李 旭，王 玥，劉國(guó)力

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部,沈陽(yáng)110000；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)解剖組胚教研室,沈陽(yáng)110847)

木犀草素（luteolin,Lu）是存在于多種藥用植物中的黃酮類化合物,具有多種藥理活性,包括抗氧化、抗炎和神經(jīng)保護(hù)等作用。有研究表明,木犀草素可通過(guò)抑制核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)入核而下調(diào)巨噬細(xì)胞中炎癥細(xì)胞因子的表達(dá),同時(shí),它還可抑制一氧化氮和促炎性類花生酸的生成[1],說(shuō)明其具有有效的抗炎作用。木犀草素聯(lián)合蘆丁組合物可以通過(guò)調(diào)節(jié)腦內(nèi)遞質(zhì)水平、減少神經(jīng)元損傷和抑制炎癥反應(yīng)從而改善MPTP 所導(dǎo)致的小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力損傷[2]。因此,本研究通過(guò)腹腔注射MPTP 構(gòu)建帕金森?。╬arkinson disease,PD）小鼠模型,并使用木犀草素處理,旨在研究木犀草素對(duì)帕金森病小鼠模型的影響,并探究其是否可通過(guò)TLR4/yD88/NF-kB信號(hào)通路抑制小鼠腦內(nèi)黑質(zhì)區(qū)免疫炎癥反應(yīng)而改善小鼠的運(yùn)動(dòng)能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品 木犀草素（成都瑞芬思生物科技有限公司）；β-actin,TH,Bcl2,BAX,TLR4,MyD88,p-p65/NF-kB,NF-kB 和HRP-labeled goat anti-rabbit/mouse IgG 抗體均來(lái)自于Cell Signaling Technology；免疫組化試劑盒（福州邁鑫生物技術(shù)有限公司）,牛血清白蛋白（Sigma）,小鼠的TNF-α,IL-6 和IL-1β 的ELISA 試劑盒均購(gòu)自于Raybiotech；PVDF膜,蛋白Marker（Thermo）。

1.1.2 儀器 全自動(dòng)曠場(chǎng)記錄儀（江蘇淮北正華）、旋轉(zhuǎn)棒儀器（IITC Life Science）、低溫離心機(jī)、酶標(biāo)儀、BIORAD凝膠圖像分析系統(tǒng)、電泳儀、水平搖床、組化顯微鏡、冰凍切片機(jī)。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物與分組 10～12 周齡C57BL/6 野生型小鼠45 只,均購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK（京）2020-0004],體重20～25g。試驗(yàn)動(dòng)物分籠飼養(yǎng),每籠3～4 只,自由飲食,12h 晝夜交替飼養(yǎng),飼養(yǎng)室溫度保持在22～25°C。根據(jù)SPSS統(tǒng)計(jì)軟件產(chǎn)生隨機(jī)數(shù)字分為:對(duì)照組、模型組、治療組,每組15只；同月齡同背景15只,設(shè)為正常對(duì)照組,具體分組及給藥方法為：對(duì)照組，腹腔注射生理鹽水14d;MPTP模型組，首先給予生理鹽水3d,然后第4 天腹腔注射30mg·kg-1·d-1MPTP（溶于生理鹽水）,共5d,最后腹腔注射生理鹽水14d；木犀草素治療組，首先給予3d木犀草素（溶于生理鹽水）,然后第4天腹腔注射30mg·kg-1·d-1MPTP,共5d,繼續(xù)腹腔注射木犀草素6d。

1.2 方法

1.2.1 曠場(chǎng)試驗(yàn) 采用林臻等[3]方法,首先使3組小鼠在開始正式試驗(yàn)前適應(yīng)環(huán)境。將小鼠放在曠場(chǎng)中心,整個(gè)試驗(yàn)的持續(xù)時(shí)間為5min。主要記錄小鼠在曠場(chǎng)中心停止的時(shí)間和行走的總距離。使用的軟件為SMART v3.0軟件（Harvard Apparatus）。

