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基于UPLC-QqQ-MS/MS同步檢測熱加工食品中典型晚期糖基化終末產物

2021-06-04 02:17程威威張忠飛劉國琴鄭家榮
食品科學 2021年10期
關鍵詞:熱加工質譜基質

程威威,王 霞,張忠飛,劉國琴,陳 峰,鄭家榮,*

(1.深圳大學高等研究院,深圳食品產業(yè)創(chuàng)新發(fā)展研究院,深圳市海洋微生物組工程重點實驗室,廣東 深圳 518060;2.華南理工大學食品科學與工程學院,廣東 廣州 510640)

晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products,AGEs)是食品加工過程中伴生化學危害物,主要是還原糖與蛋白質的自由氨基或與游離氨基酸經美拉德反應等途徑形成的一系列穩(wěn)定聚合產物的總稱,其中羧甲基賴氨酸(Nε-carboxymethyllysine,CML)和羧乙基賴氨酸(Nε-carboxyethyllysine,CEL)是2 個典型的AGEs,其含量常被用作食品中AGEs生成的指標[1-6]。食源性AGEs能夠進入人體血液循環(huán),與人體內氧化應激和炎癥的發(fā)生密切相關,這也是導致一系列慢性疾病發(fā)生及加重的關鍵因素,包括糖尿病并發(fā)癥、神經退行性疾病和心血管疾病等[7-10]。因此,近年來針對食品中AGEs的研究越來越受到關注和重視。

富含碳水化合物、脂肪和蛋白質的食品在熱加工過程中容易產生AGEs,如烘焙食品和煎炸食品[11-14],是膳食中公認的AGEs的重要來源[15]。近年來,研究者發(fā)現(xiàn)嬰兒食品如配方奶粉中也存在一定量的AGEs[16-18]。目前,我國尚未制定食品中AGEs檢測方法的國家標準,也無食品中AGEs的限量標準。原因可能是食品基質組分復雜,且差異較大,導致存在不同的基質效應,難以建立統(tǒng)一有效的前處理和定量方法,這不利于不同類型食品中AGEs的含量比較。

建立不同食品中高效、準確、低成本的AGEs檢測以及鑒定的通用方法,是工業(yè)抑制食品生產加工中AGEs生成的重要基礎。目前,已報道的食品中CML和CEL同步檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法、高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法、氣相色譜-質譜(gas chromatography-mass spectrometry,GCMS)法和高效液相色譜-質譜(high performance liquid chromatography-mass spectrometry,HPLC-MS)法[19-24]。ELISA法需要特定的抗體,并且樣品的基質效應對方法靈敏度的影響很大,故可能導致較大的誤差。HPLC和GC-MS法通常需要柱前衍生化,可操作性差且檢測靈敏度較低。HPLC-MS法具有操作簡單,可重復性和穩(wěn)定性高的優(yōu)點,故通常用于測定CML和CEL含量。

超高效液相色譜(ultra-high performance liquid chromatography,UPLC)技術是在HPLC基礎上,涵蓋了小顆粒填料、非常低系統(tǒng)體積(死體積)及快速檢測手段等全新技術,增加了分析的通量、靈敏度及色譜峰容量,故分離度更好,檢測速度快,消耗溶劑少。三重四極桿質譜在保留四極桿質譜原有定量能力強的特點上,提供了串級功能,加強了質譜的定性能力,信噪比更優(yōu)。目前超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜(ultrahigh performance liquid chromatography-triple quadrupoletandem mass spectrometry,UPLC-QqQ-MS/MS)技術已應用于食品中組分和外源物含量分析[25-27],但其對食品中CML和CEL的檢測鮮有報道。因此,本研究旨在基于UPLC-QqQ-MS/MS技術,建立適用于不同熱加工食品中CML和CEL含量同步檢測的通用方法,并進行方法學評價,為食品中CML和CEL測定方法的國家標準制定提供數(shù)據基礎和方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白蓮蓉月餅、雞仔餅、曲奇、杏仁餅、老婆餅、面包、嬰兒餅干、嬰兒肉松、嬰兒米餅、方便面、油條均購自深圳市內各大型超市,雞米花、薯條購自某快餐連鎖品牌店。

