李彩云，李 潔,2,3,*，嚴守雷,2,3，王清章,2,3

（1.華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，湖北 武漢 430070；2.環(huán)境食品學教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070；3.湖北省水生蔬菜保鮮加工工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430070）

水果和蔬菜在貯運、包裝或加工過程中受損后極易發(fā)生變色，這種現(xiàn)象被稱為酶促褐變[1]，一般發(fā)生在新鮮的活組織中，或者至少發(fā)生在含有活性酶的組織中。機械損傷后的褐變反應通常發(fā)生迅速且劇烈。酶促褐變極大地影響了果蔬外觀和風味，使營養(yǎng)物質(zhì)損失，降低了消費者的接受度，對食品生產(chǎn)商和食品加工業(yè)都產(chǎn)生重大的經(jīng)濟影響。據(jù)估計，熱帶和亞熱帶水果和蔬菜的損失超過50%是由酶促褐變造成的[2]。酶促褐變反應的 基本步驟是酚類化合物在酚酶催化下氧化成鄰醌類化合物，隨后醌類物質(zhì)經(jīng)過一系列氧化縮合聚合形成褐色產(chǎn)物，從而導致褐變發(fā)生。發(fā)生酶促褐變的3 個必要因素分別為酚類底物、氧氣、酶[3]。國內(nèi)外對食品褐變研究較多，但對于酶促褐變機理的研究比較零散，且不夠深入。本文整理歸納了國內(nèi)外圍繞褐變機理進行的多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和酚類底物的相關(guān)研究和報道，為酶促褐變機理的系統(tǒng)深入研究提供借鑒與參考。

1 PPO相關(guān)研究進展

1.1 PPO分類

PPO是酶促褐變反應的重要影響因素和必備條件，PPO是含有Cu2+的酶。國際生物化學和分子生物學聯(lián)合命名委員會提出，PPO包括3 種類型[4]：第一種是單酚單氧化酶，亦稱酪氨酸酶、單酚氧化酶、甲酚酶，這種酶能催化單羥基酚羥基化為鄰二羥基酚；第二種是雙酚氧化酶，亦稱兒茶酚氧化酶、o-雙酚酶，這種PPO能催化氧化鄰位酚，但不能氧化間位酚和對位酚；第三種是漆酶，該酶能氧化鄰位酚和對位酚，不能氧化一元酚和間位酚?，F(xiàn)在所說的PPO一般是雙酚氧化酶和漆酶的統(tǒng)稱[5]。

1.2 PPO催化位點

研究PPO的活性中心發(fā)現(xiàn)，銅離子存在于酶的活性中心，大多數(shù)PPO活性中心具有兩個富含組氨酸（His）殘基的Cu結(jié)合區(qū)域[6]。通過核磁共振等方法得到的數(shù)據(jù)顯示PPO活性中心每個銅離子與3 個His殘基中的N原子形成配位鍵，形成了具有特定三維結(jié)構(gòu)的活性部位，配位鍵中兩個為赤道面配位鍵，一個為較弱的軸向配位鍵。這兩個銅離子以赤道面與不同數(shù)目的氧原子產(chǎn)生配位結(jié)合而形成電子通路[7]。PPO因兩個銅離子結(jié)合氧原子數(shù)的不同，產(chǎn)生以下3 種型態(tài)：1）含兩個與一對外來氧原子連接的二價銅離子的氧化態(tài)酶；2）含兩個與一個外來氧原子連接的銅離子的還原態(tài)酶；3）含兩個沒與任何氧連接的相互分離的一價銅離子的脫氧態(tài)酶[8-9]。氧化態(tài)酶去氧生成還原態(tài)酶，還原態(tài)酶脫氧生成脫氧態(tài)酶，而氧化態(tài)酶和脫氧態(tài)酶通過釋放和結(jié)合氧氣又可相互可逆轉(zhuǎn)化。這3 種型態(tài)的存在和相互轉(zhuǎn)化是其發(fā)揮其單酚酶和多酚酶催化能力的關(guān)鍵[10]。圖1是酪氨酸酶通過3 種型態(tài)變化發(fā)揮雙重催化的一種得到廣泛認可的反應模型[11]。

圖 1 PPO催化單酚和雙酚底物氧化的循環(huán)圖[11]Fig. 1 Catalytic cycle for the oxidation of monophenol and diphenol substrates by PPO[11]

