曾令杰，黃錦翔，豐丕雪，安佳星，佀再勇，龍秀鋒，易弋*

1(廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州，545006)2(廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 柳州，545006)

木質(zhì)纖維素是自然界中含量最豐富的一種清潔、可再生資源，其水解液可通過(guò)釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素乙醇，能有效緩解緊迫的能源危機(jī)和環(huán)境污染問(wèn)題[1-2]。然而在木質(zhì)纖維素水解液中存在多種抑制劑，會(huì)對(duì)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)和乙醇產(chǎn)量產(chǎn)生負(fù)面影響[3]?？梢愿鶕?jù)水解過(guò)程中產(chǎn)生的抑制物的化學(xué)性質(zhì)不同分為以下幾類：弱酸類(乙酰丙酸、甲酸、乙酸等)、呋喃類(糠醛、5-羥甲基糠醛等)和酚類物質(zhì)(苯酚、香草醛、兒茶酚等)[4-5]。其中甲酸是呋喃類化合物進(jìn)一步降解形成的，而乙酸則主要是在半纖維素脫乙酰的過(guò)程中產(chǎn)生的[6]。甲酸的濃度通常比乙酸低，但對(duì)釀酒酵母的毒性比乙酸高[7-8]。劉容等[9]研究了甲酸對(duì)季也蒙假絲酵母發(fā)酵木糖醇的影響，結(jié)果表明添加1 g/L甲酸對(duì)發(fā)酵具有較為明顯的抑制作用，而添加5 g/L甲酸幾乎完全抑制了發(fā)酵。李小娟等[10]也研究了甲酸對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)、發(fā)酵過(guò)程的影響，結(jié)果表明釀酒酵母可耐受甲酸質(zhì)量濃度為1.8 g/L，且隨著甲酸濃度的增高，對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)的抑制逐漸加強(qiáng)，且能抑制60%的乙醇生產(chǎn)。宋曉川等[11]研究了碳水化合物的降解產(chǎn)物對(duì)釀酒酵母NLH13乙醇發(fā)酵毒性的影響，在甲酸質(zhì)量濃度達(dá)2 g/L時(shí)，糖利用率大幅度下降。盡管不容易闡明弱酸的抑制機(jī)制，但有人提出弱酸的抑制作用歸因于解偶聯(lián)理論和細(xì)胞內(nèi)陰離子積累[12-13]。也有研究認(rèn)為甲酸對(duì)微生物細(xì)胞的毒性與溶液的pH值有關(guān)[14-15]。WANG等[16]研究發(fā)現(xiàn)在釀酒酵母分批培養(yǎng)過(guò)程中，強(qiáng)酸脅迫(pH值為1.5)能明顯抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝。NIGAM[17]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)適當(dāng)調(diào)節(jié)pH值可以減少甲酸的抑制作用，提高燃料乙醇生產(chǎn)效率。此外，甲酸對(duì)細(xì)胞的毒性作用可能跟胞內(nèi)活性氧積累有關(guān)，LEE等[18]通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)甲酸會(huì)引起釀酒酵母細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致抑制的細(xì)胞分裂和死亡。杜林等[19]研究表明低濃度的甲酸可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體活性氧快速產(chǎn)生，對(duì)數(shù)期釀酒酵母細(xì)胞對(duì)甲酸更為敏感，死亡率更高。因此如何消減木質(zhì)纖維素水解液中的酸類細(xì)胞抑制劑對(duì)水解和發(fā)酵的不利影響是提高乙醇轉(zhuǎn)化效率的一個(gè)重要挑戰(zhàn)。

本研究采用RNA-seq技術(shù)，對(duì)釀酒酵母在1.8 g/L甲酸培養(yǎng)條件下進(jìn)行了測(cè)序分析，并結(jié)合生物信息學(xué)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)注釋和富集分析，初步揭示了甲酸脅迫下釀酒酵母的分子響應(yīng)機(jī)制，為進(jìn)一步如何提高釀酒酵母木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物抑制劑的耐受性提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