CML標準品(純度≥98%)、CEL標準品(純度≥98%) 加拿大TRC公司;硼氫化鈉(純度≥98%) 廣東西隴科學股份有限公司;四硼酸鈉·十水合物(純度≥99.9%)、鹽酸、正己烷、氯仿、乙腈、甲醇、氨水、氫氧化鈉(均為分析純) 上海麥克林生化科技有限公司;乙酸銨、甲酸(均為色譜純)上海賽默飛世爾科技有限公司;乙腈(色譜純) 德國Merck公司。

1.2 儀器與設備

ACQUITY UPLC H-Class/Xevo TQ-XS超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜(配有電噴霧離子源、色譜工作站和溫控柱溫箱)、Oasis MCX固相萃取柱(3 mL/60 mg)、ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm) 美國Waters公司;Heraeus Multifuge XIR型高性能通用臺式離心機 美國Thermo Fisher公司;Scientz-10N型冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司;Milli-Q IQ7005超純水純化系統(tǒng) 美國Millipore公司;QUINTIX65-1CN型分析天平 德國Startorius公司;WD-12型水浴氮吹儀 杭州奧盛儀器有限公司;Vortex-Genie2型渦旋混合器 美國Scientific Industries公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

分別精確稱量10.0 mg CML和CEL分別溶于10 mL超純水中,配制質量濃度為1.00 mg/mL的CML和CEL標準儲備液,置于-20 ℃保存。將標準儲備液按一定比例稀釋,配制質量濃度為1.00 μg/mL的CML和CEL混合標準溶液工作液,置于-4 ℃密封保存。制作標準曲線時,將工作液按比例稀釋,配制質量濃度分別為0.100、0.250、0.500、2.00、10.0、25.0、50.0、100、200、500 ng/mL的CML和CEL混合標準系列溶液?;|標準工作溶液:根據樣品類型選取適合的空白基質,向空白基質樣品中分別添加上述已配制的系列混合標準溶液,進行前處理,得到0.100~500 ng/mL的基質標準系列溶液,然后吸取部分轉入液相色譜進樣瓶。

1.3.2 樣品前處理

樣品冷凍干燥后用料理機研碎,置于-20 ℃保存。準確稱量0.500 g樣品粉末于50 mL離心管中。向樣品中加入5 mL正己烷,振蕩3 min混勻后,8 000 r/min離心6 min,棄去溶劑,重復以上脫脂步驟1 次后,45 ℃氮吹干至樣品恢復粉末狀。向樣品中加入5 mL硼酸鹽緩沖液(0.2 mol/L,pH 9.2)和2.5 mL硼氫化鈉溶液(1 mol/L溶于0.1 mol/L NaOH溶液),在4 ℃冰箱中還原過夜。然后向還原液中加入4 mL氯仿-甲醇(2∶1,V/V)混勻,5 000 r/min離心10 min后,棄去上清液,轉移沉淀至消解管中,用氮氣室溫吹掃1 min,加入5 mL 6 mol/L的鹽酸,110 ℃水解24 h。水解液冷卻至室溫,用定性濾紙過濾后,純水定容至25 mL,吸取2 mL濾液,冷凍干燥,再用2 mL純水復溶。

分別用3 mL甲醇和3 mL水活化Waters Oasis MCX固相萃取小柱(3 mL/60 mg),取1 mL上述溶液作為上樣液,再用3 mL水,3 mL甲醇淋洗,最后用5 mL氨化甲醇(5∶95,V/V)洗脫。將洗脫液在50 ℃氮吹干,復溶于400 μL 2%乙腈溶液中,取50 μL稀釋至1 mL,在13 000 r/min離心6 min后,上清液供UPLC-QqQ-MS/MS測試。

1.3.3 UPLC條件

采用ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)。流動相A為乙腈,流動相B為水(含0.1%甲酸和1 mmol/L乙酸銨),梯度洗脫程序如表1所示。流速0.1 mL/min,進樣量1.0 μL,柱溫30 ℃。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.3.4 MS條件

