李伊寧，黃昆侖，姚志軼*

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

葉酸，又稱蝶酰谷氨酸，其化學(xué)結(jié)構(gòu)由蝶啶基、對氨基苯甲酸殘基和一個(gè)或多個(gè)谷氨酸殘基構(gòu)成（圖1）[1]。 葉酸是一種水溶性VB，廣泛存在于新鮮水果、綠葉蔬菜、動物肝臟和豆類中[2]。在人體中，葉酸參與氨基酸代謝與核酸代謝中一碳單位的獲取、運(yùn)輸和酶促加工。有研究表明，葉酸可與VB12共同參與DNA和RNA的合成；同時(shí)，葉酸在RNA的轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要作用，是DNA精確復(fù)制中必不可缺的關(guān)鍵因素[3-4]。由于人體無法自行合成葉酸，只能通過腸道吸收外源性葉酸，往往會導(dǎo)致葉酸缺乏癥，而葉酸的缺乏會導(dǎo)致生理功能障礙和某些疾病的發(fā)生[5]，如巨幼紅細(xì)胞貧血、精神退行性疾病、新生兒神經(jīng)管畸形和骨質(zhì)疏松等；因此葉酸的攝入與補(bǔ)充逐漸成為一個(gè)世界性的健康問題[6-7]，特別在中國，受葉酸攝入量影響的出生缺陷和慢性病也是一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問題[8-10]。2005年，國家公眾營養(yǎng)改善項(xiàng)目辦公室、國家發(fā)展和改革委員會公眾營養(yǎng)與發(fā)展中心確定葉酸為“7+1” 面粉營養(yǎng)強(qiáng)化配方成分之一[1]。人們已經(jīng)認(rèn)識到葉酸的重要性，一些含葉酸的營養(yǎng)強(qiáng)化食品正不斷地被開發(fā)[11]。而在醫(yī)藥體系中，葉酸是人體不可或缺的營養(yǎng)素之一，特別是孕婦、乳母、嬰幼兒等有更強(qiáng)的葉酸補(bǔ)充需求[12]。

隨著對葉酸研究的深入，越來越多的研究表明，通過食品強(qiáng)化途徑攝入的葉酸也可能增加VB12缺乏的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而使老年人罹患神經(jīng)性疾病的概率增加[13]。也有研究指出，過量的葉酸可能導(dǎo)致缺鋅、厭食、惡心等一系列胃腸綜合癥狀[14]。因此，葉酸的合理攝入十分重要?？焖贉?zhǔn)確地檢測葉酸含量，是指導(dǎo)葉酸攝入并保證其安全性和有效性的重要技術(shù)手段，同時(shí)也是診斷各種疾病的有效指標(biāo)[15]，對于臨床診斷具有重要意義。

目前，許多葉酸檢測方法已經(jīng)被開發(fā)且日趨完善，傳統(tǒng)的葉酸檢測法包括微生物法[16]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[17]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[18]、比色法[19]、毛細(xì)管電泳法[20]、酶聯(lián)免疫吸附測定法[21]等。在已報(bào)道的方法中，微生物法因其測量范圍廣、成本低而被公認(rèn)為首選方法，但其通常需要較長的檢測周期。HPLC法與液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具有良好的選擇性，但在分析過程中仍存在設(shè)備昂貴、耗時(shí)長等問題。毛細(xì)管電泳法具有樣品量少、分離效率高的優(yōu)點(diǎn)，但也存在重現(xiàn)性差、有機(jī)溶劑有毒等缺點(diǎn)。此外，比色法和酶聯(lián)免疫吸附測定法在檢測時(shí)速度較快，但通常靈敏度較低，需要進(jìn)行預(yù)處理以去除基質(zhì)中的干擾。在此基礎(chǔ)上，為了能夠簡便且精確地進(jìn)行葉酸檢測，人們開發(fā)了不同的檢測葉酸的熒光傳感器。

