)對(duì)此進(jìn)行深入的研究。(2)不同的水稻品種對(duì)組織培養(yǎng)的耐受能力不同[22-23]，CRL1在其中發(fā)揮的作用是否有差別，結(jié)合不同品種與激素條件，改善現(xiàn)有的優(yōu)良水稻品種組培力，培育出優(yōu)良的可組培品種，進(jìn)一步研究秈稻與粳稻品種之間組培力差異的原因，促進(jìn)優(yōu)良秈稻品種的生物技術(shù)改造和利用[24-26]。(3)CRL1在愈傷誘導(dǎo)過程中的表達(dá)模式是否與根發(fā)育過程存在不同？雖然愈傷誘導(dǎo)早期與根系發(fā)育的早期原基形成都受到CRL1控制[27]，但之后的生理發(fā)育過程卻相去甚遠(yuǎn)，是下游的哪一個(gè)調(diào)控步驟造成如此差異？之后的研究可以從組織分生模式、細(xì)胞增殖、激素穩(wěn)態(tài)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細(xì)胞壁水解與合成[28-30]等方面開展。