孔鈺婷，何洪，安鳳平,2，宋洪波,2，黃群,2

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002）（2.福建省特種淀粉品質(zhì)科學(xué)與加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350002）

太子參為石竹科植物孩兒參的塊根，全國(guó)各地均有種植，主要產(chǎn)自于福建、江蘇、貴州等地，具有益氣健脾，生津潤(rùn)肺之功效，已被衛(wèi)計(jì)委確定列入 “ 可用于保健食品的中藥材名單 ” ，以飲食養(yǎng)生為主的藥膳食用習(xí)慣更為普遍，具有良好的藥用價(jià)值和保健作用[1]。已研發(fā)生產(chǎn)典型的藥品、功能與保健食品有太子參復(fù)方顆粒、口服液、養(yǎng)生酒等。隨著太子參生物活性研究的不斷深入，其在藥品和功能食品方面的研究與應(yīng)用前景廣闊。已報(bào)道具有環(huán)肽、多糖、皂苷、氨基酸等多種活性成分，而關(guān)于太子參的功能研究則主要集中在太子參粗提物的心臟保護(hù)作用[2]、降血糖[3]、免疫調(diào)節(jié)[4]和抗疲勞[5]作用，但對(duì)腸道功能特性的研究較少有報(bào)道。

當(dāng)機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的自由基累積到一定程度會(huì)破壞機(jī)體氧化/抗氧化的平衡，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，生物細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等生物分子就會(huì)發(fā)生改變甚至被破壞，如DNA修復(fù)機(jī)制受到破壞從而增強(qiáng)DNA突變的產(chǎn)生，蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變從而喪失蛋白質(zhì)功能等，因此氧化應(yīng)激與人類系統(tǒng)疾病的發(fā)生有著密切聯(lián)系，而腸道作為物質(zhì)吸收和能量代謝的主要器官，極易受到自由基攻擊造成功能異常，影響機(jī)體代謝從而引發(fā)多種慢性疾病。許多研究已經(jīng)證明腸道菌群能影響宿主的氧化/抗氧化水平，益生菌產(chǎn)生的超氧化物、過氧化氫酶及抗氧化代謝物[6]，刺激宿主的抗氧化系統(tǒng)，可保護(hù)宿主細(xì)胞免受氧化應(yīng)激等多種因素的影響[7]，激活抗氧化信號(hào)通路[8]。

本研究以太子參為原材料，通過實(shí)驗(yàn)室提取與初步純化得到太子參醇提物，利用D-半乳糖致?lián)p動(dòng)物模型初步研究太子參醇提物提高臟器抗氧化酶活的同時(shí)明確其對(duì)抗氧化相關(guān)腸道菌群具有積極作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

太子參購(gòu)自福建咸康藥業(yè)有限公司，粉碎過40目備用。清潔級(jí)ICR小鼠購(gòu)自福建醫(yī)科大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK（閩）2016-0002。

香草醛，α-萘酚阿拉丁試劑（上海）有限公司；冰醋酸，亞硝酸鈉，苯酚，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯化鋁，上海泰坦科技股份有限公司；Rb1標(biāo)準(zhǔn)品，安徽西青果生物科技有限公司；蘆丁，北京索萊寶科技有限公司；D101大孔樹脂，艾美科?。ㄖ袊?guó)）生物醫(yī)藥有限公司。

D-半乳糖，Sigma公司；注射用生理鹽水，福州海王福藥制藥有限公司；蛋白定量測(cè)定試劑盒，總超氧化物歧化酶（T-AOC），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX），總抗氧化能力（T-AOC）測(cè)定試劑盒，南京建成科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1780紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司；N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，F(xiàn)DU-1200冷凍干燥機(jī)，上海愛朗儀器有限公司；HL-2S恒流泵，上海瀘西分析儀器廠有限公司；SpectraMax PLUS酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司；MS 3渦旋震蕩，德國(guó)IKA公司；Heraeus Fresco17離心機(jī)，Thermo Fisher Scientific公司；M199型切片刀，德國(guó)萊卡儀器（中國(guó)）有限公司；BMJ-A包埋機(jī)，常州中威電子儀器有限公司；BA210T型顯微鏡，Motic公司。