熒光傳感器是指以熒光為手段，能夠?qū)z測物質(zhì)產(chǎn)生可檢測信號的策略或裝置，一般由接受體、連接體和發(fā)光體組成，通過接受體與目標(biāo)物的特異結(jié)合實(shí)現(xiàn)對后者的定性或定量檢測[22-23]。相比于傳統(tǒng)檢測方法，熒光傳感器具有操作簡便、響應(yīng)快速、靈敏度高、成本低等優(yōu)點(diǎn)[24]。熒光傳感器有諸多分類標(biāo)準(zhǔn)，如組成材料、待測物種類、信號的產(chǎn)生和傳導(dǎo)機(jī)理等[25-26]。

本文對用于葉酸檢測的熒光傳感器組成材料進(jìn)行分類，綜述了不同類型傳感器的研究進(jìn)展，著重概述了用于葉酸檢測的熒光傳感器構(gòu)建及其在食品、藥品及生物方面的應(yīng)用情況，以期為建立精準(zhǔn)測定各種體系中葉酸含量的方法提供參考。

1 用于葉酸檢測的熒光傳感器構(gòu)建

葉酸分子含有多種官能團(tuán)，羧基、氨基賦予了葉酸的親水性，蝶啶環(huán)、苯環(huán)賦予其疏水性，葉酸還有包括多個(gè)氫鍵的供體與受體，這些結(jié)構(gòu)特點(diǎn)都為葉酸傳感器的設(shè)計(jì)提供了基礎(chǔ)。

1.1 基于有機(jī)分子探針的熒光傳感器

有機(jī)分子探針往往具有廣泛的原料來源和較強(qiáng)的結(jié)構(gòu)可塑性，能夠在不同的檢測環(huán)境中根據(jù)需求進(jìn)行多樣化的設(shè)計(jì)，甚至無需輔助熒光增強(qiáng)即可達(dá)到較好的效果[27]。

2008年，Yao Zhiyi等設(shè)計(jì)合成了可作為檢測葉酸用探針的聚(3-烷氧基-4-甲基噻吩)（poly (3-alkoxy-4-methyl thiophene)，P3RO-4MeT）（圖2A）[28]。P3RO-4MeT是一種水溶性聚噻吩衍生物，具有熒光信號放大效應(yīng)、優(yōu)良的半導(dǎo)體性能和高摩爾消光系數(shù)等傳統(tǒng)共軛聚合物的共同優(yōu)勢，且有著較好的環(huán)境穩(wěn)定性與熱穩(wěn)定性。當(dāng)P3RO-4MeT所在體系中加入葉酸時(shí)，由于靜電作用和疏水作用的協(xié)同作用，葉酸能夠誘導(dǎo)P3RO-4MeT形成超分子聚集體，進(jìn)而發(fā)生明顯的熒光猝滅，檢測限為10 nmol/L。 此外，該過程的發(fā)生還伴隨顯著的顏色變化（圖2B），為葉酸的可視化檢測提供了思路。2019年，Jiang Shengjie等報(bào)道了一個(gè)基于聚集誘導(dǎo)發(fā)光機(jī)理用于檢測葉酸的熒光探針——冠醚橋聯(lián)雙四苯乙烯（crown ether-bridged bis-tetraphenylethylene-1，Bis-TPE-1）（圖3）[29]。 聚集誘導(dǎo)發(fā)光機(jī)理是由唐本忠院士在2001年提出的，即染料分子處于分散態(tài)時(shí)熒光強(qiáng)度較弱，甚至難以觀察，但當(dāng)其處于聚集態(tài)時(shí)熒光強(qiáng)度發(fā)生明顯增強(qiáng)[30]。在測試體系（V（四氫呋喃）∶V（H2O）＝5∶95）中，分散態(tài)的 Bis-TPE-1由于分子內(nèi)單鍵旋轉(zhuǎn)而消耗能量導(dǎo)致其熒光微弱[29]。 加入葉酸后，葉酸的—NH2基團(tuán)與Bis-TPE-1的C＝O 基團(tuán)形成氫鍵，同時(shí)Bis-TPE-1的四苯乙烯與葉酸發(fā)生π-π作用。因此，葉酸位于兩個(gè)四苯乙烯單位之間的空腔中，使得Bis-TPE-1分子內(nèi)單鍵旋轉(zhuǎn)被抑制而發(fā)出強(qiáng)烈的熒光，檢測限為0.636 μmol/L。Jiang Shengjie等還制作了Bis-TPE-1試紙對其進(jìn)行應(yīng)用性能評估，發(fā)現(xiàn)在365 nm波長的紫外光照射下，除葉酸外其余物質(zhì)均無變色[29]。