1.3 PPO提取、分離、純化、純度鑒定、活性測定的方法

PPO提取方法很多，通常根據(jù)PPO存在的植物種類來選擇分離提取方法。從果蔬組織中提取分離PPO面臨的一個主要問題是酚類底物和酶同時存在。在活組織中，這兩種成分在細胞內(nèi)單獨分開存在，但在浸漬、提取和其他加工處理中，它們一旦由于組織細胞破損而接觸就會產(chǎn)生醌和其他縮合產(chǎn)物，在提取時要注意去除酚類底物。傳統(tǒng)的提取方法主要分為緩沖液提取法[12-14]和丙酮提 取法[15-16]，緩沖液提取法應用較多；新型PPO提取方法有超聲波輔助提取法。

PPO粗提物大都含有許多雜質(zhì)，還需要對其進行分離純化。鹽析和色譜層析法等是早期純化PPO所常使用的 方法。使用硫酸銨進行分級沉淀后，通過透析去除無機雜質(zhì)，然后通過色譜法進一步分離。色譜方法有凝膠色譜、吸附色譜、親和色譜、離子交換色譜[17-18]。在各種色譜方法中選擇適當?shù)姆椒ㄈQ于酶的類型、雜質(zhì)、電荷、分子大小和提取物的純度。最近幾年溫度誘導相分離、雙水相萃取、三相分離技術(shù)等液-液萃取的技術(shù)也開始用于酶的分離純化中。

分離純化出的PPO一般要進行純度鑒定，為確保純化完全，一般鑒定方法有層析法、電泳法、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）、質(zhì)譜法等。在整個分離純化過程中要實時監(jiān)測PPO活性，測定PPO活性的方法主要有分光光度法和氧電極法。最近Pan Tingtiao等[19]發(fā)展了一種新的測定PPO的 方法——表面增強拉曼散射法，將該方法用于蘋果和馬鈴薯樣品中PPO活性的測定，并與比色法測定結(jié)果進行了比較，發(fā)現(xiàn)該方法可成功地用于食品樣品中PPO活力的測定。表1總結(jié)了PPO提取、分離、純化、純度鑒定、活性測定的方法及特點。

表 1 PPO提取、分離、純化、純度鑒定、活性測定的方法及特點Table 1 Methods for PPO extraction, separation and purification and determination of its purity and activity and their characteristics

續(xù)表1

2 酚類底物相關(guān)研究進展

2.1 多酚種類

酚類化合物屬于植物次生代謝產(chǎn)物，以苯環(huán)為基本骨架，以苯環(huán)的多羥基取代為特征，具有一系列的結(jié)構(gòu)和功能。酚類化合物根據(jù)結(jié)構(gòu)分為酚酸類、黃酮類、 1,2-二苯乙烯和木質(zhì)素類[36]。根據(jù)其碳骨架的不同可進一步細分（表2）。

表 2 根據(jù)碳骨架對植物組織酚類化合物的分類[37]Table 2 Classification of phenols compounds in plant tissues based on carbon skeleton[37]

2.2 影響植物組織多酚種類和含量變化的因素

不同品種的植物組織酚類化合物種類與含量差異較大。Khettal等[38]從產(chǎn)于阿爾及利亞的7 個不同品種柑橘葉片中提取多酚化合物，得到各品種水提物中總酚和總黃酮含量分別為68.23～125.28 mg/g和11.99～46.25 mg/g （以干質(zhì)量計，下同）。Tanri?ven等[39]測定了7 個不同品種梨汁中酚類物質(zhì)的含量，得到綠原酸質(zhì)量濃度為73.1～249 mg/L，表兒茶素質(zhì)量濃度為11.9～81.3 mg/L，咖啡酸質(zhì)量濃度為2.4～11.4 mg/L，對香豆酸質(zhì)量濃度為0.0～3.0 mg/L。Yi Yang等[40]對13 個品種蓮藕的酚類化合物的 含量、分布、組成進行了分析，發(fā)現(xiàn)藕肉、藕皮和藕節(jié)中總酚的平均含量分別為1.81、4.30 mg/g和7.35 mg/g （以鮮質(zhì)量計），總黃酮的平均含量分別為3.35、7.69 mg/g和15.58 mg/g（以鮮質(zhì)量計）。酚類化合物種類在不同部位上有顯著差異，藕肉中酚類物質(zhì)主要由沒食子兒茶素和兒茶素組成；藕皮和藕節(jié)中酚類物質(zhì)主要由沒食子兒茶素、沒食子酸、兒茶素和表兒茶素組成。