1.3 方法

1.3.1 太子參醇提物的制備

粉碎過40目篩的太子參按料液比1:8加入70%乙醇，60 ℃水浴鍋中回流提取兩次，每次1 h，兩次濾液合并于50 ℃旋蒸濃縮至1/4。太子參濃縮液用石油醚萃取后旋蒸去除石油醚，用水補(bǔ)足體積，稀釋8倍后上大孔樹脂D101，水洗至Molish反應(yīng)至陰性，30%乙醇洗脫，收集洗脫液減壓濃縮，冷凍干燥得粉末。

1.3.2 總糖、黃酮和皂苷含量的測(cè)定

1.3.2.1 總糖的測(cè)定[9]

采用苯酚-濃硫酸法。取1 mL樣品溶液，加5%苯酚1 mL，混勻后加5 mL濃硫酸，混勻，室溫避光反應(yīng)30 min后于490 nm處測(cè)定吸光度。以葡萄糖為標(biāo)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.2 黃酮的測(cè)定

參考Karen Pitura等[10]的方法測(cè)定，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.3 皂苷的測(cè)定

取適量樣品溶液于10 mL具塞試管中，60 ℃水浴揮干溶劑，加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液，0.8 mL高氯酸，混勻，密塞水浴加熱15 min后冰水浴冷卻，加入5 mL冰醋酸，搖勻，于560 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以人參皂苷Rb1為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[11]。

1.3.3 體內(nèi)抗氧化能力的測(cè)定

1.3.3.1 試驗(yàn)動(dòng)物的分組與試驗(yàn)方法

72只雄性ICR小鼠（20±2 g）適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為6組，分別為正常組（NC）、模型組（DG）、陽性對(duì)照組（PC）、低劑量組（LPEs）、中劑量組（MPEs）和高劑量組（HPEs），每組12只。除NC組外，其余各組每天頸后背皮下注射1000 mg/kg D-半乳糖致氧化損傷，NC組注射生理鹽水。LPEs組、MPEs組和HPEs組小鼠每天50、100、300 mg/kg[12]太子參醇提物灌胃，PC組小鼠每日灌服50 mg/kg Vc，DG組和NC組每日灌胃等體積生理鹽水，試驗(yàn)周期為5周[13]。試驗(yàn)期間每天早上8:40～9:40稱量體重，觀察小鼠的一般體征。所有動(dòng)物試驗(yàn)均遵照 “ 試驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南 ” 進(jìn)行，并得到福建省醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的審查和批準(zhǔn)（編號(hào)：FJMUIACUC 2019-0075）。

1.3.3.2 臟器指數(shù)的測(cè)定

試驗(yàn)周期結(jié)束后，小鼠禁食不禁水12～14 h，摘眼球采血后頸部脫臼處死小鼠，迅速取出肝臟、腎臟、腦、脾臟，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈后用濾紙吸干，稱重。計(jì)算公式為：

1.3.3.3 臟器抗氧化酶活性測(cè)定

CAT、SOD、GXH-PX和MDA的檢測(cè)根據(jù)南京建成試劑盒說明書的要求進(jìn)行，對(duì)小鼠肝臟、腎臟、腦部勻漿與血清抗氧化酶活性和MDA含量的檢測(cè)。

1.3.3.4 肝臟切片

將小鼠肝組織用10%中性福爾馬林固定然后用乙醇梯度脫水。二甲苯洗脫，然后依次在100%、95%、85%和75%乙醇，依次放置5 min；再用蒸餾水浸洗5 min，石蠟包埋，切片（5 μm）。蘇木素對(duì)肝組織進(jìn)行染色5～10 min，蒸餾水沖洗，伊紅染3～5 min，蒸餾水沖洗；梯度酒精（95%～100%）脫水，取出后置于二甲苯10 min，重復(fù)操作2次，中性樹膠封片，顯微鏡下放大100倍觀察。

1.3.3.5 小鼠盲腸內(nèi)容物的微生物分析

試驗(yàn)周期結(jié)束后，無菌環(huán)境取出小鼠盲腸內(nèi)容物裝入無菌凍存管，液氮速凍后置-80 ℃保存。使用TIANamp Stool DNA kit試劑盒從小鼠盲腸內(nèi)容物中提取微生物總DNA，對(duì)16S rDNA基因V3V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系：5×reaction buffer 5 μL，5×GC buffer 5 μL，Dntp 2 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.75 μL，Q5 DNAPolymerase 0.25 μL。PCR擴(kuò)增參數(shù)：初始變性98 ℃ 2 min，變性98 ℃ 15 s，退火55 ℃ 30 s，引物延伸72 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 5 min， 10 ℃ Hold，25～30個(gè)循環(huán)，利用IlluminaMiSeq平臺(tái)對(duì)群落DNA片段進(jìn)行雙端測(cè)序。

