LED補(bǔ)光對(duì)弱光下番茄幼苗葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?/h1>
2021-06-07 06:13:28紀(jì)建偉李金鵬董貞芬李征明劉珍珍高湘荃繆新穎
紀(jì)建偉，李金鵬，董貞芬，李征明，劉珍珍，高湘荃，繆新穎
（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)信息與電氣工程學(xué)院，沈陽(yáng)110161；2.大連海洋大學(xué)信息工程學(xué)院，遼寧大連116023）
葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化與光合作用的各過程密切相關(guān)，光照強(qiáng)度是影響高等植物葉片的結(jié)構(gòu)與功能極為重要的環(huán)境因子[1],太陽(yáng)輻射是植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要來源，植物器官分化、建造、產(chǎn)量形成與品質(zhì)優(yōu)劣都是以光合速率和凈光合累計(jì)值為基礎(chǔ)的。光是植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要因子之一,北方地區(qū)冬季的蔬菜一般都是溫室大棚里種植的，但由于設(shè)施環(huán)境對(duì)光照的限制,溫室內(nèi)往往產(chǎn)生弱光逆境,因此園藝植物弱光脅迫已成為育種領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)?！叭豕狻币辉~在生理學(xué)方面的定義尚不明確，通常認(rèn)為環(huán)境光強(qiáng)持久或短暫顯著低于光飽和點(diǎn)，但不低于限制其生存的最低光照強(qiáng)度時(shí)的光環(huán)境，可以稱為弱光逆境[2]。葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)以其不需破碎細(xì)胞、簡(jiǎn)便快捷等優(yōu)勢(shì)，在農(nóng)業(yè)中廣泛應(yīng)用，國(guó)內(nèi)外多以葉綠素?zé)晒鈪?shù)為指標(biāo)，檢測(cè)植物受脅迫狀態(tài)[3]。目前，國(guó)內(nèi)外研究者在作物方面的熒光研究主要集中在葉綠素?zé)晒鈪?shù)技術(shù)[1]、快速熒光動(dòng)力學(xué)技術(shù)[4]、葉綠素?zé)晒夤庾V技術(shù)[5]，但由于植物內(nèi)部因子分布不均勻，在經(jīng)過同一種脅迫條件受到的傷害也可能是不均勻的，從而在同一時(shí)間同一片葉上也會(huì)展現(xiàn)出不同的熒光活性[6]。而葉綠素?zé)晒饪梢灾苯臃从持参锕庀到y(tǒng)的生理情況，植物葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)作為最早實(shí)用化的葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)，是目前世界上最權(quán)威、使用范圍最廣、種類最全面、發(fā)表論文最多的葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)。本研究以番茄作為研究對(duì)象，通過使用葉綠素?zé)晒鈨x分別對(duì)番茄幼苗進(jìn)行弱光脅迫與補(bǔ)光恢復(fù)的測(cè)量，獲取番茄幼苗的葉綠素?zé)晒鈪?shù)以及熒光圖像，通過熒光圖像提取特征值，與葉綠素參數(shù)進(jìn)行合并生成數(shù)據(jù)表，使用BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對(duì)植物受到脅迫狀態(tài)以及補(bǔ)光恢復(fù)進(jìn)行識(shí)別，為研究植物生長(zhǎng)受環(huán)境脅迫后的影響提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料
試驗(yàn)在沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)施農(nóng)業(yè)生物信息檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，選取遼園多麗、園藝L-404以及草莓番茄3個(gè)品種作為研究對(duì)象，晝夜溫度為(25±2)℃/(15±2)℃，相對(duì)濕度為50%～75%,光照以日均光合有效輻射600μmol·m-2·s-1進(jìn)行培育，育苗周期為35d[8]。出苗后篩選長(zhǎng)勢(shì)相同、葉片完整的番茄幼苗作為試驗(yàn)對(duì)象。
1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)