種植方式會影響酚類種類及含量。Veberic等[41]采用HPLC法測定了奧地利和斯洛文尼亞11 個有機栽培蘋果品種和11 個綜合生產(chǎn)蘋果品種果皮和果肉中酚類化合物的含量，發(fā)現(xiàn)有機栽培蘋果品種與綜合生產(chǎn)蘋果品種的 果皮酚類物質(zhì)含量無顯著差異；然而，有機種植的蘋果果肉中酚類物質(zhì)的含量高于綜合生產(chǎn)的蘋果品種。

提取方式也會影響測出的酚類種類和含量。Delgado-Torre等[42]對18 個不同葡萄品種的水醇提物進行了比較研究，分別采用過熱液體提取法、微波輔助提取法和超聲波輔助提取法進行提取，與其他兩種方法相比，過熱液體提取法具有更高的提取效率。Mai 等[43]采用多層逆流色譜法和制備型HPLC從卷心萵苣中分離出了10 種酚類化合物（咖啡酸、綠原酸、菜豆酸、菊苣酸、異綠原酸、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸、槲皮素-3-O-半乳糖苷、槲皮素-3-O-葡糖苷和槲皮素-3-O-(6-丙二?；?-葡糖苷）。紫丁香苷首次在萵苣中被鑒定，這種多酚類物質(zhì)以前在菊科中沒有提到過。

不同成熟期也會影響酚類含量。Lachowicz等[44]在大蒜的葉、根、莖和蒜根提取物中鑒定出了32 種山柰酚衍生物和4 種咖啡酸衍生物。3月份大蒜總酚含量為10.9～1477 mg/100 g，6月份大蒜總酚含量為6.5～1195 mg/100 g。甜菜葉在不同的成熟期褐變程度也不相同，甜菜葉從成熟3 個月到成熟8 個月，總酚含量從4.6 mg/g（以鮮質(zhì)量計）增加到9.4 mg/g（以鮮質(zhì)量計）。成熟8 個月的甜菜葉提取物的PPO活力是成熟3 個月葉提取物的6.7 倍[45]。Mahayothee等[46]研究了泰國兩個種植區(qū)授粉后180、190 d和225 d椰子水和椰肉中的酚類物質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)總酚含量在授粉后180～190 d隨椰子成熟而增加，在授粉后225 d下降或保持不變。兒茶酚和水楊酸是椰子水中的主要酚類化合物，而沒食子酸、咖啡酸、水楊酸和對香豆酸則存在于椰肉類中。

果蔬的酚類化合物含量由眾多因素決定，如品種、成熟期和環(huán)境因素。而且酚類化合物在植物中的分布也有不同，這是由遺傳和外界因素引起的[41]。HPLC法以及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用在果蔬中酚類物質(zhì)的分離、定量和鑒定方面取得了長足的進展[47]。

3 酚類化合物的酶促氧化

酶促褐變發(fā)生的確切途徑一直是人們關(guān)注的焦點?，F(xiàn)在普遍認為涉及兩個反應步驟[48]。第一個反應是單酚羥基化為二酚，鄰二酚羥基化為醌。酶促氧化的主要產(chǎn)物醌具有不同的光譜特性，其顏色取決于酚的來源和pH值。例如，酶促氧化后，綠原酸經(jīng)氧化后呈暗橙色，最大吸收波長為420 nm；兒茶素經(jīng)氧化后呈亮黃色，最大吸收波長為380 nm；L-多巴經(jīng)氧化后呈粉紅色，最大吸收波長為480 nm[49]。Rouet-Mayer等[50]研究了蘋果破碎組織中的酶促褐變以及在(+)-兒茶素和綠原酸的純?nèi)芤褐忻复俸肿儯啥畏磻纬傻幕衔锟芍?+)-兒茶素形成的鄰醌顏色更深，在綠原酸溶液和破碎的蘋果中顏色則更淺。兒茶素的鄰醌和綠原酸的鄰醌都不穩(wěn)定，較高pH值時，不穩(wěn)定性增加。在pH值為4的條件下，綠原酸的鄰醌比兒茶素的鄰醌顯色更強烈。

