劉 悅，裴文慧,2，王 冉，牛芬溪，劉雅楠，孫毅坤，方 芳

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488；2. 北京地壇醫(yī)院順義院區(qū)，北京 101300)

失眠是一種常見(jiàn)的睡眠障礙，主要表現(xiàn)為入睡困難、睡眠維持時(shí)間短、早醒，伴有精神及生理功能的日間損害等，長(zhǎng)期失眠可嚴(yán)重影響人們的健康。隨著時(shí)代的發(fā)展和生活節(jié)奏的加快，失眠患者的比例越來(lái)越高，失眠已經(jīng)成為一個(gè)公共衛(wèi)生事件而受到關(guān)注[1-2]。調(diào)節(jié)腦內(nèi)γ-氨基丁酸作用的苯二氮類(lèi)藥物如安定、唑吡坦、扎來(lái)普隆常作為治療慢性失眠的一線藥物，具有改善夜間睡眠的作用，但長(zhǎng)期應(yīng)用具有明顯不良反應(yīng)，使得人們尋找γ-氨基丁酸以外靶點(diǎn)的藥物及非藥物治療方式[3]。失眠在中醫(yī)學(xué)中屬于“不寐”的范疇，根據(jù)失眠患者的表型和病因進(jìn)行辨證分析發(fā)現(xiàn)，肝郁型失眠比例較高?！案沃魇栊埂?，肝之疏泄功能正?？梢允箽庋〞?、心神滋養(yǎng)，而肝氣郁結(jié)則神魂失養(yǎng)而致失眠，或肝氣郁結(jié)化火，煉液為痰，痰火上擾心神引起失眠[4-5]。雙夏湯由半夏、夏枯草等量煎煮而成，對(duì)古今醫(yī)家臨床治療失眠的用藥規(guī)律分析顯示，半夏的使用頻率較高，其與夏枯草等量配伍使用最常見(jiàn)，是治療失眠的核心藥對(duì)[6-8]。夏枯草具有清肝火、散郁結(jié)作用，半夏有燥濕化痰功效，二者合用可疏肝解郁、化痰理氣，對(duì)肝郁火旺、痰熱內(nèi)擾型失眠有較好療效[9]。本課題組前期研究顯示，雙夏湯水煎液凍干粉能有效改善年老年果蠅的片段式睡眠，在治療夜間間歇性失眠的同時(shí)，并未顯著影響果蠅白天的活動(dòng)，有助于果蠅睡眠-覺(jué)醒節(jié)律的調(diào)節(jié)[10]；雙夏湯水洗液對(duì)小鼠有明顯的鎮(zhèn)靜催眠作用[11]。本研究進(jìn)一步觀察了雙夏湯對(duì)肝郁型失眠模型大鼠的鎮(zhèn)靜催眠作用及相關(guān)機(jī)制，旨在為其臨床使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1藥品與主要試劑 半夏、夏枯草購(gòu)于安國(guó)東方藥城中藥材有限公司，經(jīng)北京市藥品檢驗(yàn)所常增榮主任藥師鑒定。安定(地西泮)，北京益民藥業(yè)生產(chǎn)，批號(hào)：20131004；瀉肝安神丸，北京同仁堂制藥有限公司，批號(hào)：3082174；對(duì)氯苯丙氨酸(PCPA)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)及5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma；戊巴比妥鈉購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司，批號(hào)：020402。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar雄性大鼠70只，體重180～200 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。大鼠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理系動(dòng)物房，飼養(yǎng)溫度23～26 ℃，12/12明暗交替，自由攝食、飲水，普通飼料喂養(yǎng)。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器 YLS-1B多功能大鼠自主活動(dòng)記錄儀，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站；動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡跟蹤系統(tǒng)Ethovision XT 9，Noldus；1525型高效液相色譜儀，Waters；ECD2465電化學(xué)檢測(cè)器，Waters；Heraeus Fresco 21 高速冷凍離心機(jī)，Thermo；Labofuge 400R離心機(jī)，德國(guó)Heraeus；Atlantis C18色譜柱(2.1×150 mm，3 μm)，Waters，Lot 0149341601。