試驗(yàn)采用自然光照（約18000lx）將番茄苗在統(tǒng)一環(huán)境下培養(yǎng)，通過人工環(huán)境控制模擬陰天天氣過程，人工箱設(shè)置參數(shù)為：白天時(shí)間10h，人工箱光照強(qiáng)度設(shè)置參數(shù)33%（約6000lx），溫度25℃；夜間時(shí)間10h，光照強(qiáng)度0，溫度15℃，恒定濕度65%的人工模擬弱光環(huán)境，并且在人工箱環(huán)境的第1 天、第3 天、第5 天、第7 天、第9 天、第11天、第13天進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)量。第13天測(cè)量結(jié)束后，人工箱設(shè)置參數(shù)改為：白天時(shí)間10h[8]，人工箱光照強(qiáng)度設(shè)置參數(shù)100%（約23000lx），溫度25℃；夜間時(shí)間10h，光照強(qiáng)度0，溫度15℃，恒定濕度65%的環(huán)境進(jìn)行補(bǔ)光，并于第15天、第17天、第19天、第21天、第23天、第25天測(cè)量葉綠素?zé)晒鈪?shù)。
1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法
1.3.1 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定 進(jìn)行測(cè)量前首先要進(jìn)行暗適應(yīng)30min,圖1為普通相機(jī)所獲取的圖像與選用德國(guó)WALZ 公司IMAGING-PAM 藍(lán)光版葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)獲取的葉綠素?zé)晒鈭D像，該系統(tǒng)可以在不破壞葉片的情況下快速獲取葉綠素?zé)晒鈭D像以及檢測(cè)葉綠素參數(shù)。通過使用IMAGING-PAM 葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)配套的軟件IMAGINGWIN，在葉莖、葉片、葉脈上分別選取多個(gè)測(cè)量點(diǎn)，軟件的選擇圖片類型（Select type of image）區(qū)域，共有18 個(gè)熒光參數(shù)可供選擇，決定了圖像窗口顯示的圖像類型。選取基礎(chǔ)熒光Fo、熒光F、暗適應(yīng)后的最大熒光Fm、光下最大熒光Fm’、PSII最大光合效率Fv/Fm、PSII實(shí)際光合效率Y(II)、調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)額Y(NPQ)、非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)額Y(NO)、非光化學(xué)淬滅NPQ/4、非光化學(xué)淬滅系數(shù)qN、光化學(xué)淬滅系數(shù)qP、光化學(xué)淬滅系數(shù)qL這12個(gè)熒光參數(shù)圖像進(jìn)行討論分析，從熒光圖像中可以明顯看出經(jīng)弱光后葉片受脅迫情況,受脅迫區(qū)域在熒光圖像上顯示為高亮區(qū)域。
圖1 受脅迫后番茄葉片的熒光圖像Figure 1 The fluorescence image of tomato leaves under stress
1.3.2 葉綠素?zé)晒鈭D像的獲取 熒光成像技術(shù)從植物的熒光圖像中提取熒光參數(shù)、紋理、熒光強(qiáng)度等信息，處理并分析提取出來的顏色信息來應(yīng)用于實(shí)際脅迫檢測(cè)。選取F、Fm’、Fo’、Y(II)、Y(NPQ)、Y(NO)、NPQ、qN、qP、qL參數(shù)作為評(píng)估弱光脅迫后番茄葉片損傷的備選參數(shù)，各參數(shù)均由系統(tǒng)自動(dòng)生成。
1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 采用Excel 2016對(duì)獲取的熒光參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，求出測(cè)量點(diǎn)各熒光參數(shù)的均值，繪制折線圖，分析各熒光參數(shù)在受脅迫后的變化。
2 結(jié)果與分析
2.1 弱光脅迫及補(bǔ)光恢復(fù)對(duì)番茄幼苗的影響
2.1.1 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響 首先對(duì)測(cè)得的熒光參數(shù)進(jìn)行初步的處理，各測(cè)量點(diǎn)測(cè)量的參數(shù)取均值，整理后繪制各個(gè)參數(shù)曲線圖2。由圖2可知，熒光參數(shù)F、Fm’、Fo’、Y(NO)、qN受脅迫和補(bǔ)光后無明顯變化。發(fā)生脅迫后，Y(II)、qP、qL隨脅迫時(shí)間增長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，脅迫發(fā)生的第13 天，通過實(shí)際測(cè)量發(fā)現(xiàn)，3 個(gè)品種的番茄（L-404、草莓番茄、遼園多麗）測(cè)量的PSII 實(shí)際光合效率Y(II)分別比初始值降低36.6%、39.1%、34.1%，補(bǔ)光后第25d分別恢復(fù)至初始值的91.3%、86.3%、85.7；光化學(xué)淬滅系數(shù)qP分別比初始值降低35.1%、28.2%、31.3%，補(bǔ)光后分別恢復(fù)至初始值的89.9%、94.2%、92.7%；光化學(xué)淬滅系數(shù)qL分別比初始值降低48.5%、43.6、47.5%，補(bǔ)光后恢復(fù)至初始值的84.0%、88.6%、84.4%。