尹艷楠，談家金，李夢偉，許嘉麟，郝德君

(南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037)

松材線蟲病(pine wilt disease)是一種由松材線蟲對赤松(Pinusdensiftora)、馬尾松(P.massoniana)、黑松(P.thunbergii)等易感樹種寄生、取食引起樹種死亡的病害，由于其易傳播、發(fā)病快，被稱為松樹的癌癥[1]。自1982年在我國南京首次發(fā)現(xiàn)松材線蟲病以來[2]，該病害相繼蔓延至多個省市，現(xiàn)已擴張到高海拔地區(qū)和遼寧等低溫地帶，引起松林大片枯死，給我國的松林資源造成了巨大損失，被列為國內(nèi)頭號森林植物檢疫對象[3-4]。

為控制松材線蟲病，我國投入了大量的人力物力[5]，化學(xué)防治是目前最常用且有效的方法，但現(xiàn)在應(yīng)用的化學(xué)殺線蟲劑大多數(shù)為高毒、高殘留的藥劑，容易使線蟲產(chǎn)生抗藥性，且大量使用化學(xué)藥劑容易產(chǎn)生“3R”問題[6]，對人畜極不安全，對大氣、水體、土壤等環(huán)境也造成污染，破壞自然生態(tài)平衡[7]。近年來，學(xué)者們開始探究微生物對松材線蟲病的生物防治作用，主要涉及的細菌有寄生細菌、根際細菌和植物內(nèi)生細菌，其中有應(yīng)用前景的細菌是芽孢桿菌屬(Bacilllus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、巴氏桿菌屬(Pasteurella)等，研究最多的仍是芽孢桿菌屬細菌[8-10]。李亮亮等[11]從南京濕地松(P.elliotti)上分離出了蠟樣芽孢桿菌(B.cereus) NJSZ-13菌株，初步研究表明該菌株菌體水懸液處理線蟲48 h后線蟲死亡率達到81.5%，并且該菌株在馬尾松體內(nèi)定殖能力強[12]，對松材線蟲病具有良好的生物防治潛能。為避免接入線蟲數(shù)量過少達不到馬尾松出現(xiàn)松材線蟲病癥狀或接入線蟲數(shù)量過多對防治效果造成誤差，筆者研究松材線蟲AMA3蟲株對2年生馬尾松致病的最佳接種量(接種松材線蟲臨界值)，進一步探究溫室下蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株對馬尾松盆栽苗松材線蟲病的防治效果，為松材線蟲的有效防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

灰葡萄孢菌由南京林業(yè)大學(xué)森林病理實驗室提供。

蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株由南京林業(yè)大學(xué)森林病理實驗室提供。

松材線蟲AMA3蟲株分離自安徽省病死的黑松樹體[13]，現(xiàn)保存于南京林業(yè)大學(xué)松材線蟲蟲株資源庫。

NA固體培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g/L，牛肉膏 5 g/L，氯化鈉 5 g/L，瓊脂 20 g/L，pH為7.2～7.4。

NA液體培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g/L，牛肉膏 5 g/L，氯化鈉 5 g/L，pH為7.2～7.4。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g/L，葡萄糖 10 g/L，磷酸氫二鈉 2 g/L，磷酸二氫鈉 2 g/L，氯化鈉2 g/L，pH為7.2～7.4。

2年生馬尾松盆栽苗健康株購自廣西區(qū)靜怡花園有限公司，試驗前先定植3個月待用。

強夯技術(shù)是利用物理學(xué)上的自由落體運動原理，讓重錘從一定的高度上自由下落，由此來加固路基，提高路基的承載力。這種操作簡單并且工程消耗量較小的方法，在我國公路建設(shè)過程中得到廣泛的應(yīng)用。該項技術(shù)可適用于多種土壤路基的加固，比如：黏性土壤、潮陷性土壤等，都可以通過使用該技術(shù)達到工程建設(shè)的質(zhì)量標準。

1.2 蠟樣芽孢桿菌懸液的制備

蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株菌懸液的制備：將發(fā)酵24 h的蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株發(fā)酵液在離心機中以8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，棄上清液，得到菌體沉淀，用無菌水沖洗2遍，配置菌體濃度為4×108cfu/mL的菌懸液。

蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株菌粉水懸液的制備：將以低溫噴霧干燥機于105 ℃噴霧制得的蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株菌粉溶解到無菌水中，將水懸液的菌體濃度分別調(diào)整到4×108、4×107、2×107cfu/mL。

