李三木,孫翔翔,孔子榮,何奇松,馬 琳,馮淑萍,楊可妍,曾詠芳,熊 毅,顏健華

H9N2亞型流感病毒屬于A型流感病毒，正粘病毒科，基因組分8個(gè)節(jié)段編碼約11種蛋白。H9N2亞型流感病毒首次分離是1966年從意大利的火雞身上分離出毒株A/Turkey/Wisconsin/1/16[1]，國(guó)內(nèi)在1994年于廣東省的雞群中第一次分離到該亞型[2]。雖然H9N2亞型流感病毒具有低致病性的特點(diǎn)[3-4]，但其宿主范圍廣，不僅能夠侵染禽類、野鳥，還能感染包括豬在內(nèi)的哺乳動(dòng)物。相對(duì)其他亞型病毒，更容易跨物種在人群中傳播[5-6]。流行病學(xué)和病毒學(xué)證據(jù)表明，目前從人身上分離的H9N2病毒都來自禽類，沒有發(fā)現(xiàn)人傳人的病例，并且在基因上與當(dāng)?shù)丶仪葜辛餍械腍9N2病毒相似[7-8]。

自然條件下犬不太容易感染上流感病毒，實(shí)驗(yàn)也沒有發(fā)現(xiàn)犬流感的流行[9]，既往有研究中發(fā)現(xiàn)，犬能被多種不同亞型的流感病毒所感染，包括H3N8[10]、H3N2[11]、H5N1[12]、H1N1[13]、H5N2[14]等，而且也有研究表明犬對(duì)H9N2亞型禽流感病毒易感，并且能夠形成種間傳播[15-16]，我國(guó)養(yǎng)犬人群基數(shù)很大，犬作為人類伴侶動(dòng)物能夠與人親密頻繁接觸，無疑增加了人感染H9N2流感病毒的風(fēng)險(xiǎn)[17]。對(duì)廣西犬只尤其是寵物犬中分離出的13株H9N2亞型流感病毒A/Canine/Guangxi/1～13/2011(H9N2)進(jìn)行分子生物學(xué)特性分析，了解分離病毒株的來源和遺傳特征，再通過關(guān)鍵位點(diǎn)分析，了解分離毒株的抗原性、耐藥性，并選取其中部分毒株進(jìn)行哺乳動(dòng)物致病性分析，為廣西犬源H9N2亞型流感病毒的防控提供科學(xué)依據(jù)。同時(shí)，對(duì)防控人獸共患病也具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料 A/Canine/Guangxi/1～13/2011(H9N2)(后文縮寫為Ca/GX/1～13)源自廣西各地動(dòng)物醫(yī)院以及飼養(yǎng)場(chǎng)采集的犬棉拭子。SPF雞胚購(gòu)自北京梅里亞維通有限公司。SPF BALB/c 雌性小鼠購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。病毒總RNA抽提試劑盒、dNTP、反轉(zhuǎn)錄酶(AMV)、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等購(gòu)自天跟生化科技(北京)有限公司。pMD18-T載體以及DH5α感受態(tài)細(xì)胞等購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2引物設(shè)計(jì)與合成 參照GenBank上H9N2的序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)8對(duì)引物擴(kuò)增H9N2亞型流感病毒基因組各片段。使用Uni12引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。所用引物均送TaKaRa公司合成。引物序列見表1。

表1 H9N2亞型流感病毒全基因組擴(kuò)增的引物

1.3核酸提取、PCR擴(kuò)增 病毒尿囊液RNA抽提，使用Uni12引物經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，接著PCR，退火溫度為56 ℃。反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

1.4目的條帶回收與克隆 DNA回收純化，將回收純化好的產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化，菌液涂布到LB固體瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，挑斑擴(kuò)培后進(jìn)行菌液PCR鑒定，抽提陽性質(zhì)粒送大連TaKaRa公司測(cè)序。

1.5病毒基因組測(cè)序及分析 利用DNAStar進(jìn)行序列拼接然后與參考毒株進(jìn)行同源性比對(duì)，MEGA 6.0繪制毒株遺傳進(jìn)化樹并分析相關(guān)功能位點(diǎn)。

1.6雞胚半數(shù)感染量EID50的測(cè)定 根據(jù)對(duì)分離毒株的序列分析，選取A/Canine/Guangxi/1/2011(H9N2)、A/Canine/Guangxi/4/2011(H9N2)、A/Canine/Guangxi/8/2011(H9N2)和A/Canine/Guangxi/10/2011(H9N2)進(jìn)行病毒感染實(shí)驗(yàn)，毒株Ca/GX/1和Ca/GX/4自健康犬中分離得到，毒株Ca/GX/8和Ca/GX/10源自流感癥狀的犬只。經(jīng)尿囊腔接種10日齡的SPF雞胚，純化3代，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算病毒的雞胚半數(shù)感染量。