釀酒酵母(S.cerevisiaeGGSF16)由廣西科技大學(xué)微生物研究室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉10，蛋白胨20，葡萄糖20，pH值自然，115 ℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉10，蛋白胨20，葡萄糖160，pH值自然，115 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要儀器

456-GC氣相色譜儀，天美創(chuàng)科儀器(北京)有限公司；HITACHI高效液相色譜儀、HIMAC大容量冷凍離心機(jī)，日本株式會(huì)社日立制作所；DY-6D DNA電泳儀，北京市六一儀器廠；UV-1100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀儀器有限公司；ZWYD-2402搖床、ZHJH-C112C超凈臺(tái)，上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；B-500微量分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；H2100R離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

1.2.2 主要試劑

葡萄糖(BR)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨(BR)，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；酵母粉(BR)，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；甲酸(AR)，西隴科學(xué)股份有限公司；RNA提取試劑盒，大連寶生物；DNA Marker，北京索萊寶科技有限公司；Tris，BioFroxx公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 甲酸對(duì)釀酒酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

從斜面試管中挑取保藏的酵母菌株于YPD培養(yǎng)基中，在30 ℃，150 r/min搖床中培養(yǎng)14 h后，按照10%接種量接種于新鮮的YPD培養(yǎng)基中，在搖床中培養(yǎng)6 h至指數(shù)中期，初始酵母細(xì)胞數(shù)為4.2×107CFU/mL。取30 mL菌液于12 000 r/min離心3 min，棄上清液，并加入無(wú)菌水制成10倍濃縮種子菌懸液。將種子濃縮菌懸液接種到含有終質(zhì)量濃度為1.2、1.5、1.8、2.1 g/L甲酸溶液的發(fā)酵培養(yǎng)基中，以未添加甲酸的菌液作為對(duì)照組， 30 ℃培養(yǎng)24 h，每隔2 h取樣在600 nm下測(cè)定光度吸收值，并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.2 甲酸對(duì)釀酒酵母發(fā)酵性能的影響

根據(jù)釀酒酵母的生長(zhǎng)情況，選擇1.8 g/L的甲酸進(jìn)行發(fā)酵性能的測(cè)定。按照1.3.1的方法，以添加甲酸的菌液為實(shí)驗(yàn)組，未添加甲酸的菌液為對(duì)照組，在30 ℃，150 r/min搖床中培養(yǎng)24 h，每隔2 h取樣，測(cè)殘?zhí)羌耙掖己俊１敬螌?shí)驗(yàn)采用高效液相色譜儀檢測(cè)糖類物質(zhì)，用Alltima 5 μm Amino(250 mm×4.6 mm)柱子檢測(cè)發(fā)酵液中葡萄糖的含量。液相色譜檢測(cè)糖的方法為:V(色譜純乙腈)∶V(超純水)=80∶20的混合溶液，超聲過(guò)濾后方可作為流動(dòng)相使用，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL，示差折光檢測(cè)器溫度35 ℃。采用高效氣相色譜儀檢測(cè)發(fā)酵液中的乙醇含量，色譜柱為TM-930(25 m×0.53 mm×1 μm)；氣相色譜檢測(cè)乙醇方法為：進(jìn)樣前溶劑清洗3次，樣品清洗5次，進(jìn)樣后溶劑清洗3次；進(jìn)樣模式：進(jìn)樣口溫度180 ℃，分流比20∶1，檢測(cè)器溫度 230 ℃；柱流量恒流2 mL/min；檢測(cè)方法：初始溫度40 ℃，以5 ℃/min的速率升至80 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min的速率升至150 ℃；進(jìn)樣體積0.5 μL。

