陳夢(mèng)嬌,朱曉燕

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬紹興中醫(yī)院，浙江 紹興 312000)

特應(yīng)性皮炎是臨床常見(jiàn)的慢性復(fù)發(fā)性皮膚病，常伴發(fā)哮喘和過(guò)敏性鼻炎，臨床表現(xiàn)為全身皮膚泛發(fā)紅斑、丘疹、丘皰疹、皸裂、糜爛滲出，且瘙癢劇烈[1]。目前該病主要以抗組胺藥、鈣調(diào)磷酸酶抑制劑及糖皮質(zhì)激素等對(duì)癥治療，但這類(lèi)藥物長(zhǎng)期使用存在潛在的不良反應(yīng)[2-3]。清熱利濕方是紹興中醫(yī)院用于治療特應(yīng)性皮炎的常用中藥方，可明顯減輕患者瘙癢及皮損，改善皮膚屏障功能，但其作用機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察特應(yīng)性皮炎小鼠皮膚病理變化及皮膚組織中表皮絲聚蛋白(FLG)、兜甲蛋白(LOR)、表皮蛋白(IVL)的表達(dá)水平，探討了清熱利濕方治療特應(yīng)性皮炎的分子生物學(xué)機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠60只，6周齡，體重18～22 g，購(gòu)于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：20130016007771，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。置于獨(dú)立通風(fēng)系統(tǒng)單籠飼養(yǎng)，室溫24～25 ℃，濕度40%～50%，自由飲食和飲水。所有實(shí)驗(yàn)步驟均經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2主要試劑 卵清蛋白購(gòu)自Sigma公司，貨號(hào)：S7951/O1641；TRIzol?Reagent (Invitrigen,Cat.No.15596-018)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas，K1622)，Realtime-PCR 試劑盒：Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X)(Thermo Fisher，K0222)，F(xiàn)LG、LOR及IVL引物合成自Invitrigen公司。

1.3主要實(shí)驗(yàn)藥物 清熱利濕方組成：金銀花12 g、白花蛇舌草12 g、土茯苓9 g、烏桕葉9 g。藥物適當(dāng)粉碎后，放入砂鍋用3倍量水浸泡30 min，武火燒開(kāi)后用文火煎煮約2 h，水量減少至約1倍藥物體積為宜，然后過(guò)濾，取出藥汁，再加入適量水，復(fù)煎1次，時(shí)間約30 min，合并2次濾液，靜置8 h，取上清液，加熱濃縮為生藥量4 g/mL濃度的水煎劑待用。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 將小鼠隨機(jī)分成空白組、模型組、清熱利濕方低劑量組、清熱利濕方中劑量組、清熱利濕方高劑量組、西替利嗪組，每組10只。用電動(dòng)剃須刀剃刮每只小鼠的背部毛發(fā)，并使用脫毛膏將殘留的毛發(fā)脫盡，用膠布反復(fù)粘貼10次?？瞻捉M用生理鹽水、其余組用100 μg/100 μL濃度的卵清蛋白溶液100 μL滴在1 cm×1 cm紗布上并貼于脫毛部位，外用膠帶固定1周。間隔2周后重復(fù)上述步驟，共致敏3次。在最后一次致敏前一周開(kāi)始給藥，清熱利濕方低、中、高劑量組分別給予1 g/mL、2 g/mL、4 g/mL的清熱利濕方灌胃，西替利嗪組給予25 mg/mL的西替利嗪灌胃，空白組、模型組灌胃等量的生理鹽水，均1次/d，連續(xù)2周。

1.5觀察指標(biāo)及方法

1.5.1皮膚病理HE染色觀察 灌胃結(jié)束后24 h內(nèi)處死各組小鼠，取背部皮膚，固定于中性福爾馬林溶液中，石蠟包埋，切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇洗脫至水，進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察。