1.3.3.6 小鼠小腸組織形態(tài)

小心取出小腸，用預(yù)冷的生理鹽水將內(nèi)容物沖洗出來后放入中性福爾馬林，用于病理切片分析。

1.2.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用DPS 7.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，測(cè)定結(jié)果以x±s（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）表示。采用單因素方差分析并用LSD法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 太子參醇提物總糖、黃酮和皂苷的含量

從表1可以看出，經(jīng)大孔樹脂D101富集、30%乙醇的洗脫物中，主要含有皂苷類、黃酮類和糖類物質(zhì)，其中皂苷類物質(zhì)含量達(dá)到613.48 mg/g干物質(zhì)。

表1 太子參醇提物總糖、黃酮、皂苷的含量（mg/g干物質(zhì)）Table 1 Total sugar, saponin and flavonoids in the extract of radix pseudostellariae

2.2 小鼠體重和生長(zhǎng)狀況

圖1 太子參醇提物對(duì)小鼠體重變化的影響Fig.1 Effects of PEs on body weight changes of mice

如圖1所示，各組小鼠經(jīng)適應(yīng)喂養(yǎng)后體重穩(wěn)定，未見顯著差異（0周）。隨著試驗(yàn)的進(jìn)行，DG組與各試驗(yàn)組小鼠體重開始逐漸產(chǎn)生差異，表現(xiàn)為行動(dòng)遲緩、毛發(fā)枯燥缺少光澤，說明皮下注射D-半乳糖對(duì)小鼠生長(zhǎng)會(huì)造成一定影響[13]。試驗(yàn)第5周時(shí)，NC組和PC組體重為41.20 g和39.20 g，經(jīng)低、中、高劑量太子參醇提物喂養(yǎng)小鼠的體重分別為39.40 g、39.70 g和40.60 g，而DG組為38.60 g，說明灌胃太子參醇提物和Vc對(duì)模型小鼠生長(zhǎng)緩慢具有明顯促進(jìn)作用。

2.3 臟器指數(shù)

表2 小鼠各臟器指數(shù)的測(cè)定結(jié)果（mg/g）Table 2 The determination of organ index in mice (mg/g)

由表2可知，與NC組相比，DG組小鼠各臟器指數(shù)顯著降低，說明皮下注射D-半乳糖小鼠確實(shí)發(fā)生了機(jī)體損傷。通過灌胃Vc和太子參醇提物均可提高致?lián)p小鼠的臟器指數(shù)，其中高劑量效果顯著（p＜0.05），與DG組相比，分別提高了22.76%（脾臟）、2.66%（大腦）、6.38%（肝臟）和8.51%（腎臟），基本達(dá)到了正常水平，效果好于Vc。PC組各臟器指數(shù)與DG組差異不顯著，其原因有待進(jìn)一步研究。

2.4 體內(nèi)抗氧化酶活和MDA含量

圖2 小鼠臟器中抗氧化酶活Fig.2 Effects of PEs on antioxidant activity in organ tissues of mice

如圖2所示，DG組小鼠各臟器組織中CAT、SOD和GSH-PX活力均顯著低于NC組，表明皮下注射D-半乳糖能使小鼠體內(nèi)抗氧化水平降低。各劑量組小鼠CAT、SOD和GSH-PX活力均有所提升，其中HPEs組肝臟、腎臟和腦組織中的CAT活力均達(dá)到正常水平，MPEs組與HPEs組之間無顯著差異。中、高劑量組肝臟、腎臟和腦組織中CAT酶活達(dá)到或超過PC組的CAT酶活水平。與DG組相比，三個(gè)劑量組各器官的SOD酶活均有不同程度上升，其中HPEs組肝臟、腎臟和腦部SOD酶活分別提高16.64%，19.94%和14.55%，低中劑量的太子參醇提物即可達(dá)到Vc效果，而HPEs組腎臟中SOD酶活顯著高于PC組，因此高劑量太子參醇提物增強(qiáng)各臟器SOD酶活的能力顯著強(qiáng)于Vc。PC組GSH-PX酶活與NC組相比無顯著性差異（p＞0.05），LPEs組小鼠肝臟、腎臟和腦部的GSH-PX酶活高于DG組，但差異不顯著，MPEs組的效果好于LPEs組；HPEs組小鼠肝臟、腎臟和腦部的GSH-PX酶活與正常組無顯著性差異。與張振明等[14]研究結(jié)果類似，由此可見太子參醇提物對(duì)D-半乳糖致?lián)p傷小鼠的抗氧化能力的改善明顯量效關(guān)系，高劑量太子參醇提物的效果優(yōu)于Vc。