Y(NPQ)、NPQ呈上升趨勢(shì)，其中調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)額Y(NPQ)分別比初始值升高21.6%、28.7%、25.1%，補(bǔ)光后分別恢復(fù)至初始值的103.4%、100.7%、102.4%；非光化學(xué)淬滅系數(shù)NPQ分別比初始值升高22.2%、23.0%、23.9%，補(bǔ)光后分別恢復(fù)至初始值的103.3%、102.8%、104.7%。其中這與DONG 等[9]利用葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)分析冷害對(duì)番茄幼苗影響的結(jié)果一致。毛劍飛等[10]在弱光脅迫及強(qiáng)光恢復(fù)對(duì)設(shè)施紅地球葡萄葉片光合及衰老特性的影響研究中，也得出光化學(xué)淬滅系數(shù)qP較弱光處理階段有降低趨勢(shì)，非光化學(xué)淬滅系數(shù)NPQ有上升趨勢(shì)這一結(jié)論。同時(shí)對(duì)于不同品種的番茄，受脅迫程度以及補(bǔ)光的恢復(fù)也有所差異。
圖2 番茄幼苗受脅迫及補(bǔ)光恢復(fù)后各熒光參數(shù)變化曲線Figure 2 Changes of fluorescence parameters of tomato seedlings under stress and light supplement
2.1.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)圖像 葉綠素?zé)晒鈭D像分析相比于傳統(tǒng)方法[11]，有著更直觀、準(zhǔn)確、快速的優(yōu)點(diǎn)，熒光圖像可以發(fā)現(xiàn)肉眼無法看到的損傷，選用德國(guó)WALZ 公司的最大葉綠素成像系統(tǒng)IMAGING-PAM-MAX/L 藍(lán)光版進(jìn)行葉片的葉綠素?zé)晒獬上?，獲得不同參數(shù)下的熒光圖像如圖3，對(duì)比各個(gè)參數(shù)的圖像后可以明顯的看出，F(xiàn)、Y(NO)、Fo’、Fm’、qN上無明顯冷害區(qū)域，Y(NPQ)、Y(II)、NPQ、qP、qL上有的冷害區(qū)域較為明顯。王文森[12]在對(duì)大豆在受到嚴(yán)重脅迫下的研究,將Y(NO)、Y(II)、qN、qP、qL葉綠素?zé)晒鈪?shù)及圖像的變化作為依據(jù)，得出可以對(duì)qP和qN進(jìn)行檢測(cè)進(jìn)而識(shí)別受到的主要脅迫為干旱/NaCl 脅迫。因此，可將Y(NPQ)、Y(II)、NPQ、qP、qL參數(shù)及圖像用于評(píng)估番茄幼苗弱光脅迫及補(bǔ)光恢復(fù)的有用參數(shù)。
圖3 不同葉綠素?zé)晒鈪?shù)下的熒光圖像Figure 3 Fluorescence image under different chlorophyll fluorescence parameters
2.2 篩選番茄葉片光敏感性的有用參數(shù)
調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)額Y(NPQ)較大，一方面表明光是過剩的，另一方面表明植物有能力通過自身的調(diào)節(jié)機(jī)制耗散掉過剩的光能而自我保護(hù)，如果植物沒有這種自身的耗散機(jī)制，過剩的光能會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生單線態(tài)氧或者自由基，這對(duì)植物的非常有害的[12]。參數(shù)NPQ為非光化學(xué)熒光淬滅，是過剩光能的指示劑，反映PSII 耗散過剩光能進(jìn)行自我保護(hù)的下調(diào)作用，植物主要通過跨膜質(zhì)子梯度介導(dǎo)的葉黃素循環(huán)來耗散多余光能。光化學(xué)淬滅系數(shù)qP與光化學(xué)淬滅系數(shù)qL均反映的是PSII 反應(yīng)中心的開放程度，值在0～1 之間。PSII 實(shí)際光合效率Y(II)這個(gè)熒光參數(shù)得自于熒光強(qiáng)度的比值，任何熒光激發(fā)強(qiáng)度或者葉綠素濃度的不均一因素都會(huì)被排除，而剩下的不同則表示光合活性的不同了，且Y(II)在一定程度上反應(yīng)植物光和系統(tǒng)的綜合狀態(tài)。綜合參數(shù)曲線及熒光圖像之間的對(duì)比，推薦Y(II)作為篩選番茄幼苗弱光脅迫的有用參數(shù)，通過對(duì)Y(II)熒光圖像的進(jìn)一步分析，來識(shí)別番茄葉片受脅迫的損傷。
2.3 提取顏色特征表格
特征提取是指使用計(jì)算機(jī)提取圖像信息，決定每個(gè)圖像的點(diǎn)是否屬于一個(gè)圖像特征。顏色特征是一種全局特征，描述了圖像的表面性質(zhì)。選擇Y(II)作為評(píng)估脅迫有用參數(shù)，將番茄幼苗受脅迫以及恢復(fù)過程中的Y(II)熒光圖像作為圖像信息的提取對(duì)象（圖4），從熒光圖像上可以看出受脅迫區(qū)域發(fā)生的變化及補(bǔ)光后恢復(fù)的情況。
圖4 弱光脅迫到補(bǔ)光恢復(fù)的Y(II)熒光圖像Figure 4 Y(II) fluorescence image from low light stress to light compensation recovery