1.7小鼠的致病性實(shí)驗(yàn) 將6周齡的雌性SPF BALB/c隨機(jī)分成5組，每組8只。按照106EID50/50 μL的濃度攻毒小鼠，攻毒第3 d，采集3只，其腦、鼻甲、脾、腎、肺用于病毒滴定和組織切片，并觀察剩余小鼠至14 d。同時(shí)進(jìn)行小鼠的傳代實(shí)驗(yàn)，研究H9N2病毒分離株對(duì)哺乳動(dòng)物的適應(yīng)能力及其與宿主轉(zhuǎn)換事件相關(guān)的突變，觀察病毒致病性的變化。體重變化率(%)=[(感染后平均體重-感染前平均體重)/感染前平均體重]×100%+100%。動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)均在廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室開展，符合生物安全條件。

2 結(jié) 果

2.1病毒全基因組的核苷酸同源性及遺傳進(jìn)化分析 13個(gè)毒株基因片段的核苷酸同源性為PB1: 99.8%～100%、HA: 99.9%～100%、NA: 99.7%～100%，PB2、PA、NP、M、NS同源性均為100%。HA、NS遺傳進(jìn)化與A/Chicken/Beijing/1/94在同一個(gè)分支，屬于BJ-like譜系。NA與A/Chicken/HongKong/G9/97在同一個(gè)分支，屬于G9-like譜系。M與A/Quail/HongKong/G1/97在同一個(gè)分支，屬于G1-like譜系。NP、PA、PB1基因與A/Chicken/Shanghai/F/98在同一個(gè)分支，屬于SHF98-like譜系。PB2在遺傳學(xué)上屬于一個(gè)新的分支，屬于DK/ST/163/2004-like譜系(圖1、圖2)。內(nèi)部基因M、NP、NS、PA、PB1和PB2通過遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)與2013年在上海、杭州等地從人身上分離到的H7N9毒株關(guān)系較近,其氨基酸同源性為M：98.4%～99.6%、NP：98.0%～98.2%、NS：92.9%～93.4%、PA：100%、PB1：100%、PB2：98.9%。

圖1 H9N2病毒株的HA基因遺傳進(jìn)化樹

圖2 H9N2病毒株的NA基因遺傳進(jìn)化樹

2.2HA氨基酸關(guān)鍵位點(diǎn)分析 通過氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)13株犬源H9N2流感病毒株的HA基因的氨基酸位點(diǎn)均相對(duì)保守，226位為亮氨酸(Leu)，具有與SAα-2，6-Gal特異性結(jié)合的能力，裂解位點(diǎn)為RSSR↓GLF，位于335和341位之間(表2)。糖基化位點(diǎn)和受體結(jié)合位點(diǎn)都較保守，除了313和551位的糖基化位點(diǎn)與參考毒株不一致?？乖砦怀?34位同參考毒株不同外其他都相對(duì)保守。HA基因共發(fā)生14個(gè)位點(diǎn)的突變，而315位突變可能導(dǎo)致一個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)的增加。

表2 H9N2流感病毒株HA受體結(jié)合相關(guān)氨基酸位點(diǎn)及連接肽序列

2.3NA氨基酸關(guān)鍵位點(diǎn)分析 對(duì)分離株NA基因進(jìn)行的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)其基質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)同參考毒株一致。抗原位點(diǎn)331位V、367位E、432位K的突變可能導(dǎo)致病毒在耐藥性上的差異。NA基因潛在的糖基化位點(diǎn)與參考毒株相比比較保守。紅細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)在367、399、432位點(diǎn)處有變動(dòng)與參考毒株不一致。

2.4其它氨基酸關(guān)鍵位點(diǎn)分析 分離株M1的氨基酸序列發(fā)生多個(gè)位點(diǎn)的突變，包括37(A)、46(I)、95(K)、140(A)、187(R)、219(V)、224(N)、242(N)和248(L)，這些位點(diǎn)的突變同2013年杭州分離的毒株A/Hangzhou/1/2013(H7N9)完全一致。M2基因第31位氨基酸位點(diǎn)發(fā)生了S到N的突變。其它內(nèi)部基因M、NP、NS、PA、PB1和PB2通過遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，13株毒株與2013年在上海、杭州等地暴發(fā)流感從人類身上分離得到的H7N9病毒株有較近的親緣關(guān)系。