1.4方法

1.4.1雙夏湯制備方法 半夏和夏枯草各等量用水煎煮得提取液，過(guò)濾、濃縮、過(guò)大孔樹(shù)脂柱，用水洗脫，濃縮收集液即得。

1.4.2分組、造模及干預(yù) 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后，按體重隨機(jī)分為7組，每組10只。除正常組外，其余組均參照文獻(xiàn)[12]造模：采用束縛法和夾尾激怒輪流安排，刺激時(shí)間為3周。束縛法將大鼠置于自制束縛器中，2 h/次，2次/d。夾尾刺激用尖端包裹紗布的止血鉗夾鼠尾，令其與籠內(nèi)其他大鼠廝打，30 min/次，2次/d。造模第17天時(shí)腹腔注射PCPA混懸液[將PCPA用弱堿性(pH 7～8)生理鹽水配置成混懸液，加1%阿拉伯膠助溶]1 mL/100 g，350 mg/kg，1次/d，連續(xù)注射2 d。模型評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：第一次腹腔注射28～30 h后，動(dòng)物出現(xiàn)晝夜節(jié)律消失，表明模型復(fù)制成功。造模第8天，安定組給予4.2 mg/kg安定灌胃，瀉肝安神丸組給予1.4 g/kg瀉肝安神丸灌胃，雙夏湯高、中、低劑量組分別給予7 g生藥/kg、3.5 g生藥/kg、1.7 g生藥/kg雙夏湯灌胃，正常組和模型組給予等量蒸餾水灌胃，均每天1次，連續(xù)2周。

1.5觀察指標(biāo)

1.5.1動(dòng)物體征、體重、進(jìn)食量 造模第7，14，21天觀察各組大鼠皮毛、精神、行為等變化，記錄體重和24 h內(nèi)進(jìn)食量。

1.5.2大鼠敞箱實(shí)驗(yàn)活動(dòng)情況 敞箱底面為80 cm×80 cm正方形，劃分為25個(gè)等格，箱高40 cm，以大鼠穿越底面塊數(shù)(三爪均進(jìn)入的方格方可計(jì)數(shù))為水平得分(反映動(dòng)物的活動(dòng)度)，以直立次數(shù)(雙足離開(kāi)底面至放下為1次活動(dòng))為垂直得分(反映動(dòng)物的好奇程度)，記錄第7，14，21天各組大鼠活動(dòng)水平得分、垂直得分。

1.5.3戊巴比妥鈉誘導(dǎo)睡眠情況 末次灌胃30 min后，各組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉30 mg/kg，記錄大鼠的入睡潛伏期和睡眠時(shí)間。睡眠判定標(biāo)準(zhǔn)：大鼠腹部朝上，翻正反射消失達(dá)1 min以上。

1.5.4腦內(nèi)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量 行為學(xué)測(cè)定結(jié)束后，處死大鼠并快速取大腦皮質(zhì)、下丘腦，-80 ℃凍存。采用高效液相色譜-電化學(xué)檢測(cè)法測(cè)定大鼠皮質(zhì)和下丘腦中NE、DA、5-HIAA、5-HT含量。測(cè)定時(shí)將凍存組織放在預(yù)冷的離心管中，皮質(zhì)加入3倍體積、下丘腦加入5倍體積的高氯酸溶液，冰浴下電動(dòng)勻漿機(jī)勻漿，靜置10 min，4 ℃下12 000 r/min離心(離心半徑為10.6 cm)10 min，吸取上清，再次離心，吸取上清，0.2 μm濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣。液相條件：Atlantis C18色譜柱(2.1×150 mm，3 μm)；流動(dòng)相：50 mmol/L檸檬酸-乙酸鈉，內(nèi)含1 mmol/L B8離子對(duì)試劑、4%甲醇、1.8 mmol/L 二正丁胺、0.3 mmol/L Na2EDTA、2 mmol/L 氯化鈉。檢測(cè)電壓+0.75 V，流速0.3 mL/min，柱溫35 ℃。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠體征、體重及進(jìn)食量比較 正常組大鼠毛色干凈順滑、有光澤，身體靈活、有探索性，無(wú)攻擊性或躲避行為，隨著飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠的體重和進(jìn)食量增加較快；模型組大鼠隨造模時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸出現(xiàn)毛色暗淡變糙無(wú)光澤、胡須下垂、易怒、探索性活動(dòng)減少，體重和進(jìn)食量均明顯低于正常組(P均<0.05)；雙夏湯各組大鼠較模型組大鼠毛色順滑，探索性活動(dòng)增加，體重和進(jìn)食量增加，其中雙夏湯高劑量組大鼠的體重、進(jìn)食量在造模第21天時(shí)均明顯高于同期模型組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)不同時(shí)間點(diǎn)體重及進(jìn)食量比較