圖 2 P3RO-4MeT分子結(jié)構(gòu)式（A）和P3RO-4MeT探針加入 等濃度的各種待測物后的可視化響應(yīng)（B）[28]Fig. 2 Chemical structure of poly (3-alkoxy-4-methyl thiophene) (A) and visual changes of poly (3-alkoxy-4-methyl thiophene) in the presence of substances to be analyzed at a molar ratio of 1:1 (B)[28]

圖 3 Bis-TPE-1分子結(jié)構(gòu)式[29]Fig. 3 Chemical structures of crown ether-bridged bis-tetraphenylethylene-1[29]

由于普通有機(jī)染料在水溶液體系中存在聚集猝滅效應(yīng)，使有機(jī)分子熒光傳感器在水溶液體系中的葉酸檢測十分受限[29]。以上兩種傳感器均實(shí)現(xiàn)了水溶液體系的葉酸檢測，無需添加輔助熒光增強(qiáng)的物質(zhì)即可達(dá)到強(qiáng)烈熒光及顏色變化，有效地實(shí)現(xiàn)了葉酸檢測，但目前基于有機(jī)分子探針的熒光傳感器報(bào)道依然較少，有待于進(jìn)一步研究。

1.2 基于發(fā)光配合物的熒光傳感器

配合物是一種以金屬離子為中心，有機(jī)配體通過配位鍵與其發(fā)生自組裝的無機(jī)-有機(jī)雜化材料[31]。由于其集合了無機(jī)材料和有機(jī)材料的特點(diǎn)，且它的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)更加易于調(diào)控，所以其被認(rèn)為是一種應(yīng)用前景廣闊的材料。

在以配合物為熒光探針檢測葉酸時(shí)，熒光發(fā)生猝滅的最主要原因是結(jié)構(gòu)坍塌機(jī)理，即配合物的空間結(jié)構(gòu)在識別葉酸的過程中被破壞而導(dǎo)致熒光猝滅[32]。

Yu Fengshan等設(shè)計(jì)了Tb3+-氧四環(huán)素（圖4A）作為熒光探針并以其進(jìn)行葉酸的檢測[33]。Manzoori等選擇 1,10-鄰二氮菲作為Tb3+的配體進(jìn)行檢測（圖4B）[34]。氧四環(huán)素與1,10-鄰二氮菲均能夠?qū)⑽盏哪芰總鬟f給 Tb3+，從而提高其熒光強(qiáng)度。有研究表明，芳香羧酸配體和β-二酮配體在發(fā)生分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移時(shí)具有較高的能量傳遞效率[35]。當(dāng)加入葉酸后，上述兩種熒光探針的配體（氧四環(huán)素和1,10-鄰二氮菲）均通過非共價(jià)作用與葉酸形成穩(wěn)定、結(jié)合度高且結(jié)構(gòu)剛性好的基態(tài)絡(luò)合物，使熒光探針發(fā)生猝滅。Alam等報(bào)道了以Eu3+為配位中心的熒光探針（圖4C）[36]。由于Eu本身熒光較弱，因此選擇了依諾沙星作為配體與其絡(luò)合。依諾沙星因結(jié)構(gòu)中含有—COOH和C＝O兩種活性基團(tuán)，能夠與Eu3+形成強(qiáng)絡(luò)合物而使熒光強(qiáng)度增強(qiáng)[37]。在堿性介質(zhì)中，葉酸能夠引起該探針的熒光猝滅，線性范圍為1.25～150 nmol/L，檢測限為0.694 nmol/L。