松材線蟲AMA3蟲株懸液的制備：將AMA3蟲株接種在長滿灰葡萄孢(Botrytiscinerea)的PDA平板上，放置于25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至灰葡萄孢菌絲消失，蟲株長滿平板。采用貝爾曼漏斗法[14]分離收集蟲株，離心后用過氧化氫清洗，用無菌水沖洗兩次作為AMA3蟲株懸液，顯微鏡下計數(shù)每mL的蟲株數(shù)量，分別將菌體濃度調(diào)制2 000、4 000、6 000條/mL。

1.3 接種松材線蟲臨界值測定

選擇生長狀態(tài)相近的2年生馬尾松，利用皮接法接入松材線蟲AMA3蟲株[15]，每處理分別接種AMA3蟲株2 000、4 000、6 000條，以無菌水作為對照，每處理5株，觀察并記錄發(fā)病情況。

1.4 NJSZ-13菌株發(fā)酵液、菌懸液、發(fā)酵濾液防治松材線蟲病試驗

選擇生長狀態(tài)相近的2年生馬尾松幼苗，以灌根法分別施入稀釋10倍后的蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株發(fā)酵液、菌懸液、無菌發(fā)酵濾液各20 mL，其中發(fā)酵液和菌懸液的菌體濃度為4×108cfu/mL，以無菌水處理和培養(yǎng)基處理作為對照，對照組CK 1施培養(yǎng)基；CK 2施無菌水，CK 3施無菌水。每處理6株，7 d后處理組及CK 1、CK 2樹皮接種AMA3蟲株[12]，CK 3樹皮接種無菌水，觀察并記錄發(fā)病情況。

1.5 NJSZ-13菌株菌粉防治松材線蟲病試驗

選擇生長狀態(tài)相近的2年生馬尾松幼苗，以灌根法分別施入菌體濃度為4×108、4×107、2×107cfu/mL的蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株菌粉水懸液各20 mL，以無菌水處理為對照，對照組CK 1、CK 2施無菌水。每處理6株，7 d后處理組及CK 1樹皮接AMA3蟲株，CK 2樹皮接無菌水，觀察并記錄發(fā)病情況。

對2年生馬尾松幼苗分別以灌根法[16]施入菌體濃度為4×108cfu/mL的蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株菌粉水懸液20 mL和菌粉涂抹法[17]涂抹菌體含量為7.13×109cfu/g的蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株菌粉1.12 g，以無菌水處理為對照，CK 1、CK 2均施無菌水，每處理6株，7 d后處理組及CK 1樹皮接種AMA3蟲株，CK 2樹皮接種無菌水，記錄發(fā)病情況。

1.6 馬尾松發(fā)病情況觀察

接種AMA3蟲株后，每5天記錄馬尾松發(fā)病狀況并計算感病指數(shù)，直至皮接AMA3蟲株對照組全部發(fā)病死亡后，計算馬尾松感病率、死亡率以及蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株對松材線蟲病的防治效果。馬尾松病情分級和病情指數(shù)的計算參照談家金等[18]的方法：

感病指數(shù)=∑(各病級株數(shù)×病級代表值)×100/總株數(shù)×最高病級的代表值；

感病率=感病株數(shù)/接種總株數(shù)×100%；

死亡率=死亡株數(shù)/接種總株數(shù)×100%；

防治效果=(對照感病指數(shù)-處理感病指數(shù))/對照感病指數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬尾松接種松材線蟲AMA3蟲株臨界值分析

對2年生馬尾松幼苗接種不同濃度的松材線蟲AMA3蟲株試驗結(jié)果表明，處理3(接種6 000條AMA3蟲株)的發(fā)病最快，接種20 d后馬尾松就表現(xiàn)出松材線蟲病癥狀；接種30 d后，處理1(接種2 000條)和處理2(接種4 000條)AMA3蟲株的才表現(xiàn)出癥狀，感病指數(shù)分別為10和20，而此時的處理3感病指數(shù)已達到55(表1)。

表1 2年生馬尾松接種松材線蟲病害情況

接種50 d后，處理1感病指數(shù)為55，感病率和死亡率分別為60%和40%(表1)，處理2、3感病指數(shù)都達到100%，盆栽松苗全部發(fā)病且達到4級(圖1)。由此可知，對2年生盆栽馬尾松接種松材線蟲AMA3蟲株，松材線蟲數(shù)量濃度越大，發(fā)病越快，感病指數(shù)越高。因處理2與處理3最終的死亡率一致，為更好地顯現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株的防治效果，故以4 000條松材線蟲AMA3蟲株數(shù)量濃度作為2年生盆栽馬尾松接種松材線蟲臨界值。