1.2.2 旋轉(zhuǎn)桿試驗(yàn) 本試驗(yàn)使用旋轉(zhuǎn)棒儀器進(jìn)行行為能力的測(cè)試。每個(gè)轉(zhuǎn)軸以4r·min-1的速度開始旋轉(zhuǎn),并且獨(dú)立計(jì)時(shí),使旋轉(zhuǎn)速度在5min 內(nèi)勻速增加至40r·min-1。記錄小鼠從轉(zhuǎn)棒上掉落時(shí)的時(shí)間和距離。每只老鼠測(cè)試3次。

1.2.3 小鼠腦組織取材 腹腔注射戊巴比妥鈉（40mg·kg-1）麻醉小鼠。麻醉后眼球取血,室溫靜置20min 后離心取上清,-80°C 保存?zhèn)溆?然后小鼠經(jīng)生理鹽水灌流后迅速取出大腦放在冰上,從中間矢狀縫切開,一半放入4%多聚甲醛中固定,常規(guī)制備冰凍切片,用于免疫組化染色；另一半放入EP 管內(nèi),-80°C 保存?zhèn)溆?用于Western blot等分子生物學(xué)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.4 Western blot檢測(cè) 各組小鼠海馬皮層組織分別稱重,小剪刀剪碎樣品（冰上操作）,按1∶5比例加入蛋白裂解液,超聲粉碎,4°C 裂解過(guò)夜,4°C 12000r·min-1低溫離心 30min,取上清,BCA 蛋白濃度測(cè)定,每管 8μg 蛋白分裝,-80°C 凍存待用。12% SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品,5%脫脂奶粉封閉20min,Bace1 和PS1 抗體（1∶3000）4°C 孵育過(guò)夜,二抗室溫孵育 1h,ECL 發(fā)光（ECL 試劑盒,Pierce）。洗膜重新封閉后,β-actin 抗體（1∶12000）孵育,二抗孵育,發(fā)光,膠片曝光顯影。以β-actin作為上樣量參照標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.5 ELISA 檢測(cè) 取小鼠黑質(zhì),使用胰蛋白酶使其勻漿,嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒操作,測(cè)定小鼠黑質(zhì)區(qū)中TNF-α,IL-6和IL-1β的含量。

1.2.6 免疫組化染色 切片正常羊血清室溫預(yù)孵育1h,TH 抗體（1:100）孵育,4°C過(guò)夜。切片經(jīng)0.01M 的磷酸鹽緩沖液（pH值7.4）)充分漂洗后,用二抗（生物素標(biāo)記的羊抗兔或鼠的IgG）室育孵育2h,經(jīng)0.01M的磷酸鹽緩沖液（pH 值7.4）)充分漂洗后,加入三抗（外源性過(guò)氧化物酶阻斷）,37°C 孵育30min,室溫暗處DAB 顯色3～5min,中性樹膠封片。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM）表示,每組試驗(yàn)平行重復(fù)3次。采用單因素方差分析（ANOVA）比較均值之間的差異。數(shù)據(jù)分析采用Prism v7.0 軟件，p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 木犀草素改善由MPTP誘導(dǎo)的PD模型小鼠的運(yùn)動(dòng)能力和焦慮行為

曠場(chǎng)試驗(yàn)主要用于評(píng)估小鼠自發(fā)運(yùn)動(dòng)功能和探索行為。由表1可知,與對(duì)照組相比,MPTP模型鼠行走的總距離和進(jìn)去中心區(qū)域的總距離明顯縮短,進(jìn)入中心區(qū)域的次數(shù)明顯減少,而與MPTP 模型組相比,木犀草素處理組小鼠行走的總距離和進(jìn)去中心區(qū)域的總距離顯著延長(zhǎng)。除此之外,小鼠進(jìn)入中心區(qū)域的總次數(shù)明顯增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。

表1 各組小鼠曠場(chǎng)試驗(yàn)測(cè)試結(jié)果Table 1 Results of the open field test every group mice

由表2 可知,與對(duì)照組相比,MPTP 模型組小鼠旋轉(zhuǎn)時(shí)間和行走距離明顯縮短,而與MPTP 模型組相比,木犀草素處理后,小鼠旋轉(zhuǎn)時(shí)間和距離明顯延長(zhǎng)（p＜0.05）。以上結(jié)果說(shuō)明，木犀草素能夠改善MPTP 誘導(dǎo)的PD 模型鼠的運(yùn)動(dòng)能力。

