張慎 肖新生 劉園 袁方 李佳穎

(1湖南省煙草公司永州市公司東安縣分公司湖南永州425100;2湖南科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院湖南永州425199;3湖南省煙草公司永州市公司湖南永州425100)

煙草在田間生長(zhǎng)過程中會(huì)受到各種病蟲害的危害，病蟲害得不到有效的防治，可能會(huì)嚴(yán)重影響煙草的品質(zhì)和產(chǎn)量，甚至導(dǎo)致絕收。盡管有很多生物防治等新技術(shù)涌現(xiàn)，但是化學(xué)農(nóng)藥仍然是目前煙草病蟲害防治的主要手段［1］。甲霜靈、多菌靈和烯酰嗎啉都屬于殺菌劑，被廣泛用于水果、蔬菜、花卉等農(nóng)作物的病蟲害防治［2-4］，這3種農(nóng)藥在煙草中常出現(xiàn)超標(biāo)現(xiàn)象；雖然這些農(nóng)藥藥效高、毒性相對(duì)較低，但是其對(duì)哺乳動(dòng)物等還是有一定的毒害作用［5-10］。楊麗芬等［11］用高效液相色譜法測(cè)定蘋果中多菌靈和噻菌靈，比較SPE、QuEChERS兩種前處理方法的準(zhǔn)確度和精密度。盧娜等［12］建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定八角中甲霜靈和抗蚜威殘留量的方法。郭宏斌等［13］采用高效液相法同時(shí)測(cè)定草莓、西瓜、生菜、西紅柿、荔枝和龍眼中烯酰嗎啉和赤霉素的殘留量。目前，關(guān)于甲霜靈、多菌靈和烯酰嗎啉的殘留檢測(cè)和殘留降解規(guī)律問題，國(guó)內(nèi)外的文獻(xiàn)報(bào)道較少。因此，理清這3種農(nóng)藥在煙草中的降解規(guī)律，對(duì)于指導(dǎo)煙農(nóng)規(guī)范用藥、合理用藥及保證烘烤制品安全性具有重要的意義［14］。

本研究選取甲霜靈、多菌靈和烯酰嗎啉這3種煙草中常用的農(nóng)藥為研究對(duì)象，在永州市煙葉生產(chǎn)技術(shù)中心試驗(yàn)田開展了為期兩年的田間試驗(yàn)，分別噴施1、2和4倍推薦量農(nóng)藥于鮮煙葉和烤后煙葉中，考察其降解情況。為探索有效控制煙葉中農(nóng)藥殘留的措施，采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)技術(shù)研究甲霜靈、多菌靈和烯酰嗎啉在煙草上的農(nóng)藥殘留特征，明確了3種農(nóng)藥殘留水平與降解規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98.7%）、多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98.7%）、烯酰嗎啉標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98.7%）、丙甲草胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98.7%），皆購自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；甲霜靈（可濕性粉劑，有效成分含量為8%，浙江禾本科技有限公司）、多菌靈（可濕性粉劑，有效成分含量為50%，上海悅聯(lián)化工有限公司）、烯酰嗎啉（水分散粒劑，有效成分含量為80%，山東源豐生物科技有限公司）；N-丙基乙二胺（PSA，Agela Technologies公司）；無水MgSO4、NaCl、檸檬酸鈉、檸檬酸氫二鈉（均購自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，且均為分析純）；乙酸乙酯（色譜純，德國(guó)Merck公司）；正己烷（色譜純，德國(guó)Merck公司）；乙腈（色譜純，德國(guó)Merck公司）；甲醇（色譜純，德國(guó)Merck公司）；蒸餾水。

1.1.2 儀器設(shè)備

LC-MS 8030高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司）；SQP萬分之一電子天平（瑞士賽多利斯公司）；A-10 basic高速植物組織搗碎機(jī)（德國(guó)IKA公司）；GL-88B渦旋混勻器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；TG16G速離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）；R-1001VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 農(nóng)藥在煙草中殘留量與降解規(guī)律田間試驗(yàn)