圖1 2年生馬尾松接種松材線蟲后50 d的發(fā) 病癥狀Fig.1 Symptoms of the pine wilt disease at 50 days after being inoculated by B. xylophilus on two- year-old P. massoniana

2.2 NJSZ-13菌株發(fā)酵液、菌懸液、發(fā)酵濾液防治松材線蟲病效果比較

采用灌根法，將蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株發(fā)酵后得到的發(fā)酵液、菌懸液、無菌發(fā)酵濾液分別施于馬尾松苗，7 d后接種AMA3蟲株，結(jié)果顯示：接種AMA3蟲株后第10天，發(fā)酵液處理1、CK 1、CK 2均出現(xiàn)了不同程度的松材線蟲病發(fā)病癥狀，部分松苗松針開始褪綠變黃，有的開始萎蔫，接種AMA3蟲株后30 d，只有菌懸液處理2感病指數(shù)在50以下，其他處理組感病指數(shù)均在55以上，接種AMA3蟲株 40 d后，CK 1、CK 2對照組及處理1、處理3全部感病死亡，發(fā)酵液和無菌發(fā)酵濾液對松材線蟲病的防治效果為0，此時菌懸液處理的馬尾松有兩棵表現(xiàn)健康仍未感病，整體感病指數(shù)為67，防治效果為33%，感病率和死亡率均為67%(表2)。試驗結(jié)果表明，采用灌根法對馬尾松苗施入蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株的發(fā)酵液和無菌發(fā)酵濾液均不能對松材線蟲病起到預(yù)防作用，施入蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株菌懸液對松材線蟲病有一定的預(yù)防效果。

表2 蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株發(fā)酵物對馬尾松苗松材線蟲病的防治效果

2.3 不同施用濃度下NJSZ-13菌粉防治松材線蟲病效果比較

采用灌根法以不同菌體濃度的蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株菌粉水懸液處理馬尾松，7 d后接種AMA3蟲株，結(jié)果顯示：接種AMA3蟲株后第10天，施菌粉水懸液2×107cfu/mL的處理4與CK 1均出現(xiàn)松材線蟲病癥狀，松針失水變黃，出現(xiàn)萎蔫。接種AMA3蟲株后40 d，CK 1全部發(fā)病死亡，施菌懸液(4×108cfu/mL)的處理1 防治效果為33%，施菌粉水懸液4×108cfu/mL的處理2和4×107cfu/mL的處理3的防治效果均為37%，而處理4的防治效果為21%(表3)。在整個發(fā)病過程中，CK 1感病指數(shù)均高于4組處理，而空白對照組CK 2均未表現(xiàn)出發(fā)病癥狀。試驗結(jié)果表明，同一菌體濃度下蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株菌粉水懸液和發(fā)酵菌懸液對松材線蟲病的預(yù)防效果相當；當菌體濃度達到一定值以后，增加濃度也不會提高防效。

表3 不同施用濃度下蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株菌粉對松材線蟲病的防治效果

2.4 不同施用方式下NJSZ-13菌粉防治松材線蟲病效果比較

研究發(fā)現(xiàn)，以蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株菌粉水懸液灌根法和菌粉涂抹法兩種方式處理2年生馬尾松幼苗，7 d后接種AMA3蟲株，在接種AMA3蟲株后第10天時，CK 1出現(xiàn)松材線蟲病癥狀，灌根處理1和涂抹處理2均未感病，松苗正常生長，在15 d以后，處理1和處理2開始出現(xiàn)松材線蟲病發(fā)病癥狀，接種AMA3蟲株后第40天，CK 1全部死亡，此時處理1的感病指數(shù)為67，防治效果為33%；處理2的感病指數(shù)為63，防治效果為37%(表4)。試驗結(jié)果表明，將蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株菌粉直接涂抹松枝，與灌根菌粉水懸液的方法相比，兩者對松材線蟲病的防治效果相當。