2.2 木犀草素對(duì)MPTP誘導(dǎo)的PD模型小鼠黑質(zhì)酪氨酸羥化酶（TH）的影響

由圖1可知,與對(duì)照組相比,MPTP模型組的TH 染色陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目顯著減少,與模型組相比,木犀草素處理后神經(jīng)元數(shù)目明顯增多,Western blot結(jié)果也證實(shí)木犀草素處理后可明顯提高由MPTP 誘導(dǎo)的黑質(zhì)區(qū)TH 低表達(dá)（圖2）（p＜0.05）。以上結(jié)果說(shuō)明木犀草素具有神經(jīng)保護(hù)作用,抑制多巴胺能神經(jīng)元死亡。

表2 各組小鼠旋轉(zhuǎn)桿試驗(yàn)測(cè)試結(jié)果Table 2 Results of the rotarod test every group mice

圖1 各組小鼠黑質(zhì)區(qū)和紋狀體區(qū)的TH染色結(jié)果比較Figure 1 Comparison of the expression of TH in the SN and striatum in each group

圖2 各組小鼠黑質(zhì)區(qū)中TH的蛋白表達(dá)量變化Figure 2 Changes of protein expressions of TH in SN of mice with in each group

圖3 各組小鼠黑質(zhì)區(qū)中Bcl2和BAX的蛋白表達(dá)量變化Figure 3 Changes of protein expressions of Bcl2 and BAX in SN of mice with in each group

2.3 各組小鼠黑質(zhì)區(qū)凋亡蛋白表達(dá)情況

由圖3 可知,與對(duì)照組相比,模型組小鼠Bcl-2 的蛋白表達(dá)明顯降低,BAX 蛋白表達(dá)水平顯著升高,Bcl-2/BAX 比值降低；相比模型組,使用木犀草素處理小鼠后,Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高,BAX 蛋白表達(dá)水平顯著降低,Bcl-2/BAX 比值升高（p＜0.05）,說(shuō)明木犀草素能夠抑制由MPTP 誘導(dǎo)的PD 模型鼠的黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元凋亡。

2.4 木犀草素對(duì)MPTP誘導(dǎo)的PD模型小鼠黑質(zhì)區(qū)炎癥因子水平的影響

由表3可知,模型組小鼠黑質(zhì)區(qū)炎癥因子TNF-α,IL-6 和 IL-1β 水平高于對(duì)照組,木犀草素給藥處理后,治療組小鼠黑質(zhì)區(qū)炎癥TNF-α,IL-6 和IL-1β因子水平顯著降低（p＜0.05）。以上結(jié)果說(shuō)明，木犀草素可抑制MPTP 誘導(dǎo)帕金森模型小鼠腦內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)。

表3 各組小鼠ELISA檢測(cè)結(jié)果Table 3 Results of the ELISA every group mice

2.5 木犀草素對(duì)MPTP誘導(dǎo)的PD模型小鼠黑質(zhì)區(qū)中TLR4/MyD88/NF-kB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用

與對(duì)照組相比,模型組中TLR4,MyD88 和p-p65 NF-kB 的表達(dá)量顯著性升高；當(dāng)給予木犀草素后,其TLR4,MyD88 和p-p65 NF-kB 表達(dá)量顯著性降低（圖4）（p＜0.05）。以上結(jié)果說(shuō)明,木犀草素可能通過(guò)TLR4/MyD88/NF-kB信號(hào)通路抑制小鼠黑質(zhì)區(qū)免疫炎癥反應(yīng),進(jìn)而改善MPTP誘導(dǎo)的PD模型小鼠的運(yùn)動(dòng)能力。

圖4 各組小鼠黑質(zhì)區(qū)中MyD88和NF-κB/TLR4的蛋白表達(dá)量變化Figure 4 Changes of protein expressions of MyD88 and NF-κB/TLR4 in SN of mice with in each group

