楊少勇，黎婷玉，蔡文超，侯強(qiáng)川，劉忠軍，郭 壯*

（1.湖北文理學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽 441053；2.湖北古襄陽酒業(yè)有限公司，湖北 襄陽 441100；3.襄陽市釀酒生物技術(shù)與應(yīng)用企校聯(lián)合創(chuàng)新中心，湖北 襄陽 441053）

白酒在中國有著悠久的歷史且品類繁多，可分為醬香型、清香型、米香型、濃香型、兼香型以及鳳香型等多種香型[1]。白酒的最大特點(diǎn)在于采用了傳統(tǒng)的固態(tài)發(fā)酵技術(shù)，大曲的品質(zhì)決定了白酒的品質(zhì)，具有“曲為酒之骨”的說法[2]。不同地區(qū)制備的大曲其微生物多樣性可能存在一定的差異，張雙燕等[3]利用MiSeq高通量技術(shù)分析北京清香型大曲微生物群落發(fā)現(xiàn)細(xì)菌中優(yōu)勢菌是乳酸菌，真菌中優(yōu)勢菌是假絲酵母屬（Candida）、曲霉屬（Aspergillus）、毛霉屬（Mucor）和威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）等。楊旭等[4]通過同樣的方法對(duì)河南賈湖酒業(yè)中高溫大曲發(fā)酵過程中微生物進(jìn)行了解析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵前期以假絲酵母屬（Candida）、根霉屬（Rhizopus）和曲霉屬（Aspergillus）為主，當(dāng)曲溫達(dá)到頂溫時(shí)，橫梗霉屬（Lichtheimiaceae）成為優(yōu)勢菌群，發(fā)酵后期以毛霉屬（Mucor）和曲霉屬（Aspergillus）為主要真菌菌群。孫利林等[5]亦采用高通量測序技術(shù)對(duì)貴州茅臺(tái)酒大曲中微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢真菌分別為曲霉屬（Aspergillus）、熱子囊菌屬（Thermoascus）和嗜熱真菌屬（Thermomyces）。

湖北省襄陽市位于華中地區(qū)，是荊楚文化的發(fā)源地，白酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展呈現(xiàn)集群優(yōu)勢，擁有石花、堯治河楚翁泉、古襄陽和古隆中等眾多白酒品牌。不同地區(qū)的氣候、地勢以及環(huán)境均可能對(duì)白酒中微生物類群造成影響[6]，因而對(duì)襄陽地區(qū)的釀酒微生物多樣性進(jìn)行解析則顯得極為必要。本研究采用MiSeq高通量測序技術(shù)對(duì)采集自湖北省襄陽市某酒廠的6 份高溫大曲和6 份中高溫大曲的真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，對(duì)高溫大曲和中高溫大曲中特有真菌類群進(jìn)行甄別，以期為后續(xù)釀酒微生物資源的開發(fā)與利用提供一定的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高溫大曲和中高溫大曲：采集自湖北省襄陽市某白酒廠。

基因組提取試劑盒：德國QIAGEN公司；引物ITS3F/ITS4R：武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTPs）混合物、5×FastPfu Buffer、FastPfu Fly DNA Polymerase（5 U/μL）：寶生物工程大連有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ND-2000C微量紫外分光光度計(jì)：美國Nano Drop公司；R930機(jī)架式服務(wù)器：美國DELL公司；DYY-12電泳儀：北京六一儀器廠；Fluor Chem FC3型化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)：美國ProteinSimple公司；PE300高通量測序平臺(tái)：美國Illumina公司；CR21N高速冷凍離心機(jī)：日本HITACHI公司；Veriti 96孔梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品采集

2020年10月于湖北省襄陽市某酒廠采集高溫大曲和中高溫大曲各6份，編號(hào)分別為G1～G6（高溫大曲）和Z1～Z6（中高溫大曲），所有大曲均在制曲車間踩制而成，其中高溫大曲均為黃色大曲。將整塊大曲使用粉碎機(jī)分別粉碎后，取50 g左右裝入無菌采樣管備用。

1.3.2 高溫大曲與中高溫大曲制作工藝流程

高溫大曲的制備：首先將小麥進(jìn)行粉碎，加入上一輪8%的大曲曲母和40%的水進(jìn)行物料混合填充到磚型模具中（37 cm×18 cm×7 cm），按“四邊多踩中間少踩”的原則進(jìn)行人工踩制（龜背狀，中間厚度≤10 cm），放置陰干1 h；然后將曲塊移入發(fā)酵室，逐層堆疊每層間隔覆蓋上稻草（新老稻草混合）并撒上1.0%的水，溫度達(dá)到65 ℃時(shí)進(jìn)行第一次翻曲，達(dá)到55 ℃時(shí)進(jìn)行第二次翻曲，使其均勻發(fā)酵。高溫大曲發(fā)酵40 d后進(jìn)行拆曲，貯存180 d后將進(jìn)行磨曲（曲粉粒徑＜3 mm），得到高溫大曲。