1.3.3 RNA提取、文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序

將活化的酵母菌種按照2%接種量接種于新鮮的YPD培養(yǎng)基中，在30 ℃，150 r/min搖床中培養(yǎng) 6 h 至對(duì)數(shù)中期，以添加1.8 g/L甲酸的菌液為實(shí)驗(yàn)組，未添加甲酸的菌液作為對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)2 h,收集細(xì)胞用于后續(xù)RNA提取。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，對(duì)照組(ck1、ck2、ck3)和甲酸組(for1、for2、for3)。取新鮮培養(yǎng)的菌液200 μL，使用酵母RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取總RNA。采用1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性和純度，微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度以及DNA和蛋白質(zhì)污染情況，保證RNA濃度≥250 ng/μL，總量≥40 μg，且OD260/OD280和OD260/OD230均>1.8。釀酒酵母總RNA檢測(cè)合格后，需要對(duì)樣品中的mRNA進(jìn)行富集，并去除rRNA、tRNA以及其他雜質(zhì)。首先用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，隨后加入適量的打斷試劑使其片段化，再以片段化的mRNA為模板合成雙鏈cDNA，經(jīng)磁珠純化、末端修復(fù)、加A并連接測(cè)序接頭，最后進(jìn)行PCR富集得到cDNA文庫(kù)，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)質(zhì)量檢測(cè)合格后使用BGISEQ測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。cDNA文庫(kù)構(gòu)建以及測(cè)序工作均在深圳華大基因科技服務(wù)有限公司完成。

1.3.4 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

對(duì)測(cè)序所得到的原始數(shù)據(jù)(raw reads)首先去除含有接頭的reads、未知堿基N含量過(guò)高、低質(zhì)量的reads得到clead reads，作為本研究的基本數(shù)據(jù)。使用HISAT將clead reads與指定的參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)，并用RSEM(RNA-Seq by expectation maximization)工具計(jì)算基因的表達(dá)水平，并使用R軟件分析樣品間基因表達(dá)水平相關(guān)性。使用DESeq2算法對(duì)2組樣品進(jìn)行差異表達(dá)分析，將差異顯著性q值(qvalue<0.05)和差異倍數(shù)(fold change≥2)作為篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選。本試驗(yàn)研究采用DAVID和KOBAS軟件對(duì)差異基因進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析等。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度甲酸對(duì)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

如圖1所示，甲酸對(duì)釀酒酵母的生長(zhǎng)抑制隨著甲酸質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)。對(duì)照組在2 h進(jìn)入對(duì)數(shù)期，6 h到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，8 h進(jìn)入穩(wěn)定期，其中添加1.2 g/L的甲酸對(duì)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)影響不大。而在添加1.5 g/L甲酸的脅迫下，酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)立即受到抑制，但隨著時(shí)間的推移，抑制作用逐漸減弱，最終生長(zhǎng)速度略低于無(wú)甲酸處理組。甲酸質(zhì)量濃度由1.5 g/L增至1.8 g/L時(shí)，酵母細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制，在10 h才達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，且與無(wú)甲酸處理組相比，穩(wěn)定時(shí)間得到延長(zhǎng)。當(dāng)甲酸質(zhì)量濃度增至2.1 g/L時(shí)，釀酒酵母細(xì)胞幾乎沒(méi)有生長(zhǎng)。而為了獲得有價(jià)值的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，本研究選擇了添加1.8 g/L甲酸脅迫下的酵母細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組。

圖1 甲酸對(duì)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig.1 The effect of formic acid on the growth of yeast cells