電噴霧離子源,正離子模式;載氣:高純氦(純度≥99.999%);毛細管電壓3.5 kV;脫溶劑溫度400 ℃;脫溶劑氣流量600 L/h;錐孔氣流量150 L/h;離子源溫度120 ℃;碰撞氣流量0.17 mL/min;多反應監(jiān)測模式。

CML:定量離子:m/z205>84,錐孔電壓38 V,碰撞能量16 eV;定性離子:m/z205>130,錐孔電壓38 V,碰撞能量10 eV;

CEL:定量離子:m/z219>84,錐孔電壓24 V,碰撞能量20 eV;定性離子:m/z219>130,錐孔電壓24 V,碰撞能量12 eV。

1.4 數(shù)據統(tǒng)計

每個實驗平行測定至少3 次,采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據進行統(tǒng)計學分析,結果以表示,由Origin 2019軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理條件優(yōu)化

CML和CEL分析的樣品預處理是基于硼氫化鈉還原-酸水解蛋白-固相萃取法進行。硼氫化鈉還原步驟的目的是防止樣品酸處理過程中Amadori產物生成新的CML和CEL,導致樣品中CML和CEL檢測含量高于真實值[28]。因此首先對脫脂樣品進行硼氫化鈉(1 mol/L溶于0.1 mol/L NaOH溶液)過夜還原處理,然后用氯仿-甲醇混合溶劑沉淀蛋白,棄去上清液,對蛋白沉淀物進行酸水解,最后利用SPE柱對水解液進行分離純化,通過比較回收率得到最佳的SPE柱為Waters Oasis MCX SPE前處理小柱(3 mL/60 mg)。經優(yōu)化后最終確定的樣品前處理條件見1.3.2節(jié)。

2.2 儀器條件的優(yōu)化

CML和CEL極性較強,很難在普通的反相色譜柱上進行保留。前期的報道多采用C18反相硅膠柱對CML和CEL進行分離,以九氟戊酸為洗脫液。然而,九氟戊酸能使流動相的pH值偏低(<2.0),導致色譜柱的損傷[29]。為了避免九氟戊酸的使用,本研究選擇極性修飾十八烷基硅烷健合硅膠色譜柱(Waters ACQUITY HSS T3)對樣品中CML和CEL進行分離,并優(yōu)化UPLC條件。

在多反應監(jiān)測模式下對CML和CEL的質譜條件進行優(yōu)化。采用電噴霧正離子模式對CML和CEL混合標準溶液進行掃描,得到一級全掃描質譜圖,以兩者的分子離子峰[M+H]+理論精確質量數(shù)提取色譜圖,如圖1所示。優(yōu)化后的Q-MS/MS條件見1.3.4節(jié)。

圖1 混合標準溶液中CML(A)和CEL(B)的提取離子流色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of CML (A) and CEL in a mixed standard solution (B)

2.3 方法學評價

2.3.1 基質效應

基質效應是指樣品中除目標物以外的其他內源性物質與目標物共洗脫出的樣品基質對目標物的離子化過程產生影響,造成離子化增強或抑制,從而影響檢測結果的可靠性和準確性[30]。熱加工食品樣品基質較為復雜,雖然UPLC-QqQ-MS/MS的抗干擾能力較強,但基質效應仍然存在,因此,需要對基質效應進行評價,本研究選取曲奇、嬰兒肉松和薯條分別為烘焙類食品、嬰兒食品和煎炸食品的代表,將CML和CEL標準品分別用乙腈和3 種食品基質提取液配制標準溶液(0.250~500 ng/mL),以相同物質在食品基質溶液中標準曲線斜率與純溶劑中標準曲線斜率的百分比值評價基質效應情況,結果如表2所示?;|效應大于100%時,表明基質使目標物離子化增強;基質效應小于100%時,表明基質使目標物離子化減弱。結果表明,CML和CEL在不同食品基質中均存在明顯的離子抑制現(xiàn)象,且同一物質在不同食品中基質效應差異較小。由于基質效應的存在,本方法在定量時采用空白基質配標,以降低基質效應的影響。

表2 CML和CEL在不同食品中的基質效應Table 2 Metrix effects of different foods for CML and CEL determination