1.5.2皮膚組織中FLG、LOR及IVL mRNA表達(dá)RT-PCR檢測(cè) 從液氮中取出各組小鼠背部皮膚，使用TRIzol試劑根據(jù)制造商的方案分離總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄將RNA轉(zhuǎn)為cDNA，使用SYBR Green PCR Mix試劑盒，在20 μL的反應(yīng)體積中進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR分析。以β-激動(dòng)蛋白做標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參，引物序列：LOR正向引物5’-TCTCAGCAGACCAGTCAGACCTC-3’，反向引物5’-CCTCCACAGCTACCACCTCCTC-3’，編碼長(zhǎng)度83 bp；IVL正向引物5’-CATAAGCCAGAACTGTACCTGA-3’，反向引物5’-GATGCTGCTTCTCTTCCAATTG-3’，編碼長(zhǎng)度127 bp；FLG正向引物5’-CATGAGCACGAACAGCCAGAGTC-3’，反向引物5’-GTCCTCTTCCTCCTGAGCCTGATC-3’，編碼長(zhǎng)度190 bp；β-actin正向引物5’-CTACCTCATGAAGATCCTGACC-3’，反向引物5’-CACAGCTTCTCTTTGATGTCAC-3’，編碼長(zhǎng)度90 bp。用RT-PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析。通過(guò)熔解曲線分析驗(yàn)證PCR產(chǎn)物。相對(duì)表達(dá)水平用ΔΔ計(jì)算CT值。每個(gè)標(biāo)本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠背部皮損情況 空白組小鼠背部皮膚未見(jiàn)明顯增厚，無(wú)紅斑丘疹形成；模型組小鼠背部皮膚肉眼可見(jiàn)明顯增厚、紅斑、脫屑、滲出、糜爛及結(jié)痂等皮損現(xiàn)象；各藥物組小鼠背部皮膚上述表現(xiàn)明顯輕于模型組，清熱利濕方低劑、中劑量組剩余輕微皮膚增厚、腫脹，清熱利濕方高劑量組及西替利嗪組無(wú)明顯滲出、出血或結(jié)痂。見(jiàn)圖1。

2.2各組小鼠背部皮膚病理表現(xiàn) HE染色顯示：模型組小鼠背部表皮角化過(guò)度，棘層明顯肥厚，表皮可見(jiàn)輕度細(xì)胞間水腫及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；各藥物組小鼠背部表皮棘層輕度肥厚，細(xì)胞間水腫較輕，清熱利濕方高劑量組病理表現(xiàn)與西替利嗪組相當(dāng)。見(jiàn)圖2。

2.3各組小鼠皮膚組織中FLG、LOR、IVL mRNA表達(dá)情況 模型組小鼠皮膚組織中FLG、LOR、IVL mRNA表達(dá)水平均明顯低于空白組(P均<0.05)。各藥物組小鼠皮膚組織中FLG、LOR、IVL mRNA表達(dá)水平均明顯高于模型組(P均<0.05)，清熱利濕方低、中、高劑量組各指標(biāo)呈濃度梯度依賴(lài)性增高，清熱利濕方高劑量組與西替利嗪組各指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠皮膚組織中FLG、LOR、IVL mRNA表達(dá)水平比較

3 討 論

特應(yīng)性皮炎多起病于兒童期，常有過(guò)敏進(jìn)行曲(atopic march)的最初表現(xiàn)，包括哮喘、食物過(guò)敏和過(guò)敏性鼻炎[4]。有研究顯示全球有超過(guò)20%的兒童及3%的成年人患有特應(yīng)性皮炎[5]。近年來(lái)該病患病率在工業(yè)化國(guó)家中呈顯著增高趨勢(shì)[6]，正逐漸成為一個(gè)社會(huì)共同面臨的健康問(wèn)題。