酚類化合物在發(fā)生氧化的同時還會發(fā)生自身聚合。酚類物質(zhì)的氧化聚合對果酒（白葡萄酒、蘋果酒等）的口感和穩(wěn)定性均有影響。張影陸等[51]以黃酮類物質(zhì)的典型代表兒茶素和酚酸類物質(zhì)的典型代表綠原酸為研究對象，在模擬體系中通過液相色譜-質(zhì)譜對其酶促氧化聚合進行了研究。發(fā)現(xiàn)單酚在酶促反應過程中確實會發(fā)生聚合，且不同的單酚表現(xiàn)出不同的聚合過程及不同的聚合速度。Bernillon等[52]研究了模型溶液的氧化產(chǎn)物與氧化蘋果汁的氧化產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)了咖啡?？鼘幩幔╟affeoylquinic acid，CQA）二聚體、CQA和兒茶素的二聚體以及CQA和二聚黃烷-3-醇的二聚體，未檢測到CQA和二氫查耳酮的二聚體。

酚類化合物可以通過不同途徑氧化，氧化產(chǎn)物相似。Makris等[53]研究了蘑菇PPO、辣根過氧化物酶和鐵氰化鉀3 種處理對槲皮素的氧化作用，發(fā)現(xiàn)槲皮素溶液經(jīng)PPO、辣根過氧化物酶、鐵氰化鉀處理后得到的色譜圖非常相似，得到的產(chǎn)物相同。

3.1 醌的生成途徑及其次級代謝

3.1.1 醌的不同生成途徑

結(jié)合不同的分析方法對確定含有一種或兩種酚類的模型體系的氧化產(chǎn)物時特別有用。研究者將化學氧化和酶催化氧化均用于這些體系中試圖闡明氧化機理[54]。不管醌是通過酶促氧化還是非酶促氧化形成的，這些可能導致形成色素的反應都是相似的[55]。這兩個反應途徑中唯一區(qū)別是褐變的發(fā)生速率，酶促褐變通常更快。Munoz-Munoz等[56]通過動態(tài)研究PPO、過氧化物酶以及化學氧化對綠茶兒茶素的作用，并且研究了這些化合物在自氧化過程中以及其鄰醌生成過程中過氧化氫的形成。PPO/O2和過氧化物酶/過氧化氫氧化綠茶兒茶素分別產(chǎn)生了鄰醌和半醌，(－)-表兒茶素和(+)-兒茶素在有O2參與的自氧化過程中過氧化氫生成量很低，而高碘酸鹽氧化產(chǎn)生的鄰醌的量很大，這突出了鄰醌在反應過程中的重要性。

3.1.2 醌的耦合氧化反應

酚類化合物氧化形成不穩(wěn)定的產(chǎn)物醌后，這些醌會與其他化合物反應，導致醌的穩(wěn)定性以及由此產(chǎn)生的任何顏色的色調(diào)和強度都變化很大，這取決于酚類前體和化學環(huán)境。醌的反應分為與酚類化合物反應（圖2）和與非酚類化合物反應（圖3）兩種。

圖 2 鄰醌與酚類化合物的反應[37]Fig. 2 Reactions of o-quinones with phenolic species[37]

圖 3 鄰醌與非酚類化合物的反應[37]Fig. 3 Reactions of o-quinones with nonphenolic species[37]

3.1.2.1 醌與酚類化合物的耦合氧化

醌與酚類化合物的耦合氧化可以非常迅速，并且取決于存在的不同醌/酚對應的各自氧化還原電位[37]。這些反應導致原始苯酚的二聚體形成或苯酚的再生（圖2）。產(chǎn)物本身經(jīng)受酶或其他酚類化合物的進一步氧化，導致形成分子質(zhì)量較大的低聚物。Cheynier等[57]研究了葡萄汁中酚類氧化和褐變的機理，具體為：咖啡酰酒石酸酶促氧化為 相應的咖啡酰酒石醌，然后用谷胱甘肽捕獲后者；過量的 咖啡酰酒石醌可能會與黃烷醇和花青素一起進入氧化反應。Poupard等[58]在蘋果汁模型溶液中研究了(-)-表兒茶素結(jié)構(gòu)對綠原酸鄰醌的反應性（即鄰醌是否能夠與多酚反應形成復合物）。考慮(-)-表兒茶素分子的兩個酚部分的反應性，選擇間苯三酚和4-甲基鄰苯二酚分別代表A-環(huán)和B-環(huán)。從形成的氧化產(chǎn)物可以看出，A環(huán)和B環(huán)的反應性明顯不同。A環(huán)和B環(huán)都可能參與共價鍵的形成，但是電子轉(zhuǎn)移只發(fā)生在B環(huán)上。大多數(shù)(-)-表兒茶素氧化產(chǎn)物通過A/B環(huán)鍵（“頭對尾”分子間偶聯(lián)）連接。