2.2各組大鼠在敞箱中活動(dòng)情況比較 模型組大鼠造模第7，14，21天的水平運(yùn)動(dòng)和垂直運(yùn)動(dòng)得分均明顯低于同期正常組(P均<0.05)；雙夏湯中劑量組大鼠造模第14天和第21天水平運(yùn)動(dòng)和垂直運(yùn)動(dòng)得分均明顯高于同期模型組(P均<0.05)，雙夏湯低劑量組大鼠造模第21天水平運(yùn)動(dòng)和垂直運(yùn)動(dòng)得分也均明顯高于模型組(P均<0.05)，安定組、瀉肝安神丸組、雙夏湯高劑量組大鼠水平運(yùn)動(dòng)和垂直運(yùn)動(dòng)得分與同期模型組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠在敞箱中活動(dòng)情況比較 分)

2.3各組大鼠對(duì)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)睡眠情況比較模型組大鼠入睡潛伏期明顯長(zhǎng)于正常組(P<0.05)；各藥物組大鼠的入睡潛伏期均明顯短于模型組(P均<0.05)；安定組和雙夏湯高劑量組大鼠睡眠時(shí)間均明顯長(zhǎng)于模型組(P均<0.05)，其余組大鼠睡眠時(shí)間雖有延長(zhǎng)，但與模型組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠對(duì)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的睡眠情況比較

2.4各組大鼠腦內(nèi)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量比較 大腦皮質(zhì)中，模型組大鼠NE、DA、5-HIA、5-HT含量及5-HT/NE、5-HT/DA均明顯低于正常組(P均<0.05)，各給藥組大鼠各指標(biāo)與模型組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。下丘腦中，模型組大鼠DA、5-HIAA、5-HT含量及5-HT/NE、5-HT/DA均明顯低于正常組(P均<0.05)；瀉肝安神丸組大鼠5-HIAA、5-HT含量及5-HT/NE、5-HT/DA，雙夏湯高劑量組和雙夏湯低劑量組NE、5-HT含量及5-HT/NE、5-HT/DA，雙夏湯中劑量組5-HIAA、5-HT含量及5-HT/NE均明顯高于模型組(P均<0.05)。見(jiàn)表4及表5。

表5 各組大鼠下丘腦中單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量比較

表4 各組大鼠大腦皮質(zhì)中單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量比較

3 討 論

肝氣郁結(jié)多與情志有關(guān)，而失眠多與情志疾病伴行，二者相互影響?！侗孀C錄·不寐門(mén)》中說(shuō)：“氣郁既久，則肝氣不舒，肝氣不舒，則肝血必耗，肝血既耗，則木中之血不能潤(rùn)于心，則不寐。”臨床資料研究顯示，肝郁氣滯型失眠具有睡眠潛伏期長(zhǎng)，總睡眠時(shí)間少，睡眠效率低，覺(jué)醒次數(shù)多等特點(diǎn)[13]。根據(jù)臨床流行病學(xué)影響因素調(diào)查顯示，約60%的患者為肝郁因素引發(fā)失眠癥狀，其中46%的肝郁失眠患者是由急躁易怒等不良情緒引發(fā)[14]?！芭瓊?，久則郁”，在情志致病中以急躁惱怒傷肝最為常見(jiàn)。

本研究采用夾尾激怒法和束縛法輪流刺激3周結(jié)合PCPA復(fù)制肝郁型失眠大鼠模型，大鼠體征及行為活動(dòng)隨造模時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸表現(xiàn)為皮毛粗糙無(wú)光澤、情緒低下、活動(dòng)減少、探索性降低、蜷縮角落、易怒，有攻擊行為或躲避行為，體重和進(jìn)食量明顯降低，戊巴比妥鈉誘導(dǎo)入睡潛伏期延長(zhǎng)，睡眠時(shí)間縮短，與肝郁證常見(jiàn)的缺乏活力、沉默寡言、生活興趣減退等臨床表現(xiàn)類(lèi)似。