由于大部分的數(shù)字圖像都是用RGB 這種顏色空間表達(dá)的，然而，RGB 空間結(jié)構(gòu)并不符合人們對(duì)顏色相似性的主觀判斷也不準(zhǔn)確。Lab 顏色空間色域大，定義的色彩多，且處理的速度與RGB 模式同樣快。因此，主要提取的顏色特征為R（紅色）、G（綠色）、B（藍(lán)色）、L（亮度）、a（紅色到綠色的范圍）b（黃色到藍(lán)色的范圍），6 組特征值如圖5。
圖5 顏色特征值表格Figure 5 Color eigenvalue table
2.4 統(tǒng)計(jì)分析模型訓(xùn)練
人工神經(jīng)網(wǎng)是一種無需事先給定確定關(guān)系，通過自身的訓(xùn)練，學(xué)習(xí)某種規(guī)則來進(jìn)行預(yù)測(cè)的數(shù)學(xué)建模方法[13]，適用于電氣控制、模式識(shí)別、預(yù)測(cè)估計(jì)等，也在生物學(xué)、植物學(xué)、經(jīng)濟(jì)學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域解決了許多實(shí)際問題，表現(xiàn)出了良好的智能特性。BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（back propagation）是一類基于誤差逆向傳播的方法，具有很強(qiáng)的非線性映射能力和柔性的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可以說是迄今為止最成功、應(yīng)用最廣泛的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)算法[14]。本研究以3個(gè)品種的番茄幼苗在弱光脅迫及補(bǔ)光恢復(fù)過程中的Y(II)熒光圖像為樣本，設(shè)計(jì)一種對(duì)補(bǔ)光恢復(fù)程度識(shí)別的模型，通過提取熒光圖像R、G、B、L、a、b共6個(gè)顏色特征值，得到模型所需的288個(gè)樣本，其中144個(gè)用于訓(xùn)練，訓(xùn)練次數(shù)為1000，使用trainglm 函數(shù)(Levenberg-Marquardt 算法，是一種迭代求函數(shù)極值的算法,有著收斂速度快，穩(wěn)定性強(qiáng)的特點(diǎn))，經(jīng)過建模和訓(xùn)練后，對(duì)受到弱光脅迫后并恢復(fù)的樣本識(shí)別率達(dá)到87.671%，總體準(zhǔn)確率R=98.9%，均方誤差為u=0.11421，具有一定準(zhǔn)確性，結(jié)果如圖6。
圖6 基于Y(II)的弱光脅迫后補(bǔ)光恢復(fù)識(shí)別模型均方誤差和訓(xùn)練結(jié)果Figure 6 The mean square error and training results of the recognition model based on Y(II)after light stress and light recovery
3 討論與結(jié)論
弱光環(huán)境對(duì)植物的生長(zhǎng)必然有一定的影響，由于設(shè)施環(huán)境的限制，往往滿足不了植物生長(zhǎng)的最適光照條件。目前對(duì)于補(bǔ)光的研究，也僅僅局限于人工追加光源進(jìn)行補(bǔ)光，并不能達(dá)到智能、準(zhǔn)確的按需補(bǔ)光。針對(duì)農(nóng)作物環(huán)境脅迫檢測(cè)的傳統(tǒng)有損檢測(cè)方法，存在著檢測(cè)周期長(zhǎng)、過程繁瑣且對(duì)植物損傷大等問題，提出了葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)對(duì)番茄幼苗受弱光迫及補(bǔ)光恢復(fù)程度的快速無損檢測(cè)的方法[15]。葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)[16]可以快速、無損傷的反映環(huán)境脅迫對(duì)植物的影響[17]，現(xiàn)已廣泛的應(yīng)用于光合生理和逆境生理等研究領(lǐng)域。
本研究以常見的番茄幼苗作為研究對(duì)象，經(jīng)過試驗(yàn)篩選出Y(II)作為評(píng)估弱光脅迫參數(shù)，并通過Y(II)的熒光圖像提取特征值，利用BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，借助MATLAB建立了基于Y(II)單參數(shù)的番茄幼苗弱光脅迫狀態(tài)識(shí)別模型[18]，對(duì)樣本的識(shí)別率達(dá)到87.671%，結(jié)果表明采用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對(duì)植物補(bǔ)光后的識(shí)別具有一定的準(zhǔn)確性。建模結(jié)果顯示，以Y(II)單參數(shù)建立的模型識(shí)別率最高，達(dá)到97.9%，識(shí)別效果良好。
在未來的研究中，可以通過增加不同補(bǔ)光時(shí)間、不同光照強(qiáng)度、不同光質(zhì)配比，以及選取更加典型的顏色特征，建立完善的弱光脅迫識(shí)別系統(tǒng)[19]，為實(shí)現(xiàn)番茄幼苗弱光脅迫的自動(dòng)識(shí)別、智能補(bǔ)光提供參考價(jià)值[20]。因此，在今后研究中，將利用多種建模方法來搭建一個(gè)對(duì)番茄幼苗弱光脅迫狀態(tài)識(shí)別率更高的模型。