在PPO、酚類底物和花青素存在的情況下，酶和底物反應產(chǎn)生的中間產(chǎn)物鄰醌能通過氧化還原作用將花色苷轉(zhuǎn)化為氧化的花色苷及降解產(chǎn)物。Ruenroengklin等[59]證明了荔枝PPO不能直接氧化荔枝花色苷，而是直接氧化(-)-表兒茶素（荔枝內(nèi)源性底物），(-)-表兒茶素的氧化產(chǎn)物再催化荔枝花色苷降解，最終導致褐變反應，這可能是荔枝果實采后果皮褐變的原因。Sarni等[60]在模型溶液中研究了咖啡酰酒石酸和葡萄PPO對鄰二酚（如花青素-3-葡萄糖苷）和非鄰二酚（如錦葵花素-3-葡萄糖苷）花青素的氧化降解作用機理，具體為：咖啡酰酒石酸先經(jīng)過葡萄PPO酶促反應形成咖啡酰酒石酸鄰醌，咖啡酰酒石酸鄰醌再與兩種花色苷進行反應，花青素-3-葡萄糖苷的降解主要是通過與咖啡酰酒石酸鄰醌耦合氧化，而錦葵花素-3-葡萄糖苷與咖啡酰酒石酸醌形成加合物。

3.1.2.2 醌與非酚類化合物的耦合氧化

第二種反應（圖3）包括鄰醌與非酚類化合物反應，即抗壞血酸、亞硫酸鹽、硫醇、伯胺、仲胺（游離或存在于蛋白質(zhì)中）和水[61]。抗壞血酸是常見的抗褐變劑，它可以通過兩種不同的機制防止褐變[62]：在沒有PPO底物的情況下，它使PPO不可逆地失活，可能是通過與其活性位點的結(jié)合；在存在PPO底物的情況下，抗壞血酸會還原PPO氧化的反應產(chǎn)物，即與氧化形成的醌發(fā)生耦合氧化，使醌被還原，從而導致苯酚的再生，從而抑制褐變[61]，直到抗壞血酸被耗盡為止，隨后會形成棕色。Narváez-Cuenca等[63]研究了亞硫酸氫鈉對馬鈴薯提取物酚類化合物的影響，發(fā)現(xiàn)用亞硫酸氫鈉處理馬鈴薯提取物后，酚類化合物與其反應形成了20 種硫代加合物，其結(jié)構(gòu)已通過核磁共振波譜法和質(zhì)譜法證實。該研究認為當亞硫酸氫鈉用作抗褐變劑時，綠原酸被PPO氧化為o-鄰醌，然后o-鄰醌與亞硫酸氫鈉反應生成磺基-o-二酚，而后者不參與褐變反應。Kuijpers等[64]以蘑菇酪氨酸酶和綠原酸組成的褐變模型為基礎(chǔ)對NaHSO3和其他含硫化合物（半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫蘇糖醇）的抗褐變活性進行了比較，發(fā)現(xiàn)半胱氨酸和谷胱甘肽通過與綠原酸的鄰醌形成無色加成產(chǎn)物來防止褐變，二硫蘇糖醇通過抑制酪氨酸酶活性抑制褐變，而NaHSO3兩種途徑都有參與，其對褐變具有雙重抑制作用。

3.1.2.3 醌與蛋白質(zhì)的相互作用

醌還可以與蛋白質(zhì)發(fā)生共價相互作用而改變蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和消化率。Prigent等[65]研究了綠原酸氧化產(chǎn)物與氨基酸側(cè)鏈之間的共價相互作用，發(fā)現(xiàn)CQA氧化后先形成二聚體形式，二聚體再和賴氨酸、酪氨酸、組氨酸和色氨酸發(fā)生相互作用。CQA單體似乎能夠與組氨酸和色氨酸反應，而未觀察到賴氨酸、酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸與CQA單體的相互作用。Schilling等[66]研究了綠原酸醌與兩種氨基酸衍生物叔丁氧羰基-L-賴氨酸和N-乙酰-L-半胱氨酸之間的共價相互作用，在pH 7.0的模型系統(tǒng)中，證明了兩種衍生物的共價加成產(chǎn)物的形成。氨基側(cè)鏈與醌類物質(zhì)的共價相互作用可能有助于降低某些食品蛋白的致敏潛力。