特應(yīng)性皮炎的致病因素復(fù)雜，全基因組關(guān)聯(lián)研究表明皮膚屏障功能受損及個(gè)體免疫異常是引起該疾病的主要原因[7]。FLG、LOR及IVL是涉及角化包膜形成的關(guān)鍵蛋白，對(duì)皮膚屏障功能的形成起著不可替代的作用[8-9]。在中度至重度的特應(yīng)性皮炎病例中，大約50%歸因于FLG基因突變[10]。FLG的前體為一個(gè)約500 kDa的磷酸化組氨酸多聚蛋白——絲聚蛋白原，絲聚蛋白原合成后被磷酸化儲(chǔ)存在角質(zhì)透明顆粒中，經(jīng)去磷酸化蛋白水解成約35 kDa的單體絲聚蛋白肽，這些有活性的絲聚蛋白肽協(xié)助角蛋白絲聚集形成致密的角蛋白纖維束，并在轉(zhuǎn)谷酰胺酶的作用下形成一個(gè)不能溶解的屏障——角質(zhì)包膜，阻止水分流失，同時(shí)也保護(hù)機(jī)體不受環(huán)境影響。FLG從角蛋白纖維束中解離后能進(jìn)一步降解成自由氨基酸和吸水性衍生物，可通過(guò)結(jié)合水而維持皮膚的水分，因此FLG表達(dá)減少和缺失與皮膚干燥有關(guān)，它能影響角質(zhì)層的滲透作用，導(dǎo)致角質(zhì)層含水量下降，同時(shí)引起表皮水分丟失量增加[11]。LOR作為表皮角質(zhì)化包膜的主要成分，在角化期間最初表達(dá)于顆粒層，其占角質(zhì)層總蛋白質(zhì)量的70%～85%[12]。IVL是表皮角化包膜的早期前體蛋白，是其他角化包膜蛋白附著的支架[13]。因此，恢復(fù)FLG、LOR、IVL的表達(dá)有助于表皮屏障功能障礙的復(fù)原。

目前，臨床對(duì)于特應(yīng)性皮炎的治療以抗過(guò)敏藥(如西替利嗪、氯雷他定等)、糖皮質(zhì)類(lèi)固醇激素、鈣調(diào)磷酸酶抑制劑為主，其中抗過(guò)敏藥可導(dǎo)致頭痛、口干、嗜睡，甚至誘發(fā)青光眼及引起心律失常等問(wèn)題，糖皮質(zhì)激素長(zhǎng)期使用可導(dǎo)致色素沉著或減退、毛細(xì)血管擴(kuò)張、皮膚萎縮等[14-15]，鈣調(diào)磷酸酶抑制劑價(jià)格昂貴且有潛在致癌風(fēng)險(xiǎn)，因而這些藥物不宜長(zhǎng)期使用。

中醫(yī)理論認(rèn)為特應(yīng)性皮炎屬于中醫(yī)“奶癬”“四彎風(fēng)”“血風(fēng)瘡”范疇。病因?yàn)橄忍旆A賦不耐，胎毒遺熱，心火過(guò)旺，外加后天喂養(yǎng)不當(dāng)，飲食失調(diào)，脾虛濕從內(nèi)生，復(fù)外感風(fēng)、濕、熱諸邪，阻滯肌膚與氣血搏結(jié)，引起臟腑功能紊亂，衛(wèi)氣不得宣泄，水濕不得運(yùn)化，氣血津液不得濡養(yǎng)肌膚而成[16-17]。中醫(yī)藥可通過(guò)多種途徑達(dá)到祛風(fēng)利濕、清熱潤(rùn)燥的功效。清熱利濕方由金銀花、白花蛇舌草、土茯苓和烏桕葉組成，主要功效為清熱祛濕、疏風(fēng)解毒，臨床用于治療急性期特應(yīng)性皮炎療效確切。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各藥物組小鼠皮損嚴(yán)重程度均輕于模型組，皮膚組織中FLG、LOR、IVL mRNA表達(dá)水平均明顯高于模型組，且清熱利濕方低、中、高劑量組LG、LOR、IVL mRNA表達(dá)水平呈濃度梯度依賴(lài)性增高，清熱利濕方高劑量組與西替利嗪組各指標(biāo)比較無(wú)明顯差異。提示清熱利濕方可減輕特應(yīng)性皮炎小鼠的皮損嚴(yán)重程度，上調(diào)皮膚屏障功能相關(guān)的關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，不失為一個(gè)治療特應(yīng)性皮炎新的可供選擇的藥物。然而特應(yīng)性皮炎的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且誘發(fā)因素較多，加之清熱利濕方為中藥復(fù)方，其成分復(fù)雜，具體作用機(jī)制仍有待后續(xù)深入研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。