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紀(jì)建偉，李金鵬，董貞芬，李征明，劉珍珍，高湘荃，繆新穎
（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)信息與電氣工程學(xué)院，沈陽(yáng)110161；2.大連海洋大學(xué)信息工程學(xué)院，遼寧大連116023）
葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化與光合作用的各過程密切相關(guān)，光照強(qiáng)度是影響高等植物葉片的結(jié)構(gòu)與功能極為重要的環(huán)境因子[1],太陽(yáng)輻射是植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要來源，植物器官分化、建造、產(chǎn)量形成與品質(zhì)優(yōu)劣都是以光合速率和凈光合累計(jì)值為基礎(chǔ)的。光是植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要因子之一,北方地區(qū)冬季的蔬菜一般都是溫室大棚里種植的，但由于設(shè)施環(huán)境對(duì)光照的限制,溫室內(nèi)往往產(chǎn)生弱光逆境,因此園藝植物弱光脅迫已成為育種領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)?！叭豕狻币辉~在生理學(xué)方面的定義尚不明確，通常認(rèn)為環(huán)境光強(qiáng)持久或短暫顯著低于光飽和點(diǎn)，但不低于限制其生存的最低光照強(qiáng)度時(shí)的光環(huán)境，可以稱為弱光逆境[2]。葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)以其不需破碎細(xì)胞、簡(jiǎn)便快捷等優(yōu)勢(shì)，在農(nóng)業(yè)中廣泛應(yīng)用，國(guó)內(nèi)外多以葉綠素?zé)晒鈪?shù)為指標(biāo)，檢測(cè)植物受脅迫狀態(tài)[3]。目前，國(guó)內(nèi)外研究者在作物方面的熒光研究主要集中在葉綠素?zé)晒鈪?shù)技術(shù)[1]、快速熒光動(dòng)力學(xué)技術(shù)[4]、葉綠素?zé)晒夤庾V技術(shù)[5]，但由于植物內(nèi)部因子分布不均勻，在經(jīng)過同一種脅迫條件受到的傷害也可能是不均勻的，從而在同一時(shí)間同一片葉上也會(huì)展現(xiàn)出不同的熒光活性[6]。而葉綠素?zé)晒饪梢灾苯臃从持参锕庀到y(tǒng)的生理情況，植物葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)作為最早實(shí)用化的葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)，是目前世界上最權(quán)威、使用范圍最廣、種類最全面、發(fā)表論文最多的葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)。本研究以番茄作為研究對(duì)象，通過使用葉綠素?zé)晒鈨x分別對(duì)番茄幼苗進(jìn)行弱光脅迫與補(bǔ)光恢復(fù)的測(cè)量，獲取番茄幼苗的葉綠素?zé)晒鈪?shù)以及熒光圖像，通過熒光圖像提取特征值，與葉綠素參數(shù)進(jìn)行合并生成數(shù)據(jù)表，使用BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對(duì)植物受到脅迫狀態(tài)以及補(bǔ)光恢復(fù)進(jìn)行識(shí)別，為研究植物生長(zhǎng)受環(huán)境脅迫后的影響提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料
試驗(yàn)在沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)施農(nóng)業(yè)生物信息檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，選取遼園多麗、園藝L-404以及草莓番茄3個(gè)品種作為研究對(duì)象，晝夜溫度為(25±2)℃/(15±2)℃，相對(duì)濕度為50%～75%,光照以日均光合有效輻射600μmol·m-2·s-1進(jìn)行培育，育苗周期為35d[8]。出苗后篩選長(zhǎng)勢(shì)相同、葉片完整的番茄幼苗作為試驗(yàn)對(duì)象。
1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)
試驗(yàn)采用自然光照（約18000lx）將番茄苗在統(tǒng)一環(huán)境下培養(yǎng)，通過人工環(huán)境控制模擬陰天天氣過程，人工箱設(shè)置參數(shù)為：白天時(shí)間10h，人工箱光照強(qiáng)度設(shè)置參數(shù)33%（約6000lx），溫度25℃；夜間時(shí)間10h，光照強(qiáng)度0，溫度15℃，恒定濕度65%的人工模擬弱光環(huán)境，并且在人工箱環(huán)境的第1 天、第3 天、第5 天、第7 天、第9 天、第11天、第13天進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)量。第13天測(cè)量結(jié)束后，人工箱設(shè)置參數(shù)改為：白天時(shí)間10h[8]，人工箱光照強(qiáng)度設(shè)置參數(shù)100%（約23000lx），溫度25℃；夜間時(shí)間10h，光照強(qiáng)度0，溫度15℃，恒定濕度65%的環(huán)境進(jìn)行補(bǔ)光，并于第15天、第17天、第19天、第21天、第23天、第25天測(cè)量葉綠素?zé)晒鈪?shù)。