田間試驗(yàn)于2019—2020年在湖南省煙草公司永州市公司煙葉生產(chǎn)技術(shù)中心進(jìn)行，供試煙草品種為云煙87號(hào)，整個(gè)田間生產(chǎn)過程符合當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)規(guī)范（GAP）生產(chǎn)要求。參照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》和《農(nóng)藥登記殘留田間試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》，動(dòng)態(tài)試驗(yàn)按照1、2和4倍推薦劑量用藥，施藥2次，于旺長(zhǎng)期-現(xiàn)蕾期葉背和葉面噴霧施藥。每個(gè)小區(qū)面積30 m2，行距120 cm，株距50 cm。小區(qū)試驗(yàn)重復(fù)3次，隨機(jī)排列，設(shè)置小區(qū)保護(hù)帶與對(duì)照小區(qū)。煙株現(xiàn)蕾后期，葉面均勻噴霧施藥。1倍推薦劑量甲霜靈、多菌靈、烯酰嗎啉的有效成分用量分別為118.5、444.4、355.6 g a.i./hm2，用水量887.7 L/hm2。間隔一個(gè)星期后，第二次施藥。于第二次施藥后2 h和1、3、5、7、14 d采樣，將樣品去主脈、切碎、混勻，用四分法留樣不少于200 g，于-20℃環(huán)境保存，待檢測(cè)。

1.2.2 煙葉烘烤前后及不同采收間隔期最終殘留量田間試驗(yàn)。

于最后一次施藥后7、14、21 d，采用半葉法研究烘烤前后農(nóng)藥殘留量的降解變化：隨機(jī)采集煙葉樣品100片，用半葉法稱重編桿后，采用三段式烘烤工藝進(jìn)行烘烤處理；將煙葉去主脈并粉碎，縮分后留樣100 g，于-20℃環(huán)境保存，待檢測(cè)。

1.2.3 殘留檢測(cè)

1.2.3.1 農(nóng)藥殘留前處理方法

參照標(biāo)準(zhǔn)《YC/T 405.1—2011煙草及煙草制品多種農(nóng)藥殘留量的測(cè)定第1部分：高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》進(jìn)行適當(dāng)修改。修改之處為：改用異丙甲草胺（5μg/mL）作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量分析。

1.2.3.2 農(nóng)藥殘留檢測(cè)條件

（1）LC-MS/MS色譜條件：色譜柱AQ-C18 HP（3.0μm，2.1×100 mm）；流動(dòng)相為乙腈和水（V/V）；流速：0.3 mL/min；采用“15∶85（V/V，0～2.5 min）→50∶50（V/V，2.5～14 min）→95∶5（V/V，14～16 min）→15∶85（V/V，16～18 min）”進(jìn)行梯度洗脫；柱溫25℃；進(jìn)樣量5μL。

（2）質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源ESI；掃描方式：正離子源；噴霧電壓：3 000 V；毛細(xì)管溫度：300℃；鞘氣壓力：50 Arb；輔助氣壓力：20 Arb；檢測(cè)方式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM，具體條件見表1），典型的色譜圖見圖1。

表1 三種農(nóng)藥的MRM條件

圖1 甲霜靈、多菌靈、烯酰嗎啉和異丙甲草胺典型TIC色譜圖

1.2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與添加回收率

分別配置濃度為100 mg/L的甲霜靈、多菌靈和烯酰嗎啉標(biāo)準(zhǔn)溶液；再用煙葉空白提取液稀釋，配得農(nóng)藥濃度為0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5 mg/L的含內(nèi)標(biāo)異丙甲草胺（0.05 mg/L）的基質(zhì)加標(biāo)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；分別往空白煙葉提取液中添加不同濃度（0.1、0.5、2 mg/kg）的甲霜靈、多菌靈和烯酰嗎啉標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行添加回收率檢測(cè)驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限與添加回收率

在0.005～5 mg/kg，3種農(nóng)藥跟內(nèi)標(biāo)的峰面積比與農(nóng)藥質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。以3倍信噪比進(jìn)行計(jì)算，得出甲霜靈、多菌靈和烯酰嗎啉的最低檢出限均為1.0×10-11g，同時(shí)根據(jù)最小的添加水平得到3種農(nóng)藥的定量限（LOQ）為0.01～0.02 mg/kg（表2）。甲霜靈、多菌靈和烯酰嗎啉在0.1、0.5、2 mg/kg的添加回收率分別為81.2%～98.5%、83.1%～101.5%、85.1%～101.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.2%～5.4%、2.9%～7.5%、3.5%～7.8%。添加回收率結(jié)果均符合殘留檢測(cè)方法要求，可用于煙葉中3種農(nóng)藥的殘留檢測(cè)。