2.2 甲酸對(duì)酵母細(xì)胞發(fā)酵性能的影響

甲酸是木質(zhì)纖維素水解液中一種酸類細(xì)胞抑制物，添加甲酸會(huì)抑制酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而抑制葡萄糖的消耗和乙醇的生成，本次實(shí)驗(yàn)研究了在添加1.8 g/L甲酸脅迫條件下對(duì)酵母細(xì)胞發(fā)酵性能的影響。由圖2可知，對(duì)照組在6～14 h葡萄糖消耗較快，在16 h時(shí)葡萄糖基本消耗完全，而添加甲酸后葡萄糖消耗延遲為10～18 h，在20 h時(shí)葡萄糖才基本消耗完全。此外，乙醇快速生成延遲為10～18 h，在相同時(shí)間點(diǎn)下對(duì)照組產(chǎn)乙醇量均比甲酸組要高。說(shuō)明甲酸的添加明顯延長(zhǎng)了酵母細(xì)胞發(fā)酵的周期，降低了乙醇產(chǎn)量。

圖2 甲酸對(duì)酵母細(xì)胞乙醇發(fā)酵性能的影響Fig.2 Effect of formic acid on ethanol fermentation of yeast cells

2.3 RNA質(zhì)量分析

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的RNA樣品質(zhì)量要求OD260/OD280為1.8～2.2、OD260/OD230>2時(shí)核酸的純度較高，RNA完整性(RNA integrity number，RIN)為1～10，數(shù)值越接近10完整性越好。本次實(shí)驗(yàn)中，6個(gè)樣品RNA質(zhì)量濃度均>510 ng/μL，RIN均為10，28S/18S均在1.8～2.2，OD260/OD280和OD260/OD230均在要求范圍內(nèi)，說(shuō)明提取的RNA純度、濃度和完整度等質(zhì)量指標(biāo)均可滿足實(shí)驗(yàn)要求，可用于后續(xù)建庫(kù)測(cè)序。

2.4 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控

我們將原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)一系列數(shù)據(jù)處理來(lái)過(guò)濾雜質(zhì)得到過(guò)濾數(shù)據(jù)(clean reads)。由表1可知各樣品clean read均達(dá)到6.41 Gb以上，對(duì)照組和甲酸組的Q20平均值分別為97.27%和97.26%，Q30平均值分別為89.73%和89.53%，表明原始測(cè)序質(zhì)量合格，可用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

表1 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表Table 1 Statistical table of sequencing data

2.5 與參考基因組比對(duì)統(tǒng)計(jì)

將獲得clean reads使用HISAT軟件比對(duì)到參考基因組序列，結(jié)果如表2所示。在Illumina產(chǎn)生的clean reads中，對(duì)照組和甲酸組分別有超過(guò)95.91% reads和96.31%覆蓋到參考基因組上，多個(gè)比對(duì)位置的reads占比分別為1.27%和1.48%以上，唯一比對(duì)上的reads也分別超過(guò)了94.64%和94.83%。說(shuō)明clean reads與參考基因組序列比對(duì)情況較好，測(cè)序數(shù)據(jù)原始數(shù)據(jù)結(jié)果可靠，可滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析的需求。

表2 參考基因組比對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistical results of reference genome comparison

2.6 測(cè)序樣品相關(guān)性分析

本實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組和甲酸組均有3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共有6組轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)。由圖3可知，對(duì)照組與甲酸組組間相關(guān)性系數(shù)約為0.85，平行樣品間相關(guān)系數(shù)為0.992，說(shuō)明本研究中樣品間重復(fù)性較好，2組差異相對(duì)較大，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠，可用于后續(xù)分析。

圖3 對(duì)照組和甲酸組相關(guān)性熱圖Fig.3 Ck-for correlation heat map

2.7 差異表達(dá)基因分析

為了研究添加甲酸處理前后的差異表達(dá)基因，對(duì)2組測(cè)序后得到的所有基因進(jìn)行差異表達(dá)篩選，以fold change≥2且qvalue<0.05作為篩選條件，共篩選出差異表達(dá)基因(different expression genes，DEGs)1 504個(gè)，其中上調(diào)基因797個(gè)，下調(diào)基因707個(gè)，分別占總DEGs的52.99%和47.01%，采用火山圖和散點(diǎn)圖來(lái)描述差異基因整體分布情況，如圖4所示。