2.5雞胚半數(shù)感染量EID50的測(cè)定 EID50通過Reed-Muench公式計(jì)算得出，4株H9N2病毒株的EID50結(jié)果如表3所示，從數(shù)據(jù)看出毒株A/Canine/Guangxi/4/2011(H9N2)在SPF雞胚上較其它毒株有略高的增殖滴度。

表3 廣西犬源H9N2亞型流感病毒EID50結(jié)果

2.6病毒對(duì)小鼠致病性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 從圖3可知對(duì)照組小鼠的體重在14 d內(nèi)持續(xù)增加，實(shí)驗(yàn)組也都呈增加趨勢(shì)，除Ca/GX/8組與對(duì)照組相比增加幅度相仿，其余增加幅度都較小。未出現(xiàn)小鼠死亡。

圖3 小鼠感染后體重變化率

感染3 d后，隨機(jī)剖殺3只小鼠，組織樣品勻漿處理，接種10日齡SPF雞胚進(jìn)行病毒滴度實(shí)驗(yàn)。4株病毒株攻毒的小鼠中脾臟、腦和腎臟中均無病毒，攻毒小鼠的肺臟和鼻甲骨中可以檢測(cè)到病毒，但同種亞型的不同毒株之間病毒的復(fù)制能力也表現(xiàn)出差異。Ca/GX/10株在肺臟組織和鼻甲骨中顯示病毒滴度，且小鼠體重變化最大，體重變化最小的Ca/GX/8株只在鼻甲骨中檢測(cè)到，而Ca/GX/1和Ca/GX/4未檢測(cè)到病毒(表4)。

表4 小鼠組織感染的病毒復(fù)制滴度(log10TCID50/mL)

對(duì)Ca/GX/10毒株感染的小鼠肺部組織樣品做組織切片，結(jié)果顯示與未感染的空白對(duì)照組相比，攻毒組小鼠肺組織有明顯的炎性細(xì)胞滲出和浸潤(rùn)，肺泡壁變厚，有多處的破裂，肺泡形狀受到不同程度的破壞，大小不一，形狀不規(guī)則，見圖4。

A為對(duì)照組；B為感染組

2.7病毒在小鼠中的傳代實(shí)驗(yàn)結(jié)果 選用Ca/GX/8病毒株感染小鼠，連續(xù)4次傳代的結(jié)果如圖5所示，第1次體重持續(xù)增加，第2次感染小鼠后觀察出現(xiàn)被毛凌亂，精神萎靡，食欲不振等癥狀，體重較第1次在3 d變緩。第3次感染小鼠后與第2次類似，臨床癥狀更加明顯，體重變化小。第4次感染后小鼠體重基本不增加，臨床癥狀明顯，出現(xiàn)畏冷、食欲不振、精神萎靡等。

圖5 小鼠感染后體重變化情況

經(jīng)過對(duì)4次傳代后的病毒基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)，Ca/GX/8毒株P(guān)B2基因611和623氨基酸位點(diǎn)發(fā)生突變，分別是611位天冬氨酸突變?yōu)樘於０贰?23位由谷氨酸E突變?yōu)橘嚢彼酜；其余基因沒有發(fā)生變化。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)所用13株H9N2流感病毒株都由采自廣西各地區(qū)的犬棉拭子中分離得到，表明廣西地區(qū)的犬只中普遍存在感染H9N2流感病毒的情況，這是世界范圍內(nèi)首次從犬只中分離得到H9N2亞型流感病毒，也表明了該亞型病毒的宿主范圍得到進(jìn)一步擴(kuò)大。H9N2病毒極易發(fā)生跨物種傳播，而犬類作為日常伴侶動(dòng)物能夠與人類親密接觸，增加了人類感染H9N2亞型流感病毒的風(fēng)險(xiǎn)。

HA基因源于禽類，為歐亞譜系的BJ-like亞系，基因序列和中國(guó)地區(qū)的H9N2亞型都與流行代表毒株A/chicken/Guangxi/55/2005(H9N2)有較近的關(guān)系。氨基酸分析表明HA基因的226位為亮氨酸(Leu)，具有與唾液酸受體SAα-2，6-Gal特異性結(jié)合的能力，表明分離得到的H9N2亞型流感病毒雖然來源于禽類，但特異性的結(jié)合受體已經(jīng)具備和人源受體特異性結(jié)合的能力，引起哺乳動(dòng)物的易感[18]。HA基因的裂解位點(diǎn)為RSSR↓GLF，位于335和341位之間。HA1和HA2由兩個(gè)堿性氨基酸連接，說明分離的毒株為低致病力毒株[19]。HA基因的糖基化位點(diǎn)和受體結(jié)合位點(diǎn)都較保守，只有313和551位的糖基化位點(diǎn)與參考毒株不一致。313-315位點(diǎn)位于裂解位點(diǎn)附近，這可能會(huì)通過干擾蛋白酶裂解而增強(qiáng)致病性[20]。本研究分離株受體結(jié)合位點(diǎn)191位為N、198位為A，與禽源毒株一致，因此可以推斷其屬于禽源。