中高溫大曲制備：首先進(jìn)行原料的清洗與除雜，小麥粉碎加上38%的水然后混合填充到磚型模具中（37 cm×18 cm×7 cm），放置陰干30 min；然后將曲塊移入曲房，曲塊呈井字形排列，中間用竹片隔開，兩層覆蓋一層稻草與少量曲粉，溫度達(dá)到42 ℃時(shí)進(jìn)行第一次翻曲然后每隔2～3 d翻一次曲，發(fā)酵30 d后進(jìn)行庫存。此外，高溫大曲潤糧時(shí)間不得超過24 h，中高溫大曲只需30 min；入庫發(fā)酵時(shí)，高溫大曲堆積時(shí)墻邊豎立稻草，地面鋪上曲草，曲塊間隔2～3 cm，間隙放曲草隔離，每層曲塊間鋪上曲草然后直接關(guān)閉發(fā)酵室門窗，而中高溫大曲只需地面撒一層谷殼，曲塊間隔1～2 cm，無隔離物，每層曲塊間安放竹片2～3片撒上少量曲粉，待曲塊升溫至42～45 ℃時(shí)才關(guān)閉門窗；第一次翻曲溫度42 ℃，遵循“前緩、中挺、后緩落”的原則[16]。

1.3.3 樣品微生物宏基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增及高通量測序

稱取1.0 g大曲樣品，使用試劑盒進(jìn)行微生物脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取，以合格的DNA為模板，ITS3F（5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'）和ITS4R（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）為引物對(duì)真菌ITS2區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[7]。PCR擴(kuò)增體系和程序參照陳怡等[8]的方法，擴(kuò)增合格的產(chǎn)物寄至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行高通量測序。

1.3.4 生物信息學(xué)分析

序列下機(jī)后，遵循重疊區(qū)≥10 bp；最大錯(cuò)配比率≤0.2；條形碼無錯(cuò)配；引物串行錯(cuò)配數(shù)≤2 bp的方法對(duì)序列進(jìn)行質(zhì)控[9]。利用QIIME（v1.9.1）分析平臺(tái)[10]，首先使用PyNAST軟件[11]對(duì)序列進(jìn)行對(duì)齊，之后使用兩步UCLUST法在100%和97%的相似度下進(jìn)行序列劃分[12]，構(gòu)建分類操作單元（operational taxonomic units，OTU）矩陣，最后從每個(gè)OTU中挑選一條代表性序列使用UNITE數(shù)據(jù)庫[13]對(duì)齊進(jìn)行同源性比對(duì)，進(jìn)而明確其分類學(xué)地位。以測序深度最小的樣品序列數(shù)為基準(zhǔn)進(jìn)行序列的抽平，對(duì)不同樣品的香農(nóng)指數(shù)和發(fā)現(xiàn)物種數(shù)等α多樣性指標(biāo)進(jìn)行計(jì)算，同時(shí)基于UniFrac距離[14]使用主坐標(biāo)分析（principal coordinates analysis，PCoA）和加權(quán)組平均法（weighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）聚類對(duì)兩類大曲的真菌類群進(jìn)行β多樣性解析，使用線性判別分析效應(yīng)量（linear discriminant analysis Effect Size，LEfSe）對(duì)關(guān)鍵真菌類群進(jìn)行甄別[15]。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

使用R軟件（v4.0.2）的Ggplot2和Reshape2軟件包繪制氣泡圖，使用Statnet和Circlize軟件包繪制炫狀圖，使用Excel 2016繪制瀑布圖，使用Origin 8.0繪制其他圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 α多樣性分析

納入本研究的12 個(gè)酒曲樣品經(jīng)質(zhì)控后得到497 311條高質(zhì)量的序列，平均每個(gè)樣品41 442條，其中最大測序深度為50 010條，最小測序深度為29 010條。按100%和97%相似度劃分后，高溫大曲6 個(gè)樣品中OTU的數(shù)量分別為552個(gè)、491個(gè)、440個(gè)、343個(gè)、427個(gè)和649個(gè)，中高溫大曲的分別為520個(gè)、363個(gè)、436個(gè)、576個(gè)、522個(gè)和326個(gè)。使用箱型圖對(duì)兩類大曲的α多樣性進(jìn)行比較分析，結(jié)果見圖1。

圖1 香農(nóng)指數(shù)（A）和物種數(shù)（B）的箱型圖Fig.1 Boxplots of Shannon index (A) and number of species (B)