A-火山圖;B-散點(diǎn)圖圖4 對(duì)照組和甲酸組的火山圖與散點(diǎn)圖Fig.4 Ck-for volcano map and scatter plot注：圖中1個(gè)點(diǎn)代表1個(gè)特定的基因，紅色點(diǎn)表示顯著上調(diào)的基因，綠色點(diǎn)表示顯著下調(diào)的基因，灰色點(diǎn)為非顯著差異基因。

2.8 差異表達(dá)基因功能注釋和富集分析

2.8.1 差異表達(dá)基因GO功能注釋和富集分析

對(duì)篩選出來(lái)的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能分類，可以查看差異表達(dá)基因與哪些生物學(xué)功能顯著相關(guān)。GO注釋系統(tǒng)是一個(gè)有向無(wú)環(huán)圖，包含3個(gè)主要分支，即生物學(xué)過(guò)程(biological process)，細(xì)胞組成(cellular component)和分子功能(molecular function)[20]。本次研究GO共注釋到45個(gè)GO term，挑選富集最顯著的前20 GO term繪制差異表達(dá)基因GO功能柱狀圖，如圖5所示。由圖5可知，生物學(xué)過(guò)程有19個(gè)GO term，多數(shù)差異表達(dá)基因參與了細(xì)胞過(guò)程(cellular process)、代謝過(guò)程(metabolic process)、生物調(diào)節(jié)(biological regulation)以及對(duì)刺激的反應(yīng)(response to stimulus)等；細(xì)胞組成中有13個(gè)GO term，主要有細(xì)胞器(organelle)、含蛋白質(zhì)復(fù)合物(protein-containing complex)、膜部分(membrane part)、細(xì)胞外區(qū)域(extracellular region)等；分子功能中有13個(gè)GO term，多數(shù)基因參與了捆綁(binding)、催化活性(catalytic activity)、運(yùn)輸活動(dòng)(transporter activity)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性(transcription regulator activity)、抗氧化活性(antioxidant activity)以及蛋白質(zhì)折疊伴侶(protein folding chaperone)等。我們對(duì)差異基因進(jìn)一步進(jìn)行了GO富集分析，圖中橫坐標(biāo)為富集比例，縱坐標(biāo)為富集的GO term，氣泡的大小表示注釋到某個(gè)GO term上的差異基因數(shù)目，顏色代表富集P值，顏色越深代表P值越小。由圖6可知，差異表達(dá)基因主要富集在核糖核蛋白復(fù)合體(ribonucleoprotein complex)、細(xì)胞質(zhì)翻譯(cytoplasmic translation)、翻譯(translation)、核糖體(ribosome)、rRNA加工(rRNA processing)、核糖體生物發(fā)生(ribosome biogenesis)、質(zhì)膜部分(plasma membrane part)、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性(transmembrane transporter activity)、果糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性(fructose transmembrane transporter activity)、運(yùn)輸活性(transporter activity)等GO term中。以上結(jié)果表明，在甲酸的脅迫下，釀酒酵母中大多數(shù)與核糖體有關(guān)的基因表達(dá)受到影響，進(jìn)而影響了mRNA 翻譯。IWAKI等[21]研究表明添加香蘭素能夠抑制酵母細(xì)胞中的翻譯，朱寧等[22]探究微芯片脈沖電場(chǎng)技術(shù)對(duì)畢赤酵母的致死效果和致死機(jī)理，微芯片脈沖電場(chǎng)處理造成畢赤酵母基因損傷、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯受阻，蛋白功能被部分抑制，與本次試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

圖5 差異表達(dá)基因GO功能分類圖Fig.5 Differentially expressed gene GO function classification map注：圖中縱坐標(biāo)表示GO term，橫坐標(biāo)表示比對(duì)上該GO term的基因數(shù)量，顏色表示不同基因集