NA基因?qū)儆跉W亞譜系G9-like亞系，典型的禽源特征。13株毒株的抗原位點(diǎn)在331、367、432位點(diǎn)表現(xiàn)與參考毒株不一致，可能導(dǎo)致耐藥性的差異。紅細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)在367、399、432位點(diǎn)處與參考毒株不一致，這些位點(diǎn)是NA基因主要抗原位點(diǎn)，神經(jīng)氨酸酶的唾液酸結(jié)合位點(diǎn)易受抗體陽性選擇從而進(jìn)化[21]，推測(cè)NA基因氨基酸的變化可能是病毒逃避疫苗作用導(dǎo)致。

M2基因第31位氨基酸位點(diǎn)發(fā)生了S到N的突變，此突變導(dǎo)致病毒產(chǎn)生對(duì)金剛烷胺類藥物的耐藥性[22]。M1基因發(fā)生了多個(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變，包括37(A)、46(I)、95(K)、140(A)、187(R)、219(V)、224(N)、242(N)和248(L)，這些突變都與毒株A/Hangzhou/1/2013(H7N9)一致，突變對(duì)病毒的影響需要進(jìn)一步的研究。其它內(nèi)部基因M、NP、NS、PA、PB1和PB2通過遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，13株毒株與2013年在上海、杭州等地自人流感病毒分離株H7N9有較近的親緣關(guān)系。病毒的致病性以及不同種間傳播機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

經(jīng)同源性和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，13株病毒株的8個(gè)基因片段來源于5個(gè)經(jīng)典毒株。不屬于已有基因型A-R的劃分[23]，而是一個(gè)新的基因型，屬于禽源歐亞譜系，這與華南地區(qū)的大部分禽源流感病毒一致。說明在華南地區(qū)，特別是廣西地區(qū)，基因型復(fù)雜，這可能是由于該地區(qū)混合飼養(yǎng)的模式，為病毒基因重組的發(fā)生提供了條件。

小鼠的致病性實(shí)驗(yàn)中，健康犬中分離得到的毒株Ca/GX/1和Ca/GX/4在小鼠體內(nèi)尚未有效復(fù)制，而源自流感癥狀的犬只的Ca/GX/8和Ca/GX/10發(fā)現(xiàn)可以在小鼠體內(nèi)發(fā)生復(fù)制，Ca/GX/10毒株甚至可以出現(xiàn)顯著的臨床癥狀如體重下降、精神不振、沒有食欲以及被毛凌亂等。組織切片也顯示出炎癥反應(yīng)造成的損傷。說明即使同種亞型的不同毒株在對(duì)宿主動(dòng)物的致病力方面也表現(xiàn)出不同。本實(shí)驗(yàn)中未出現(xiàn)小鼠死亡，對(duì)小鼠表現(xiàn)為低致病力，但不能排除其他重組毒株能夠?qū)е滤拗鲊?yán)重的損傷甚至死亡[24-26]。氨基酸位點(diǎn)分析，Ca/GX/8和Ca/GX/10完全一致，而Ca/GX/4同其他毒株相比氨基酸位點(diǎn)在PB2基因的296位發(fā)生了D到N的突變，Ca/GX/1則有多個(gè)位點(diǎn)的突變，HA152K→E，NA380I→T，M2的64S→A、66E→K，PB1的411M→L、422S→L、630P→L和PA210T→I，推測(cè)正是由于這些氨基酸位點(diǎn)的突變的綜合影響導(dǎo)致Ca/GX/1和Ca/GX/4對(duì)小鼠的致病性降低。流感病毒通過基因突變和重組實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境的適應(yīng)[27-28]，經(jīng)4次傳代后的病毒測(cè)序發(fā)現(xiàn)，Ca/GX/8毒株P(guān)B2基因611和623氨基酸位點(diǎn)發(fā)生突變，經(jīng)查閱暫無文獻(xiàn)報(bào)道這兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變有何影響，該突變對(duì)病毒致病性的影響還有待進(jìn)一步的研究。

利益沖突：無