圖3 小鼠臟器中MDA的含量Fig.3 Effects of PEs on MDA content in organ tissues of mice

丙二醛（MDA）含量越高，意味著生物膜受氧化破壞越嚴(yán)重[15]。圖3表明，與NC組相比，皮下注射D-半乳糖使得小鼠肝臟、腎臟和腦部的MDA含量顯著增加，進(jìn)行太子參醇提物和Vc進(jìn)行干預(yù)后，與DG組相比各臟器內(nèi)MDA含量均有不同程度下降，其中MPEs、HPEs組各器官M(fèi)DA含量可恢復(fù)至正常水平，總體上HPEs組清除MDA的效果要好于Vc。這進(jìn)一步表明高劑量太子參醇提物抗氧化能力優(yōu)于Vc。

2.5 肝臟組織切片

肝臟是參與D-半乳糖代謝的主要器官，過量D-半乳糖可增加活性氧（ROS）的產(chǎn)生，可能導(dǎo)致器官損傷[16]。從圖4a可以看出NC組小鼠的肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)具有正常的中心靜脈和肝細(xì)胞，核大而圓；圖4b顯示DG組肝組織有大量脂肪泡蓄積，肝小葉結(jié)構(gòu)不明顯，說明肝臟出現(xiàn)異常[17]。PC組和太子參醇提物干預(yù)各組肝組織情況較DG組好，胞質(zhì)豐富，脂肪蓄積減少，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝血竇以中央靜脈為中心呈均勻的散狀分布，肝組織形態(tài)得到不同程度的恢復(fù)，其中HPEs組肝組織情況與NC組接近，說明高劑量太子參醇提物對(duì)氧化應(yīng)激造成的肝臟組織損傷修復(fù)效果好。

圖4 小鼠肝臟組織切片F(xiàn)ig.4 Tissue slices of mice liver

2.6 UPGMA聚類分析

圖5 基于Unweighted UniFrac距離矩陣的UPGMA聚類分析圖Fig.5 UPGMA clustering analysis based on unweighted UniFracdistance matrix

通過比較不同樣品間Unifrac距離的遠(yuǎn)近來判斷其微生物構(gòu)成的相似性并聚類，從圖5所示的聚類分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，除個(gè)別樣品有重疊外，MPEs組和HPEs組明顯成一簇，相似程度高，而DG組與NC組存在分離，說明NC組、DG組與MPEs和HPEs組微生物構(gòu)成差異較大。