1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法
1.3.1 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定 進(jìn)行測(cè)量前首先要進(jìn)行暗適應(yīng)30min,圖1為普通相機(jī)所獲取的圖像與選用德國(guó)WALZ 公司IMAGING-PAM 藍(lán)光版葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)獲取的葉綠素?zé)晒鈭D像，該系統(tǒng)可以在不破壞葉片的情況下快速獲取葉綠素?zé)晒鈭D像以及檢測(cè)葉綠素參數(shù)。通過使用IMAGING-PAM 葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)配套的軟件IMAGINGWIN，在葉莖、葉片、葉脈上分別選取多個(gè)測(cè)量點(diǎn)，軟件的選擇圖片類型（Select type of image）區(qū)域，共有18 個(gè)熒光參數(shù)可供選擇，決定了圖像窗口顯示的圖像類型。選取基礎(chǔ)熒光Fo、熒光F、暗適應(yīng)后的最大熒光Fm、光下最大熒光Fm’、PSII最大光合效率Fv/Fm、PSII實(shí)際光合效率Y(II)、調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)額Y(NPQ)、非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)額Y(NO)、非光化學(xué)淬滅NPQ/4、非光化學(xué)淬滅系數(shù)qN、光化學(xué)淬滅系數(shù)qP、光化學(xué)淬滅系數(shù)qL這12個(gè)熒光參數(shù)圖像進(jìn)行討論分析，從熒光圖像中可以明顯看出經(jīng)弱光后葉片受脅迫情況,受脅迫區(qū)域在熒光圖像上顯示為高亮區(qū)域。
圖1 受脅迫后番茄葉片的熒光圖像Figure 1 The fluorescence image of tomato leaves under stress
1.3.2 葉綠素?zé)晒鈭D像的獲取 熒光成像技術(shù)從植物的熒光圖像中提取熒光參數(shù)、紋理、熒光強(qiáng)度等信息，處理并分析提取出來的顏色信息來應(yīng)用于實(shí)際脅迫檢測(cè)。選取F、Fm’、Fo’、Y(II)、Y(NPQ)、Y(NO)、NPQ、qN、qP、qL參數(shù)作為評(píng)估弱光脅迫后番茄葉片損傷的備選參數(shù)，各參數(shù)均由系統(tǒng)自動(dòng)生成。
1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 采用Excel 2016對(duì)獲取的熒光參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，求出測(cè)量點(diǎn)各熒光參數(shù)的均值，繪制折線圖，分析各熒光參數(shù)在受脅迫后的變化。
2 結(jié)果與分析
2.1 弱光脅迫及補(bǔ)光恢復(fù)對(duì)番茄幼苗的影響
2.1.1 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響 首先對(duì)測(cè)得的熒光參數(shù)進(jìn)行初步的處理，各測(cè)量點(diǎn)測(cè)量的參數(shù)取均值，整理后繪制各個(gè)參數(shù)曲線圖2。由圖2可知，熒光參數(shù)F、Fm’、Fo’、Y(NO)、qN受脅迫和補(bǔ)光后無明顯變化。發(fā)生脅迫后，Y(II)、qP、qL隨脅迫時(shí)間增長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，脅迫發(fā)生的第13 天，通過實(shí)際測(cè)量發(fā)現(xiàn)，3 個(gè)品種的番茄（L-404、草莓番茄、遼園多麗）測(cè)量的PSII 實(shí)際光合效率Y(II)分別比初始值降低36.6%、39.1%、34.1%，補(bǔ)光后第25d分別恢復(fù)至初始值的91.3%、86.3%、85.7；光化學(xué)淬滅系數(shù)qP分別比初始值降低35.1%、28.2%、31.3%，補(bǔ)光后分別恢復(fù)至初始值的89.9%、94.2%、92.7%；光化學(xué)淬滅系數(shù)qL分別比初始值降低48.5%、43.6、47.5%，補(bǔ)光后恢復(fù)至初始值的84.0%、88.6%、84.4%。