由圖1可知，當(dāng)測序深度為29 010 時(shí)，高溫大曲各樣品的香農(nóng)指數(shù)分別為4.33、4.43、3.29、2.92、3.92和4.69，發(fā)現(xiàn)物種數(shù)為489、422、383、334、415和558；中高溫大曲各樣品的香農(nóng)指數(shù)分別為4.00、4.19、3.49、4.31、4.37和1.96，發(fā)現(xiàn)物種數(shù)為447、307、401、494、512和325。經(jīng)Mann-Whitney檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，兩種大曲真菌類群的香農(nóng)指數(shù)和發(fā)現(xiàn)物種數(shù)均差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 基于門和屬分類學(xué)地位的真菌類群分析

本研究將平均相對(duì)含量＞1.00%的真菌門或?qū)俣x為優(yōu)勢門或?qū)?，將不能鑒定到門或者屬水平的序列歸并為“unclassified”，將其他＜1.00%的門或?qū)偾蠛秃髿w并為“others”[17]?；陂T和屬水平的高溫大曲和中高溫大曲真菌多樣性比較分析結(jié)果見圖2。

圖2 基于門（A）和屬（B）水平高溫大曲和中高溫大曲真菌類群的比較分析Fig.2 Comparative analysis of fungal groups of high-temperature Daqu and medium-high-temperature Daqu at phylum (A)and genus (B) level

本研究中的所有序列可鑒定真菌類群為5 個(gè)門和45 個(gè)屬，其中優(yōu)勢門有3 個(gè)，優(yōu)勢屬有7 個(gè)。由圖2A可知，高溫大曲的優(yōu)勢真菌門為子囊菌門（Ascomycota）（99.68%）；中高溫大曲的優(yōu)勢真菌門為子囊菌門（Ascomycota）（91.73%）、毛霉門（Mucoromycota）（4.32%）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）（3.26%）。經(jīng)Mann-Whitney檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，毛霉門（Mucoromycota）在兩類大曲中的差異顯著（P＜0.05）。

由圖2B可知，高溫大曲的優(yōu)勢真菌屬分別為嗜熱真菌屬（Thermomyces）（57.43%）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）（30.73%）和曲霉菌屬（Aspergillus）（7.98%）；中高溫大曲的優(yōu)勢真菌屬分別為嗜熱真菌屬（Thermomyces）（48.05%）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）（17.72%）、曲霉菌屬（Aspergillus）（14.56%）、Rasamsonia（4.38%）、毛孢子菌屬（Trichosporon）（3.08%）、根霉菌屬（Rhizopus）（2.45%）和雙足囊菌屬（Dipodascus）（2.36%）。經(jīng)Mann-Whitney檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，兩類大曲樣品中毛孢子菌屬（Trichosporon）、根霉菌屬（Rhizopus）、雙足囊菌屬（Dipodascus）和Rasamsonia含量差異顯著（P＜0.05），其在中高溫大曲中的平均相對(duì)含量分別為3.08%、2.45%、2.36%和4.38%，而在高溫大曲中幾乎不存在。由此可見，高溫大曲和中高溫大曲的真菌類群存在較大的差異，可能是由于制作過程中工藝差異造成的[18]。國內(nèi)科研人員亦對(duì)高溫大曲中的微生物菌株進(jìn)行了分離鑒定，潘菲等[19]從江西特香型大曲中分離篩選出了一株糖化力高且可提高出酒率的黑曲霉（Aspergillus niger）NCUF413.1。李紹亮等[20]從宋河高溫大曲中發(fā)現(xiàn)了10株能產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶和酯化酶的功能霉菌，分別鑒定為青霉屬（Penicillium）、曲霉菌屬（Aspergillus）、毛霉屬（Mucor）和鏈格孢屬（Alernaria）。

2.3 基于OTU水平真菌類群分析

本研究經(jīng)兩步UCLUST劃分共得到了1 197 個(gè)OTU，若某一OTU在所有樣品中均存在則定義為核心OTU。基于OTU水平的兩類大曲真菌核心類群見圖3。由圖3可知，本研究中核心OTU共有117 個(gè)，其中平均相對(duì)含量＞1.00%的核心OTU共有5 個(gè)。

圖3 基于OTU水平的兩類大曲真菌核心類群Fig.3 Core fungal groups in two types of Daqu based on OTUs level

由圖3可知，平均相對(duì)含量大于1.00%的核心OTU包含的序列數(shù)占總序列數(shù)的64.21%，但OTU僅占總OTU數(shù)的0.42%。OTU2434和OTU2162被鑒定為嗜熱真菌屬（Thermomyces），累計(jì)平均相對(duì)含量為42.52%；OTU2433被鑒定為嗜熱子囊菌屬（Thermoascus），平均相對(duì)含量為14.37%；OTU2223和OTU539被鑒定為曲霉菌屬（Aspergillus），累計(jì)平均相對(duì)含量為7.33%。這也進(jìn)一步說明，嗜熱真菌屬（Thermomyces）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）和曲霉菌屬（Aspergillus）為高溫大曲和中高溫大曲中的核心菌群。