3.2 氧化終產(chǎn)物特性

酶促褐變反應產(chǎn)物具有抗氧化性。許多研究主要涉及天然酚類的抗氧化活性，酶促氧化產(chǎn)物也有抗氧化活性，因為它們?nèi)匀痪哂胁糠址宇惢瘜W結(jié)構(gòu)。Cheigh等[67]研究了兒茶素模型系統(tǒng)中PPO氧化得到的黑色素相關(guān)產(chǎn)物的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)兒茶素-酶反應產(chǎn)物（catechinenzyme reaction products，CERP）呈不同強度的棕色，在反應的早期獲得的CERP顯示出比在后期更高的抗氧化活性。CERP的抗氧化活性可以通過其給出氫原子、清除自由基和抑制脂氧合酶的能力來解釋。Wong-Paz等[68]用蘋果中的PPO提取物氧化蘋果中常見的綠原酸和(α)-表兒茶素，以產(chǎn)生蘋果汁加工過程中形成的氧化產(chǎn)物，比較其與天然(-)-表兒茶素、咖啡酰奎尼酸母體分子、水溶性VE的體外1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除活性，發(fā)現(xiàn)氧化產(chǎn)物顯示出比母體分子等物質(zhì)的量混合物更低的抗氧化活性，但異二聚體顯示出比同二聚體更高的抗氧化潛能。

酶促褐變反應產(chǎn)物具有抗誘變性。Seung-Shi等[69]研究了馬鈴薯多酚類化合物的酶促褐變反應產(chǎn)物（enzymatic browning reaction products，PEBRPs）對抗誘變特性的影響，發(fā)現(xiàn)100 mg/kg的PEBRPs未引起小鼠骨髓微核嗜多染紅細胞（micronucleated polychromatic erythrocytes，MNPCEs）數(shù)量的增加，而苯并[a]芘（B[a]P）處理顯著增加了MNPCEs的生成率，在小鼠暴露于100 mg/kgmbB[a]P前12 h給予PEBRPs后，MNPCEs生成率顯著降低，說明馬鈴薯酶促褐變反應產(chǎn)物對B[a]P誘導的MNPCEs的生成有較強的抑制作用。

氧化產(chǎn)物還能抑制PPO活性。le Bourvellec等[70]從各個品種的蘋果酒中純化出聚合度分別為80、10.5和4的蘋果原花青素組分，原花青素、綠原酸、(-)-表兒茶素3 種單體以及綠原酸和(-)-表兒茶素的混合物分別與綠原酸的鄰醌反應被氧化形成氧化產(chǎn)物，評價了各組分及其氧化產(chǎn)物對PPO活性的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)天然原花青素 能夠抑制PPO活性，抑制強度隨聚合度增加而增加；氧化原花青素的抑制作用為天然原花青素的兩倍，綠原酸和(-)-表兒茶素混合物的氧化產(chǎn)物也抑制了PPO活性。

4 褐變抑制劑控制酶促褐變的機理研究

為了抑制果蔬褐變和保持果蔬品質(zhì)，國內(nèi)外科研工作者進行了大量廣泛而深入的研究。在傳統(tǒng)褐變化學 抑制劑中，亞硫酸鹽被廣泛用作褐變的抑制劑，但它會影響人體健康。因此，亞硫酸鹽的替代物如有機酸、巰基氨基酸、酚類物質(zhì)、天然產(chǎn)物等正在被作為可能的替代物而被深入研究。

許多有機酸是天然的褐變抑制劑，如檸檬酸、水楊酸、蘋果酸、曲酸、草酸[71-74]等。其抑制機理為：降低體系的pH值、絡(luò)合金屬離子、鈍化PPO活性?？箟难峒仁怯袡C酸，又是還原劑，其抑制褐變機理是將氧化的醌還原為酚類物質(zhì)，阻止醌類物質(zhì)進一步自發(fā)聚合形成色素物質(zhì)，抑制PPO活性，降低氧氣含量[75-79]。