Y(NPQ)、NPQ呈上升趨勢(shì)，其中調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)額Y(NPQ)分別比初始值升高21.6%、28.7%、25.1%，補(bǔ)光后分別恢復(fù)至初始值的103.4%、100.7%、102.4%；非光化學(xué)淬滅系數(shù)NPQ分別比初始值升高22.2%、23.0%、23.9%，補(bǔ)光后分別恢復(fù)至初始值的103.3%、102.8%、104.7%。其中這與DONG 等[9]利用葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)分析冷害對(duì)番茄幼苗影響的結(jié)果一致。毛劍飛等[10]在弱光脅迫及強(qiáng)光恢復(fù)對(duì)設(shè)施紅地球葡萄葉片光合及衰老特性的影響研究中，也得出光化學(xué)淬滅系數(shù)qP較弱光處理階段有降低趨勢(shì)，非光化學(xué)淬滅系數(shù)NPQ有上升趨勢(shì)這一結(jié)論。同時(shí)對(duì)于不同品種的番茄，受脅迫程度以及補(bǔ)光的恢復(fù)也有所差異。
圖2 番茄幼苗受脅迫及補(bǔ)光恢復(fù)后各熒光參數(shù)變化曲線Figure 2 Changes of fluorescence parameters of tomato seedlings under stress and light supplement
2.1.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)圖像 葉綠素?zé)晒鈭D像分析相比于傳統(tǒng)方法[11]，有著更直觀、準(zhǔn)確、快速的優(yōu)點(diǎn)，熒光圖像可以發(fā)現(xiàn)肉眼無法看到的損傷，選用德國(guó)WALZ 公司的最大葉綠素成像系統(tǒng)IMAGING-PAM-MAX/L 藍(lán)光版進(jìn)行葉片的葉綠素?zé)晒獬上?，獲得不同參數(shù)下的熒光圖像如圖3，對(duì)比各個(gè)參數(shù)的圖像后可以明顯的看出，F(xiàn)、Y(NO)、Fo’、Fm’、qN上無明顯冷害區(qū)域，Y(NPQ)、Y(II)、NPQ、qP、qL上有的冷害區(qū)域較為明顯。王文森[12]在對(duì)大豆在受到嚴(yán)重脅迫下的研究,將Y(NO)、Y(II)、qN、qP、qL葉綠素?zé)晒鈪?shù)及圖像的變化作為依據(jù)，得出可以對(duì)qP和qN進(jìn)行檢測(cè)進(jìn)而識(shí)別受到的主要脅迫為干旱/NaCl 脅迫。因此，可將Y(NPQ)、Y(II)、NPQ、qP、qL參數(shù)及圖像用于評(píng)估番茄幼苗弱光脅迫及補(bǔ)光恢復(fù)的有用參數(shù)。
圖3 不同葉綠素?zé)晒鈪?shù)下的熒光圖像Figure 3 Fluorescence image under different chlorophyll fluorescence parameters
2.2 篩選番茄葉片光敏感性的有用參數(shù)
調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)額Y(NPQ)較大，一方面表明光是過剩的，另一方面表明植物有能力通過自身的調(diào)節(jié)機(jī)制耗散掉過剩的光能而自我保護(hù)，如果植物沒有這種自身的耗散機(jī)制，過剩的光能會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生單線態(tài)氧或者自由基，這對(duì)植物的非常有害的[12]。參數(shù)NPQ為非光化學(xué)熒光淬滅，是過剩光能的指示劑，反映PSII 耗散過剩光能進(jìn)行自我保護(hù)的下調(diào)作用，植物主要通過跨膜質(zhì)子梯度介導(dǎo)的葉黃素循環(huán)來耗散多余光能。光化學(xué)淬滅系數(shù)qP與光化學(xué)淬滅系數(shù)qL均反映的是PSII 反應(yīng)中心的開放程度，值在0～1 之間。PSII 實(shí)際光合效率Y(II)這個(gè)熒光參數(shù)得自于熒光強(qiáng)度的比值，任何熒光激發(fā)強(qiáng)度或者葉綠素濃度的不均一因素都會(huì)被排除，而剩下的不同則表示光合活性的不同了，且Y(II)在一定程度上反應(yīng)植物光和系統(tǒng)的綜合狀態(tài)。綜合參數(shù)曲線及熒光圖像之間的對(duì)比，推薦Y(II)作為篩選番茄幼苗弱光脅迫的有用參數(shù)，通過對(duì)Y(II)熒光圖像的進(jìn)一步分析，來識(shí)別番茄葉片受脅迫的損傷。
2.3 提取顏色特征表格
特征提取是指使用計(jì)算機(jī)提取圖像信息，決定每個(gè)圖像的點(diǎn)是否屬于一個(gè)圖像特征。顏色特征是一種全局特征，描述了圖像的表面性質(zhì)。選擇Y(II)作為評(píng)估脅迫有用參數(shù)，將番茄幼苗受脅迫以及恢復(fù)過程中的Y(II)熒光圖像作為圖像信息的提取對(duì)象（圖4），從熒光圖像上可以看出受脅迫區(qū)域發(fā)生的變化及補(bǔ)光后恢復(fù)的情況。
圖4 弱光脅迫到補(bǔ)光恢復(fù)的Y(II)熒光圖像Figure 4 Y(II) fluorescence image from low light stress to light compensation recovery
由于大部分的數(shù)字圖像都是用RGB 這種顏色空間表達(dá)的，然而，RGB 空間結(jié)構(gòu)并不符合人們對(duì)顏色相似性的主觀判斷也不準(zhǔn)確。Lab 顏色空間色域大，定義的色彩多，且處理的速度與RGB 模式同樣快。因此，主要提取的顏色特征為R（紅色）、G（綠色）、B（藍(lán)色）、L（亮度）、a（紅色到綠色的范圍）b（黃色到藍(lán)色的范圍），6 組特征值如圖5。