本研究發(fā)現(xiàn)有3個(gè)OTU僅存在于高溫大曲6個(gè)樣品中，而在中高溫大曲中均不存在，且其包含的序列數(shù)僅占總序列數(shù)的0.002%，鑒定為隸屬于散囊菌目（Eurotiales）的分類單元。值得一提的是，沒有發(fā)現(xiàn)OTU僅存在于中高溫大曲中。

2.4 β多樣性分析

進(jìn)一步采用基于UniFrac距離的PCoA和UPGMA聚類對(duì)兩類大曲真菌類群的β多樣性進(jìn)行了分析，結(jié)果見圖4。

圖4 基于主坐標(biāo)分析（A）和聚類分析（B）的兩類大曲真菌類群β多樣性分析Fig.4 Analysis of β-diversity of fungal groups in two types of Daqu based on principal coordinate analysis (A) and cluster analysis (B)

由圖4A可知，在主坐標(biāo)分析中第一主成分方差貢獻(xiàn)率為37.20%，第二主成分方差貢獻(xiàn)率為14.13%，兩類大曲在空間上的排布呈現(xiàn)出明顯的分離趨勢。由圖4B可知，兩類大曲樣品亦呈現(xiàn)出明顯的分離趨勢，其中高溫大曲樣品G1、G2、G3和G6形成一個(gè)聚類，高溫大曲樣品G4和中高溫大曲樣品Z6形成一個(gè)聚類，中高溫大曲樣品Z1、Z3和Z5形成一個(gè)聚類，高溫樣品G5、中高溫樣品Z4和Z2無法和其他樣品形成聚類。由此可見，雖然一些真菌類群在兩類大曲中均存在，但兩類大曲亦具有各自較為獨(dú)特的真菌類群。由圖5A亦可知，高溫大曲樣品分布較為分散，而中高溫大曲整體分布較為集中。由圖4B亦可知，高溫大曲樣品分支長度整體小于中高溫大曲樣品各分支，同時(shí)高溫大曲樣品G4和中高溫大曲樣品Z6在一個(gè)分支上，這與圖2B結(jié)果一致，說明中高溫大曲Z6和高溫大曲的真菌類群較為相似；而中高溫大曲樣品Z4和Z2的分支相對(duì)較長，這說明這2 個(gè)樣品真菌類群與其他樣品存在較大差異。

2.5 關(guān)鍵真菌類群甄別

為進(jìn)一步探究導(dǎo)致兩類大曲真菌群落結(jié)構(gòu)存在差異的類群，采用LEfSe分析對(duì)以LDA得分取對(duì)數(shù)（log10）之后相對(duì)值＞2.5的分類單元進(jìn)行了甄別，結(jié)果見圖5。

圖5 基于LEfSe分析兩類大曲關(guān)鍵真菌類群的甄別Fig.5 Identification of key fungal groups in two types of Daqu based on LEfSe analysis

由圖5可知，導(dǎo)致兩類大曲真菌群落結(jié)構(gòu)存在差異的菌群主要為隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota）的絲孢酵母綱（Trichosporonales）和絲孢酵母科（Trichosporonaceae）真菌以及隸屬于子囊菌門（Ascomycota）的嗜熱真菌屬（Thermomyces）和糞殼菌綱（Sordariomycetes）真菌，各類群在兩類大曲中的平均相含量見圖6。

圖6 基于關(guān)鍵真菌類群中兩類大曲真菌類群的比較分析Fig.6 Comparative analysis of fungal groups in two types of Daqu based on key fungal groups

由圖6可知，關(guān)鍵真菌類群絲孢酵母綱（Trichosporonales）和絲孢酵母科（Trichosporonaceae）在中高溫大曲中的平均相對(duì)含量為0.09%和3.16%，而在高溫大曲中幾乎不存在；Sordariomycetes在高溫和中高溫大曲中的平均相對(duì)含量分別為0.49%和0.37%；糞殼菌綱（Sordariomycetes）在高溫和中高溫大曲中的平均相對(duì)含量分別為55.19%和47.73%。

3 結(jié)論

襄陽地區(qū)高溫大曲真菌類群主要以嗜熱真菌屬（Thermomyces）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）和曲霉菌屬（Aspergillus）為主；中高溫大曲真菌類群主要以嗜熱真菌屬（Thermomyces）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、曲霉菌屬（Aspergillus）、Rasamsoni、毛孢子菌屬（Trichosporon）、根霉屬（Rhizopus）和雙足囊菌屬（Dipodascus）為主。雖然一些真菌類群在兩類大曲中均存在，但兩類大曲亦具有各自較為獨(dú)特的真菌類群，且導(dǎo)致兩類大曲真菌群落結(jié)構(gòu)存在差異的類群為嗜熱真菌屬（Thermomyces）。