圖6 差異表達(dá)基因GO富集圖Fig.6 Differentially expressed gene GO enrichment map

2.8.2 差異表達(dá)基因KEGG富集分析

KEGG 是有關(guān)基因通路的主要公共數(shù)據(jù)庫(kù)[23]，在生物體內(nèi)，不同的基因產(chǎn)物相互協(xié)調(diào)來(lái)行使生物學(xué)功能，對(duì)差異表達(dá)基因的通路注釋分析有助于進(jìn)一步解讀基因的功能，將基因根據(jù)參與的KEGG代謝通路分為5個(gè)分支：細(xì)胞過(guò)程(cellular processes)、環(huán)境信息處理(environmental information processing)、遺傳信息處理(genetic information processing)、代謝(metabolism)及有機(jī)系統(tǒng)(organismal systems)。其結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，在分類中代謝占據(jù)主導(dǎo)地位，主要以碳水化合物代謝、能量代謝、氨基酸代謝以及核苷酸代謝為主；其次在細(xì)胞過(guò)程中，以細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡、運(yùn)輸和分解代謝為主；在遺傳信息處理中，折疊、分類、降解、翻譯占比居多，其次是復(fù)制、修復(fù)、轉(zhuǎn)錄。在環(huán)境信息處理過(guò)程中，主要以信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)為主。為了確定差異表達(dá)基因參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，本研究使用KOBAS軟件進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果表明總共富集在101個(gè)通路中，我們將其中富集最顯著的20條通路繪制差異基因KEGG通路富集散點(diǎn)圖，如圖8所示。由圖8可知，添加甲酸組和對(duì)照組培養(yǎng)條件下的差異表達(dá)基因有116個(gè)DEGs富集在核糖體通路、38個(gè)DEGs富集在減數(shù)分裂-酵母、40個(gè)DEGs富集在絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路、27個(gè)DEGs富集在真核生物的核糖體生物發(fā)生、26個(gè)DEGs富集在糖酵解/糖異生、24個(gè)DEGs富集在嘌呤代謝、20個(gè)DEGs富集在半胱氨酸和蛋氨酸的代謝、20個(gè)DEGs富集在淀粉和蔗糖代謝、14個(gè)DEGs富集在過(guò)氧化物酶體、13個(gè)DEGs富集在三羧酸循環(huán)、12個(gè)DEGs富集在半乳糖代謝、10個(gè)DEGs富集在果糖和甘露糖代謝、8個(gè)DEGs富集在自噬、8個(gè)DEGs富集在纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸的生物合成、8個(gè)DEGs富集在脂肪酸降解、8個(gè)DEGs富集在硫代謝、7個(gè)DEGs富集在β-丙氨酸代謝、7個(gè)DEGs富集在泛酸和CoA生物合成、6個(gè)DEGs富集在ABC轉(zhuǎn)運(yùn)、5個(gè)DEGs富集在不飽和脂肪酸的生物合成。由此可見(jiàn)，核糖體在甲酸脅迫中起著重要的作用，且發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞質(zhì)核糖體生物合成相關(guān)的基因大部分下調(diào)，與線粒體核糖體上調(diào)。LI等[24]研究乙醇脅迫下釀酒酵母的響應(yīng)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)與核糖體、核糖體生物合成相關(guān)的基因大部分下調(diào)，與線粒體核糖體相關(guān)的基因表達(dá)沒(méi)有出現(xiàn)明顯的變化，與我們?cè)囼?yàn)結(jié)果一致。減數(shù)分裂、糖酵解/糖異生和三羧酸循環(huán)等相關(guān)通路也發(fā)生了顯著的變化，推測(cè)釀酒酵母可能進(jìn)入有性生殖形成孢子，并在甲酸脅迫下產(chǎn)生子囊和子囊孢子，還可能通過(guò)糖代謝途徑合成大量的ATP，為抵抗甲酸的脅迫提供了充足的能量，從而提高了甲酸的耐受性。此外，釀酒酵母也可以通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)響應(yīng)甲酸的脅迫。