表4 不同施用方式下蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株菌粉對松材線蟲病的防治效果

2.5 不同施用時間下NJSZ-13菌粉防治松材線蟲病的效果比較

本次試驗中，處理1在馬尾松接種AMA3蟲株前7天，處理2接種AMA3蟲株當天和處理3接種AMA3蟲株后7天分別以灌根法施入4×108cfu/mL的NJSZ-13菌株菌粉水懸液20 mL，試驗結(jié)果顯示：接種AMA3蟲株后第10天，處理3就出現(xiàn)松材線蟲病癥狀，在接種AMA3蟲株的10～40 d，感病指數(shù)與CK 1基本吻合(表5)，接種AMA3蟲株后第40天時，處理3與CK 1的馬尾松已全部死亡，處理3的防治效果為0，此時，處理2全部感病，但并未全部死亡，感病指數(shù)為88，防治效果為12%；而處理1感病指數(shù)為67，防治效果最好(33%)，處理2防治效果比處理1低。原因可能是接種AMA3蟲株和施蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株同時進行，菌體在馬尾松體內(nèi)的定殖擴展速度較松材線蟲慢。由此可見，蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株對馬尾松松材線蟲病的預(yù)防效果要大于治療效果，原因可能是接種松材線蟲前7天或者當天施用該菌的處理組在松材線蟲進到植株內(nèi)時，菌株已在植株體內(nèi)定殖，從而對松材線蟲產(chǎn)生作用，馬尾松在感染松材線蟲之前以灌根法施入蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株的防治效果會更好。

表5 不同施用時間下蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株菌粉對松材線蟲病的防治效果

3 討 論

本研究對溫室內(nèi)具有殺線蟲作用的蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株防治松材線蟲病的防治效果進行了初步探究，蠟樣芽孢桿菌菌懸液對盆栽馬尾松松材線蟲病的防治效果最好；蠟樣芽孢桿菌使用濃度增加會提高對松材線蟲病的防治效果，當濃度達到一定值后，防治效果不再隨濃度的增大而提高；蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株對松材線蟲病的預(yù)防效果大于治療效果；通過灌根法和涂抹松枝法兩種方式施菌試驗對松材線蟲病的預(yù)防效果相當。

松材線蟲病自被發(fā)現(xiàn)以來，呈蔓延趨勢發(fā)展，國內(nèi)外一直重視松材線蟲病防治技術(shù)的研究[19]，尤其是以松材線蟲為靶標，利用具有殺線蟲作用的微生物進行生物防治技術(shù)研究，現(xiàn)已有多名研究者發(fā)現(xiàn)對松材線蟲具有殺線蟲活性的細菌，朱麗梅等[20]在馬尾松上分離到1株解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、Niu 等[21]從土壤中分離到1株芽孢桿菌菌株B16、羅蘭等[22]篩選出2株蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)菌株；Zheng等[23]分離到1株缺陷短波單胞菌(Brevundimonasdiminuta) LCB-3菌株；王方等[24]分離到1株FlectobacillusrhizosphaeraeG8-1菌株。南京林業(yè)大學(xué)病理實驗室從美國松材線蟲上分離到1株嗜麥芽窄食單胞菌 (Stenotrophomnasmaltophilia) Smal-007菌株，該菌株因致病力弱且是線蟲體表優(yōu)勢菌株，定殖能力強，可有效降低黑松苗的感病指數(shù)，可作為生防細菌的候選菌株[25-26]，后期將菌株Smal-007發(fā)酵液噴灑到福建等地野外松林，明顯降低了松樹的病死率[27]。本研究利用李亮亮等[11]篩選出的具有殺線蟲作用的蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株，從不同的發(fā)酵產(chǎn)物、施菌濃度、施用方式、時間進行防治松材線蟲病的探究得到，一定濃度下的蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株菌懸液和菌粉水懸液對松材線蟲病均表現(xiàn)出較好的預(yù)防效果，通過菌粉涂抹法處理松枝也可以將菌體成功接種到馬尾松體內(nèi)，這與He等[17]采用涂抹葉片接種法將枯草芽孢桿菌(B.subtilis)BS-2菌株成功接種到多種植物體內(nèi)相一致，從而發(fā)揮對松材線蟲病的預(yù)防效果，因此蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株防治松材線蟲病的溫室試驗進一步表現(xiàn)出該菌株具有良好的生防潛能。

蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株對松材線蟲的拮抗機制還不清楚，此次研究該菌在馬尾松苗上對松材線蟲病的防治效果還不是很好，且處理組只有6株松苗，未能很好地排除試驗誤差，今后在弄清其拮抗機制的基礎(chǔ)上，可考慮從遺傳改良工程菌構(gòu)建、菌劑復(fù)配等方面進一步提高其防治效果。