既往研究顯示，夏枯草水提物、等比例半夏和夏枯草水煎煮制備的合劑均能明顯縮短小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間和強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間，有抗抑郁作用，與半夏和夏枯草配伍具有疏肝解郁、化痰理氣功效有關(guān)[15-16]。此外，半夏得陰而生，引陽(yáng)入陰，夏枯草并純陽(yáng)之氣，得陰而枯，二者配伍可以交通陰陽(yáng)，契合失眠的陽(yáng)不入陰、陰陽(yáng)失調(diào)的病機(jī)，具有明顯改善失眠的作用[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，造模第21天，雙夏湯高劑量組大鼠的體重、進(jìn)食量和雙夏湯中、低劑量組大鼠的水平運(yùn)動(dòng)和垂直運(yùn)動(dòng)得分均明顯高于同期模型組，雙夏湯各劑量組大鼠的入睡潛伏期均明顯短于模型組，雙夏湯高劑量組大鼠睡眠時(shí)間明顯長(zhǎng)于模型組。提示雙夏湯可明顯提高肝郁型失眠大鼠活動(dòng)度和探索性，有改善肝郁癥狀和鎮(zhèn)靜催眠作用。

腦內(nèi)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)是調(diào)節(jié)機(jī)體情緒、行為狀態(tài)、精神活動(dòng)的重要物質(zhì)。NE、5-HT含量降低與抑郁有關(guān)，5-HT、NE、DA是調(diào)節(jié)“覺(jué)醒-睡眠”周期的重要成分。DA和NE參與維持覺(jué)醒狀態(tài)，而5-HT能延長(zhǎng)非快速眼動(dòng)睡眠時(shí)間，與抑制覺(jué)醒有關(guān)，NE具有一定的拮抗5-HT維持睡眠狀態(tài)的作用[18]。PCPA為一種色氨酸羥化酶抑制劑，腹腔注射可以減少大鼠體內(nèi)5-HT的合成，降低腦內(nèi)和血液中的5-HT含量，導(dǎo)致大鼠晝夜節(jié)律消失，白天活動(dòng)增加，是誘導(dǎo)大鼠失眠的常用模型。有研究顯示，PCPA誘導(dǎo)大鼠失眠模型中，不僅影響5-HT的合成，也會(huì)導(dǎo)致中縫背核和尾狀殼核NA和DA含量降低[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，夾尾激怒法和束縛法輪流刺激3周疊加PCPA誘導(dǎo)的肝郁型失眠大鼠皮質(zhì)和下丘腦中DA、5-HIAA、5-HT含量及5-HT/NE、5-HT/DA明顯降低，雙夏湯各劑量組各指標(biāo)與模型組比較均無(wú)明顯變化；雙夏湯高劑量組和雙夏湯低劑量組大鼠下丘腦中NE、5-HT含量及5-HT/NE、5-HT/DA，雙夏湯中劑量組大鼠下丘腦中5-HIAA、5-HT含量及5-HT/NE均明顯高于模型組。提示雙夏湯對(duì)肝郁型失眠大鼠大腦皮質(zhì)中神經(jīng)遞質(zhì)無(wú)明顯影響，對(duì)下丘腦中神經(jīng)遞質(zhì)有影響，由于下丘腦是睡眠和晝夜節(jié)律調(diào)控的重要區(qū)域，推測(cè)雙夏湯可能是通過(guò)調(diào)節(jié)下丘腦中單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)穩(wěn)態(tài)而改善肝郁型失眠的。

綜上所述，雙夏湯可改善肝郁型失眠，其可能是通過(guò)調(diào)節(jié)腦內(nèi)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)穩(wěn)態(tài)，尤其是增加5-HT含量發(fā)揮作用，為雙夏湯臨床治療肝郁型失眠提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，后續(xù)還需借助腦電監(jiān)測(cè)和分子生物學(xué)技術(shù)，通過(guò)分析睡眠-覺(jué)醒周期和分子變化，進(jìn)一步確定其治療肝郁型失眠的作用和作用機(jī)制。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。