圖5 顏色特征值表格Figure 5 Color eigenvalue table
2.4 統(tǒng)計(jì)分析模型訓(xùn)練
人工神經(jīng)網(wǎng)是一種無需事先給定確定關(guān)系，通過自身的訓(xùn)練，學(xué)習(xí)某種規(guī)則來進(jìn)行預(yù)測(cè)的數(shù)學(xué)建模方法[13]，適用于電氣控制、模式識(shí)別、預(yù)測(cè)估計(jì)等，也在生物學(xué)、植物學(xué)、經(jīng)濟(jì)學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域解決了許多實(shí)際問題，表現(xiàn)出了良好的智能特性。BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（back propagation）是一類基于誤差逆向傳播的方法，具有很強(qiáng)的非線性映射能力和柔性的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可以說是迄今為止最成功、應(yīng)用最廣泛的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)算法[14]。本研究以3個(gè)品種的番茄幼苗在弱光脅迫及補(bǔ)光恢復(fù)過程中的Y(II)熒光圖像為樣本，設(shè)計(jì)一種對(duì)補(bǔ)光恢復(fù)程度識(shí)別的模型，通過提取熒光圖像R、G、B、L、a、b共6個(gè)顏色特征值，得到模型所需的288個(gè)樣本，其中144個(gè)用于訓(xùn)練，訓(xùn)練次數(shù)為1000，使用trainglm 函數(shù)(Levenberg-Marquardt 算法，是一種迭代求函數(shù)極值的算法,有著收斂速度快，穩(wěn)定性強(qiáng)的特點(diǎn))，經(jīng)過建模和訓(xùn)練后，對(duì)受到弱光脅迫后并恢復(fù)的樣本識(shí)別率達(dá)到87.671%，總體準(zhǔn)確率R=98.9%，均方誤差為u=0.11421，具有一定準(zhǔn)確性，結(jié)果如圖6。
圖6 基于Y(II)的弱光脅迫后補(bǔ)光恢復(fù)識(shí)別模型均方誤差和訓(xùn)練結(jié)果Figure 6 The mean square error and training results of the recognition model based on Y(II)after light stress and light recovery
3 討論與結(jié)論
弱光環(huán)境對(duì)植物的生長(zhǎng)必然有一定的影響，由于設(shè)施環(huán)境的限制，往往滿足不了植物生長(zhǎng)的最適光照條件。目前對(duì)于補(bǔ)光的研究，也僅僅局限于人工追加光源進(jìn)行補(bǔ)光，并不能達(dá)到智能、準(zhǔn)確的按需補(bǔ)光。針對(duì)農(nóng)作物環(huán)境脅迫檢測(cè)的傳統(tǒng)有損檢測(cè)方法，存在著檢測(cè)周期長(zhǎng)、過程繁瑣且對(duì)植物損傷大等問題，提出了葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)對(duì)番茄幼苗受弱光迫及補(bǔ)光恢復(fù)程度的快速無損檢測(cè)的方法[15]。葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)[16]可以快速、無損傷的反映環(huán)境脅迫對(duì)植物的影響[17]，現(xiàn)已廣泛的應(yīng)用于光合生理和逆境生理等研究領(lǐng)域。
本研究以常見的番茄幼苗作為研究對(duì)象，經(jīng)過試驗(yàn)篩選出Y(II)作為評(píng)估弱光脅迫參數(shù)，并通過Y(II)的熒光圖像提取特征值，利用BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，借助MATLAB建立了基于Y(II)單參數(shù)的番茄幼苗弱光脅迫狀態(tài)識(shí)別模型[18]，對(duì)樣本的識(shí)別率達(dá)到87.671%，結(jié)果表明采用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對(duì)植物補(bǔ)光后的識(shí)別具有一定的準(zhǔn)確性。建模結(jié)果顯示，以Y(II)單參數(shù)建立的模型識(shí)別率最高，達(dá)到97.9%，識(shí)別效果良好。
在未來的研究中，可以通過增加不同補(bǔ)光時(shí)間、不同光照強(qiáng)度、不同光質(zhì)配比，以及選取更加典型的顏色特征，建立完善的弱光脅迫識(shí)別系統(tǒng)[19]，為實(shí)現(xiàn)番茄幼苗弱光脅迫的自動(dòng)識(shí)別、智能補(bǔ)光提供參考價(jià)值[20]。因此，在今后研究中，將利用多種建模方法來搭建一個(gè)對(duì)番茄幼苗弱光脅迫狀態(tài)識(shí)別率更高的模型。
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