2.3.2 方法檢出限、定量限和線性范圍結果

配制不同質量濃度(0.250~500 ng/mL)的CML和CEL混合標準系列溶液,以標準樣品質量濃度為橫坐標(x,ng/mL),定量離子對的信號響應峰面積為縱坐標(y),繪制標準曲線。在空白基質樣品中添加CML和CEL標準溶液,分別以信噪比RSN=3和RSN=10對應的質量濃度確定方法的檢出限和定量限,結果如表3所示。CML和CEL的檢出限和定量限均分別低于朱玉潔[31]報道的UPLC-MS/MS方法(15.0 ng/g和45.0 ng/g)和Lin Qin等[32]報道的UPLC-Q-TOF/MS法(100 ng/g和300 ng/g),CML和CEL在0.25~500 ng/mL范圍內,具有良好的線性關系(R2>0.999)。

表3 CML和CEL的線性方程、相關系數(shù)R2、方法檢出限、定量限與線性范圍Table 3 Linear equations, correlation coefficients, limits of detection and limits of quantification of CML and CEL

2.3.3 加標回收率和精密度結果

為了評估該方法的準確性,以油條為熱加工食品中的代表,用作基質樣品,分別添加3 個水平(低、中、高)CML和CEL標準溶液,以基質樣品為基準計算回收率。根據油條樣品中CML和CEL含量(10.64 μg/g和2.17 μg/g,干基),加標量(以干基計)分別選取為CML:5、10、20 μg/g,CEL:1、2、4 μg/g。對加標樣品平行測定6 次,連續(xù)測量3 d,得到儀器日內和日間精密度,結果如表4所示。此方法測定CML和CEL的回收率分別為96%~103%和94%~107%,日內精密度分別為1.48%~2.02%和1.23%~1.66%,日間精密度分別為1.52%~2.43%和1.41%~1.84%。數(shù)據表明此方法用于定量分析典型AGEs具有較高的準確性和穩(wěn)定性,能夠較可靠地測定油條樣品中CML和CEL含量。

表4 CML和CEL的加標回收率與相對標準偏差(n=6)Table 4 Recoveries and relative standard deviations of CML and CEL in spiked samples (n= 6)

2.4 市售熱加工食品樣品分析評價

采集市場上的13 種烘焙類食品、嬰兒食品和油炸類食品樣品經過前處理后,用已建立的UPLC-QqQMS/MS法進行含量測定,如表5所示。從測定結果看,除嬰兒米餅(26.49 μg/g)外,嬰兒肉松和嬰兒餅干中CML含量(232.90 μg/g和155.46 μg/g)顯著高于烘焙食品(15.33~68.67 μg/g)和油炸食品(6.97~19.73 μg/g)(P<0.05)。烘焙類食品包括餅干、曲奇、面包等的CML平均含量(36.36 μg/g)高于油炸類食品(12.78 μg/g)包括方便面、雞米花、薯條、油條等,這可能與烘焙溫度(>200 ℃)高于煎炸溫度(~180 ℃)有關。嬰兒肉松中CEL含量(108.90 μg/g)明顯高于其他食品,是其他食品的5.82~45.56 倍。另外,同一種食品中CEL含量低于CML含量,這與Troise等[33]的結果一致。嬰兒食品的安全性關系到嬰兒的健康發(fā)育和成長,是人們最關注的食品安全問題之一。因此,針對嬰兒食品尤其是嬰兒肉松中CML和CEL含量較高的現(xiàn)象,探討嬰兒食品體系中CML和CEL的生成規(guī)律和抑制策略是后續(xù)研究的重點工作之一。

表5 市售13 種烘焙食品、嬰兒食品和煎炸食品中CML和CEL含量Table 5 CML and CEL contents in baked foods, baby foods, and fried foods determined by the proposed method

3 結 論

本研究通過對不同熱加工食品脫脂、還原、蛋白沉淀、酸水解和固相萃取等前處理條件以及色譜-質譜分析條件的選擇和優(yōu)化,基于基質匹配外標法定量,建立UPLC-QqQ-MS/MS對熱加工食品中CML和CEL的同步檢測方法。該方法可操作性強,分析時間短,檢測成本低,基質干擾小,檢出限低,回收率高,且具有良好的分離效果,可適用于不同熱加工食品樣品中CML和CEL的測定分析。

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