表2 甲霜靈、多菌靈和烯酰嗎啉在煙葉中的線性方程、相關(guān)系數(shù)與定量限

2.2 煙草鮮煙葉中甲霜靈、多菌靈、烯酰嗎啉消解規(guī)律

甲霜靈在鮮煙葉中的殘留量實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖2）表明，施藥的第一天農(nóng)藥含量普遍都很高，且農(nóng)藥濃度越高殘留越大。第二次施藥2 h后，1、2和4倍推薦施藥量的煙葉中甲霜靈沉積量分別為7.1、18.7、36.6 mg/kg。甲霜靈在鮮煙葉中的農(nóng)藥殘留量隨著施藥間隔期的延長(zhǎng)整體呈下降趨勢(shì)（圖2-a），且降解速率先快后慢，14 d后殘留量分別降為0.1、2.4、5.3 mg/kg，14 d時(shí)，消解率均超過85%。7 d之后，1、2倍農(nóng)藥殘留量變化均漸趨平緩。至14 d時(shí)，雖還未降解完全，但殘留量已經(jīng)較低。

圖2 鮮煙葉中甲霜靈（a）、多菌靈（b）、烯酰嗎啉（c）的殘留量隨施藥時(shí)間變化的曲線

多菌靈在鮮煙葉中的殘留量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，第二次施藥2 h后，1、2和4倍推薦施藥量的煙葉中多菌靈沉積量分別為13.3、23.8、34.9 mg/kg（圖2-b）。14 d后多菌靈殘留量分別降為2.3、4.0、8.2 mg/kg，消解率均超過75%，消解速度比甲霜靈要慢。

烯酰嗎啉在鮮煙葉中的殘留量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，施藥第一天農(nóng)藥烯酰嗎啉殘留量最大（圖2-c）。第二次施藥2 h后，1、2和4倍推薦施藥量的煙葉中烯酰嗎啉沉積量分別為21.0、38.6、47.1 mg/kg。烯酰嗎啉在鮮煙葉中的農(nóng)藥殘留量隨著施藥間隔期的延長(zhǎng)整體呈下降趨勢(shì)，7 d后1、2和4倍農(nóng)藥殘留量已趨近于平緩，14 d后殘留量分別降為1.7、2.8、5.1 mg/kg。施藥3 d后消解率均超過50%；14 d時(shí)，消解率均超過89%。

采用Excel進(jìn)行線性回歸分析，按照指數(shù)方程進(jìn)行擬合，得到了鮮煙葉中農(nóng)藥殘留消解動(dòng)態(tài)方程及半衰期，詳見表3。甲霜靈、多菌靈和烯酰嗎啉在鮮煙葉中的殘留消解動(dòng)態(tài)方程均符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，甲霜靈和多菌靈趨勢(shì)線擬合程度的指標(biāo)R2值在0.867 1～0.984 3，而烯酰嗎啉趨勢(shì)線擬合程度的指標(biāo)R2值在0.743 6～0.781 9。不同施藥量的半衰期，甲霜靈為2～4 d，多菌靈為5～6 d，烯酰嗎啉為3～4 d。比較而言，多菌靈的降解速率要慢一些，甲霜靈和烯酰嗎啉的降解速度差不多。

表3 鮮煙葉中農(nóng)藥殘留消解動(dòng)態(tài)方程及半衰期

2.3 煙葉烘烤過程中甲霜靈、多菌靈和烯酰嗎啉加工因子

為了解煙葉烤制過程中農(nóng)藥的消解情況，對(duì)第二次施藥后7、14、21 d采收的煙葉烤制前后農(nóng)藥殘留量進(jìn)行了對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)甲霜靈、多菌靈和烯酰嗎啉的加工因子分別在0.42～0.65、0.41～0.64和0.50～0.64，詳見表4。煙葉烘烤中的高溫過程，會(huì)促使部分農(nóng)藥分解，同時(shí)烘烤過程中的高溫條件使微生物徹底失活，降低了煙葉中水分的含量，導(dǎo)致后期的農(nóng)藥降解緩慢。