2.7 屬水平群落組成熱

從圖6的上方進(jìn)化樹可以看到，NC、PC和LPEs組聚成一類，MPEs和HPEs組聚成一類，DG組單獨(dú)聚成一類，表明DG組與各組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)在屬水平上相似程度較低，說明注射D-半乳糖致?lián)p對(duì)小鼠腸道微生物屬水平組成影響較大。在DG組中，甲基桿菌屬（Methylobacterium）、阿爾法變形桿菌（Unclassified-Alphaproteobacteria）、普雷沃氏菌屬（Paraprevotella）、理研菌屬（Rikenella）等為代表的潛在致病菌屬含量增加。與DG組相比，HPEs組腸道微生物表現(xiàn)為上調(diào)的菌屬有擬桿菌屬（Parabacteroides）、梭菌屬（Anaerotruncus）、另枝菌屬（Alistipes）、糞芽孢菌屬（Coprobacillus）、S24-7等菌屬的豐度，其中Parabacteroides屬SCFAs產(chǎn)生菌，可以產(chǎn)生戊酸[18]，Anaerotruncus能編碼表達(dá)合成丁酸鹽所需要的酶[19]，Alistipes可能具有預(yù)防和治療如結(jié)腸直腸癌等腸道疾病的潛力[20]，相對(duì)于其他腸道微生物具有更強(qiáng)的金屬抗性[21]，而S24-7屬于丁酸鹽產(chǎn)生菌[22]。MPEs組上調(diào)Bifidobacterium、Bacteroides和Prabacteroides，其中Bacteroides為腸道優(yōu)勢(shì)厭氧菌，能幫助宿主分解多糖[23]，與攝入黨參能提高Bacteroides的研究結(jié)果類似[24]。LPEs組盲腸微生物表現(xiàn)為上調(diào)Odoribacter、梭菌屬（Clostridium）和普氏菌屬（Prevotella）。Clostridium可以合成強(qiáng)抗氧化劑3-吲哚丙酸(色氨酸脫氨的產(chǎn)物)，消除D-半乳糖產(chǎn)生的自由基從而保護(hù)大腦免受氧化傷害；而Prevotella可提高SCFAs的合成速率，增強(qiáng)對(duì)組蛋白去乙?；负虶蛋白偶聯(lián)受體的抑制作用并減少腦損傷[25]。作為主要益生菌，雙歧桿菌（Bifidobacterium）和乳桿菌（Lactobacillus）能改善健康人的總抗氧化狀態(tài)并降低氧化應(yīng)激指標(biāo)[26]。有報(bào)道人參中的多糖能夠改善某些人參皂苷的腸道生物轉(zhuǎn)化，同時(shí)改善腸道菌群的紊亂情況，特別是促進(jìn)Lactobacillus和Bacteroides生長(zhǎng)[27]。本文也有類似試驗(yàn)結(jié)果，特別是與NC組相比，小鼠注射D-半乳糖后腸道Bifidobacterium和Lactobacillus相對(duì)豐度明顯降低，喂食Vc以及高劑量太子參醇提物顯著增加了Bifidobacterium和Lactobacillus的豐度。益生菌的代謝活動(dòng)可通過清除氧化劑化合物或阻止其在腸道中的生成發(fā)揮抗氧化作用[28]。

圖6 結(jié)合聚類分析的屬水平群落組成熱圖（豐度前60菌屬）Fig.6 Heat map of genera-level community based on the cluster analysis (relative abundant Top 60)

圖7 小鼠小腸組織切片圖Fig.7 Intestinal tissue sections of mice

2.8 小腸組織切片

腸粘膜的完整性受損易使腸內(nèi)微生物易位進(jìn)入淋巴系統(tǒng)[29]，更多有害的致病菌會(huì)粘附在腸道上皮，與Bifidobacterium和Lactobacillus等有益菌競(jìng)爭(zhēng)。過量的ROS會(huì)減少腸道粘液層厚度，粘液松散會(huì)大大降低粘液屏障的保護(hù)作用[30]。Bifidobacterium和Lactobacillus均已被證明具有降低動(dòng)物腸道內(nèi)毒素水平和改善粘膜屏障功能[31]。從圖7小腸切片圖可見，NC組小腸組織學(xué)形態(tài)呈正常狀態(tài)，絨毛排列致密，腸絨毛結(jié)構(gòu)完整；DG組絨毛排列較稀疏，絨毛頂部有萎縮現(xiàn)象，說明腸絨毛結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常；PC組較DG組的粘膜損傷情況有所恢復(fù)，但絨毛呈短錐狀，分支仍較少。隨著太子參醇提物劑量的增加，粘膜損傷逐漸修復(fù)，圖7f所示HPEs組小鼠小腸絨毛損傷情況明顯恢復(fù)，致密程度恢復(fù)接近正常水平。

3 結(jié)論

本研究表明，太子參醇提物在一定程度上能增強(qiáng)D-半乳糖模型鼠的抗氧化能力。通過臟器指數(shù)、抗氧化酶活、肝臟組織形態(tài)、小腸微生物等指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明太子參醇提物能改善D-半乳糖模型鼠生長(zhǎng)遲緩的情況，顯著提高小鼠肝臟、腎臟和腦部的CAT、SOD和GSH-PX酶活，降低MDA含量，保護(hù)肝臟組織免受氧化損傷，小鼠體內(nèi)總抗氧化能力提高。同時(shí)，該太子參醇提物能有效提高小腸內(nèi)容物中Bifidobacterium、Lactobacillus、Bacteroides和Blautia相對(duì)豐度，降低Unclassified-Alphaproteobacteria、Rikenella屬等相對(duì)豐度，盲腸絨毛致密程度恢復(fù)接近正常水平，腸道總體患病風(fēng)險(xiǎn)降低，使得機(jī)體總體抗氧化水平得到提高。