3 討論與結(jié)論

目前研究認(rèn)為,帕金森病是一種累及多系統(tǒng)的神經(jīng)退行性疾病,伴有認(rèn)知功能障礙、焦慮抑郁情緒等多種非運(yùn)動(dòng)癥狀,由于無(wú)有效的治愈手段,因此對(duì)生活質(zhì)量的影響較大[4]。其主要病理特征是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元缺失與死亡。近年來(lái)研究結(jié)果顯示,神經(jīng)炎癥與PD 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5-7]。在PD 動(dòng)物模型中也發(fā)現(xiàn),黑質(zhì)區(qū)除了一氧化氮合酶升高外,伴隨著小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化[8]。因此,炎癥可能是PD 發(fā)病過(guò)程中重要的致病因素。研究顯示,黃酮類化合物碧桂花醇是一種常見的膳食補(bǔ)充劑,其可通過(guò)抑制由小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞所引起的免疫炎癥反應(yīng),進(jìn)而改善PD小鼠的運(yùn)動(dòng)能力,因此早期應(yīng)用黃酮類藥物可能是預(yù)防和治療帕金森病的潛在策略[9]。而木犀草素也是一種黃酮類化合物,具有多種藥理學(xué)作用,包括抗氧化,抗炎和保護(hù)神經(jīng)元等作用。研究發(fā)現(xiàn),木犀草素能夠以劑量依賴的方式抑制巨噬細(xì)胞中TNF-α和IL-6的產(chǎn)生。除此之外,木犀草素可降低由魚藤酮引起的小鼠多巴胺能神經(jīng)元MN9D 細(xì)胞氧化應(yīng)激水平,進(jìn)而起到保護(hù)神經(jīng)元的作用[10],而本研究證實(shí)木犀草素通過(guò)抑制免疫炎癥反應(yīng)而減少多巴胺能神經(jīng)元凋亡,最終改善由MPTP 誘導(dǎo)的PD 模型鼠的運(yùn)動(dòng)能力。

TLR4是Toll樣受體家族（toll-like receptors,TLRs）受體家族重要成員,是神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞膜上的重要炎性受體,其功能主要是促進(jìn)炎性細(xì)胞因子和免疫調(diào)控分子表達(dá)[11-12]。MyD88 是TLR4 介導(dǎo)炎性信號(hào)通路的重要胞內(nèi)接頭蛋白,具有負(fù)責(zé)募集下游信號(hào)分子的N 端死亡結(jié)構(gòu)域（death domain,DD）和承接TLRs活化信號(hào)的C 端TIR 結(jié)構(gòu)域,NF-κB 是TLR4/MyD88 下游的重要節(jié)點(diǎn),由胞漿轉(zhuǎn)移到胞核內(nèi),發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,激活炎癥因子IL-1β、IL-8和TNF-α 等炎性基因的表達(dá),最終導(dǎo)致炎癥因子釋放[13-16]。本研究結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,MPTP 造模后炎癥因子TNF-α,IL-6 和IL-1β 表達(dá)增加,而當(dāng)木犀草素處理后,可顯著降低TLR4,MyD88和NF-κB 的蛋白表達(dá),說(shuō)明TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路介導(dǎo)了木犀草素對(duì)炎癥因子TNF-α,IL-6和IL-1β 的調(diào)控作用。

本研究中,PD小鼠黑質(zhì)部位的發(fā)生炎癥反應(yīng)的同時(shí),伴隨大量的多巴胺能神經(jīng)元凋亡,與對(duì)照組相比,MPTP誘導(dǎo)后,TH染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少,凋亡通路被激活,凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/BAX比值降低,而木犀草素處理后,TH染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多,Bcl-2/BAX比值升高,說(shuō)明木犀草素可抑制MPTP誘導(dǎo)的小鼠黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元凋亡,進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)元,緩解小鼠的帕金森樣改變。除此之外,行為學(xué)試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)木犀草素可改善MPTP 誘導(dǎo)小鼠的運(yùn)動(dòng)能力。

本研究結(jié)果表明，TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路介導(dǎo)了木犀草素對(duì)MPTP 誘導(dǎo)的帕金森小鼠腦內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)的抑制作用,進(jìn)而緩解小鼠黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元變性及凋亡,最終改善小鼠的運(yùn)動(dòng)能力。