表4 煙葉烘烤過程中甲霜靈、多菌靈與烯酰嗎啉加工因子

2.4 烤后煙葉中甲霜靈、多菌靈與烯酰嗎啉消解規(guī)律

烤后煙葉在存放過程中，農(nóng)藥會(huì)逐漸分解而使殘留量下降，殘留量下降速度與煙草農(nóng)藥殘留安全性有較大關(guān)系。為更好地判斷不同存放期煙葉中農(nóng)藥殘留情況，分別采摘第二次噴藥后第7、14、21天的煙葉，經(jīng)烤制、切絲混勻后，避光放置在25℃、60%的恒溫恒濕箱中。在烤后的第0、30、60天分別取樣測(cè)定煙葉中甲霜靈、多菌靈、烯酰嗎啉的降解情況，結(jié)果如圖3-a、3-b和3-c所示，殘留限量值均為2 mg/kg。從圖3-a中可以看出，只有第7天收獲的4倍農(nóng)藥用量烤后0 d煙葉中甲霜靈含量超過煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)［15］中規(guī)定的殘留限量；烤后14 d，殘留量下降，其含量低于殘留限量值。從圖3-b可看出，不管是多少天的采收間隔期，4倍多菌靈用藥量的煙葉中殘留量均超過限量值，而對(duì)于1倍和2倍的用藥量，只有第7天收獲的2倍用藥量的煙葉中多菌靈殘留量高于限量值，其他均未超限。從圖3-c可看出，第7天收獲的4倍用藥量烤后煙葉中烯酰嗎啉的含量均超過殘留限量，而且第14天收獲的4倍用藥量烤后30 d煙葉中烯酰嗎啉的含量也大于2 mg/kg。

對(duì)含量變化曲線進(jìn)行擬合，得到各個(gè)樣品的半衰期，如表5所示。無論是甲霜靈、多菌靈還是烯酰嗎啉，低濃度施藥量的樣品半衰期相對(duì)較短，最短的為102 d，最長(zhǎng)的為211 d。

表5 烤后煙葉農(nóng)藥殘留消解半衰期

圖3 烤后干煙葉中甲霜靈（a）、多菌靈（b）、烯酰嗎啉（c）殘留量隨烤后時(shí)間的變化情況

3 討論與結(jié)論

本研究是對(duì)云煙87號(hào)中甲霜靈、多菌靈、烯酰嗎啉3種農(nóng)藥的殘留量變化情況進(jìn)行考查，發(fā)現(xiàn)其鮮葉中農(nóng)藥消解均與一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程相符。在收獲前期，農(nóng)藥降解速度較快，后期逐漸變緩慢；到收獲后期，殘留量降至較低水平并趨于穩(wěn)定。在鮮煙葉中，噴灑農(nóng)藥7 d后，農(nóng)藥殘留量基本上已趨于平緩的狀態(tài)，在14 d后消解率超過85%。農(nóng)藥殘留量與使用劑量呈正相關(guān)，同收獲間隔期呈負(fù)相關(guān)。收獲間隔期對(duì)煙葉中農(nóng)藥殘留量的影響顯著高于施藥劑量的影響。

根據(jù)烤后煙葉的農(nóng)藥殘留情況、加工因子和鮮葉中農(nóng)殘降解動(dòng)態(tài)方程，結(jié)合煙農(nóng)施藥習(xí)慣，對(duì)各個(gè)安全系數(shù)進(jìn)行分析，推導(dǎo)出施藥到采摘的安全間隔期。從烤后煙葉農(nóng)藥殘留和施藥習(xí)慣看，3種農(nóng)藥的施藥量不得超過推薦施藥量的2倍，因此接下來將基于2倍量施藥量進(jìn)行探討。施藥量為2倍時(shí)，甲霜靈、多菌靈、烯酰嗎啉的加工因子分別為0.59、0.64和0.69（7、14、21 d采樣加工因子的最高值），根據(jù)回收率測(cè)定誤差分別為18.8%、16.9%、14.9%。按最終殘留量不超過2 mg/kg，折合誤差和加工因子，計(jì)算得采摘時(shí)鮮煙葉甲霜靈、多菌靈、烯酰嗎啉殘留量最小分別為2.63、2.67、2.52 mg/kg。按2倍量施藥動(dòng)態(tài)消解方程計(jì)算，甲霜靈、多菌靈、烯酰嗎啉的收獲間隔期t值分別為8.7、15.6、11.5 d。合理使用建議：8%甲霜靈可濕性粉劑按照推薦劑量118～236 g a.i./hm2，50%多菌靈可濕性粉劑按照推薦劑量444～888 g a.i./hm2，80%甲霜靈可濕性粉劑按照推薦劑量355～710 g a.i./hm2，均施藥2次，施藥間隔7 d；甲霜靈最后一次施藥距收獲間隔期為9 d，多菌靈最后一次施藥距收獲間隔期為16 d，烯酰嗎啉最后一次施藥距收獲間隔期為12 d。