半胱氨酸、乙?；腚装彼岷瓦€原型谷胱甘肽等巰基氨基酸有很強的抗褐變能力[80-83]。其抑制褐變的機制歸納起來為：一是醌類物質(zhì)能與巰基化合物形成無色的復合物，中斷了醌類物質(zhì)聚合形成色素物質(zhì)；二是巰基化合物可通過與PPO活性位點的銅離子不可逆結(jié)合而抑制酶活性，或者替代PPO活性位點的組氨酸殘基；三是巰基化合物并非阻止PPO氧化酚類，而是阻止酚類的聚合[84]。

絕大多數(shù)多酚類物質(zhì)本身能通過疏水鍵和多位點氫鍵與蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)合，其多個鄰位羥基可以和金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應，且酚羥基中的鄰位酚羥基極易被氧化，因此可以作為良好的抗氧化劑。越來越多植物組織中的多酚類提取物被證實對PPO活性具有抑制作用[85]。槲皮素、橙皮素、芹菜素、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷都對PPO活性有較好的抑制作用[86-87]。Si Yuexiu等[88]報道橙皮素作為PPO的一種競爭型抑制劑，能夠與PPO活性位點周邊的His61、His85、His259氨基酸殘基發(fā)生相互作用。熊志強[87]研究發(fā)現(xiàn)龍膽酸、芹菜素、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷3 種多酚類物質(zhì)與PPO通過非共價鍵和共價鍵的結(jié)合方式，阻斷了底物鄰苯二酚的進入，從而抑制PPO的催化活性。

豌豆發(fā)酵液、大豆發(fā)酵液、洋蔥、蘿卜、甘草的提取物等天然產(chǎn)物都對褐變有很好的抑制效果[89-91]。發(fā)揮其抗褐變作用的是提取物中的抗氧化物成分，比如有機酸、多酚類、黃酮類物質(zhì)，其作用是保護酚類不被氧化，抑制PPO活性。周麗等[90]研究發(fā)現(xiàn)豌豆發(fā)酵液對馬鈴薯PPO活性具有良好的抑制效果，發(fā)酵液的主要成分為氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖、有機酸、多酚類、黃酮類、皂苷等物質(zhì)，其中的抗褐變成分具有良好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性，分子質(zhì)量小于1000 u，為極性較大的物質(zhì)。

5 結(jié) 語

酶促褐變機理研究對于控制新鮮果蔬的保鮮和加工品質(zhì)具有重大意義。根據(jù)褐變機理，可以從抑制PPO活性、改變酶環(huán)境方面入手，或者從阻斷酚類底物的聚合、抑制醌氧化、調(diào)節(jié)醌還原角度出發(fā)，減緩和抑制 褐變的發(fā)生。但是目前酶促褐變機理研究還存在一些瓶頸，首先，盡管已有大量研究表明PPO參與酶促褐變，但酶晶體的獲得還是較為困難，目前對PPO高級結(jié)構(gòu)的研究是以核酸序列、蛋白質(zhì)序列為基礎(chǔ)，利用計算機軟件來模擬PPO空間結(jié)構(gòu)、活性位點、底物結(jié)合區(qū)，其真實的高級結(jié)構(gòu)至今仍未探明。其次，對酚類化合物復雜的代謝過程分析仍有難度，酚類化合物的種類越多，反應產(chǎn)物就會越復雜。再者，大多數(shù)研究通過模型體系來探討酶促褐變機理，在真實的食品體系中研究較少，數(shù)據(jù)的獲得和研究方法的可行性尚需進一步探討。

隨著基因組學技術(shù)越來越成熟，可以從基因水平研究PPO，并通過基因編輯、基因敲除、基因沉默等手段對PPO進行調(diào)控。隨著代謝組學技術(shù)的更新，對果蔬中各種類型的酚類化合物在酶促反應中的代謝途徑、初級產(chǎn)物、次級產(chǎn)物、反應類型等研究應進一步加強，借助現(xiàn)代先進分析儀器，以真實的食品體系為基礎(chǔ)研究酶促褐變中目標成分的含量變化及代謝過程。以基因組學和代謝組學為兩大抓手開展PPO和酚類化合物的深入研究將有助于進一步明晰酶促褐變機理。