圖7 差異表達(dá)基因KEGG通路分類圖Fig.7 Differentially expressed genes KEGG pathway classification map注：橫坐標(biāo)為KEGG代謝通路的名稱，縱坐標(biāo)為注釋到該通路下的基因的數(shù)量

圖8 差異表達(dá)基因KEGG通路富集圖Fig.8 Differentially expressed genes KEGG pathway enrichment map注：圖中橫坐標(biāo)表示富集比例，富集比例越大，則富集的程度越大，縱坐標(biāo)為通路，點(diǎn)的大小表示此通路中基因個(gè)數(shù)多少，顏色代表富集的顯著性大小

3 討論與結(jié)論

本研究針對(duì)釀酒酵母在不同濃度甲酸的脅迫條件下進(jìn)行發(fā)酵性能的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)添加甲酸能明顯地抑制酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)，延遲發(fā)酵周期并降低乙醇量。而我們根據(jù)釀酒酵母的生長(zhǎng)情況，選擇1.8 g/L的甲酸進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，共獲得38.46 Gb clean reads測(cè)序數(shù)據(jù)，我們以qvalue<0.05且fold change≥2為篩選條件，對(duì)照組和甲酸組共篩選出1 504個(gè)顯著差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因797個(gè)，下調(diào)基因707個(gè)。通過(guò)GO富集以及KEGG通路富集分析表明，2組樣品上調(diào)基因主要參與減數(shù)分裂-酵母、MAPK信號(hào)通路、淀粉和蔗糖代謝、糖酵解/糖異生、細(xì)胞周期、半乳糖代謝、果糖和甘露糖代謝等通路，而下調(diào)基因主要參與了核糖體通路、真核生物的核糖體生物發(fā)生、半胱氨酸和蛋氨酸的代謝、嘌呤代謝、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成、不飽和脂肪酸的生物合成、脂肪酸降解等通路。通過(guò)RNA-seq分析表明，在甲酸的脅迫下釀酒酵母響應(yīng)分子機(jī)制可能有以下幾點(diǎn)：首先，釀酒酵母為了響應(yīng)甲酸的脅迫通過(guò)上調(diào)糖代謝以及氧化磷酸化相關(guān)基因的表達(dá)，為抵抗甲酸的脅迫提供充足的能量；其次，可以利用線粒體核糖體合成有關(guān)蛋白質(zhì)來(lái)抵御甲酸的侵?jǐn)_，并在甲酸脅迫下能夠?qū)ψ陨懋a(chǎn)生的能量進(jìn)行合理分配，合成應(yīng)對(duì)脅迫所需物質(zhì)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)；再次，半胱氨酸和蛋氨酸代謝、蛋白折疊和蛋白降解某些基因表達(dá)下調(diào)，猜測(cè)是甲酸的添加使細(xì)胞產(chǎn)生氧化脅迫，因此造成蛋白變性，而釀酒酵母則可以通過(guò)上調(diào)蛋白折疊和降解相關(guān)的基因表達(dá)，幫助酵母細(xì)胞蛋白質(zhì)正確折疊、防止變性蛋白聚集，從而有助于細(xì)胞恢復(fù)正常的生理代謝功能；最后，通過(guò)上調(diào)減數(shù)分裂、細(xì)胞周期以及MAPK信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，提高釀酒酵母對(duì)甲酸的耐受性。本研究初步揭示了釀酒酵母對(duì)甲酸的脅迫響應(yīng)機(jī)制，但具體基因的作用效果和分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，后期我們將驗(yàn)證與脅迫響應(yīng)相關(guān)的關(guān)鍵基因。本文為進(jìn)一步提高釀酒酵母細(xì)胞酸類抑制劑的耐受性方法提供了科學(xué)依據(jù)。