綜上所述，基于配合物的熒光傳感器往往通過有機(jī)配體與稀土離子相互作用，使其熒光增強(qiáng)。這使得以上熒光傳感器避免了來自生物基質(zhì)的熒光干擾，可以在高效 靈敏地測定葉酸含量的同時(shí)降低共存物質(zhì)的干擾，使檢測擁有良好的抗干擾能力。

圖 4 發(fā)光配合物探針示意圖[33-34,36]Fig. 4 Schematic illustration of luminescent probes[33-34,36]

1.3 基于納米材料的熒光傳感器

納米熒光傳感器往往具有光學(xué)性能穩(wěn)定、量子產(chǎn)率高、生物相容性良好等優(yōu)點(diǎn)。由于納米粒子的尺寸和組成使得納米熒光傳感器在特定能級下發(fā)光，其在單一激光源的激發(fā)下可以得到不同的顏色[38]，因此納米熒光傳感器可以同時(shí)檢測多個(gè)光學(xué)信號，使其應(yīng)用更加靈活。

1.3.1 基于量子點(diǎn)的熒光傳感器

量子點(diǎn)是近年來最具發(fā)展?jié)摿Φ男滦图{米材料之一，因其特殊的結(jié)構(gòu)和良好的性能而廣受關(guān)注。量子點(diǎn)具有寬且連續(xù)的激發(fā)光譜、窄且對稱的發(fā)射光譜、高而穩(wěn)定的發(fā)光效率、非常強(qiáng)的抗光漂白能力以及良好的生物相容性[39]，同時(shí)它具有大的斯托克位移，可以顯著避免熒光發(fā)射和激發(fā)之間的光譜重疊[40]。因此，量子點(diǎn)的應(yīng)用可以提高熒光信號的檢測靈敏度和穩(wěn)定性。

Chen Zhangbao等以乳糖作為碳源，通過水熱合成法在強(qiáng)堿（NaOH溶液）環(huán)境中合成了具有藍(lán)色熒光的碳量子點(diǎn)（圖5）[41]，葉酸的親水官能團(tuán)可以與碳量子點(diǎn)表面的親水基團(tuán)形成氫鍵，使碳量子點(diǎn)發(fā)生聚集，進(jìn)而導(dǎo)致其熒光猝滅。張毅等采用聚乙烯亞胺使量子點(diǎn)功能化[13]。 由于聚乙烯亞胺的引入，量子點(diǎn)表面擁有了大量的氨基。當(dāng)葉酸加入檢測體系后，葉酸的羧基會與量子點(diǎn)表面的氨基發(fā)生靜電作用，進(jìn)而導(dǎo)致電子轉(zhuǎn)移，使量子點(diǎn)發(fā)生熒光猝滅。以上兩種均是采用發(fā)光量子點(diǎn)的單發(fā)射波長的傳感器，這類傳感器的研究極為豐富[42-45]，研究者們往往通過合成技術(shù)控制量子點(diǎn)的尺寸及其化學(xué)組分，來實(shí)現(xiàn)量子點(diǎn)在檢測過程中的優(yōu)化。

此外，有研究者通過對發(fā)光量子點(diǎn)的修飾實(shí)現(xiàn)了雙發(fā)射比率熒光傳感器的構(gòu)建，這在葉酸檢測的傳感器中較為少見。Wang Yongbo等設(shè)計(jì)了以銅、錳共同摻雜的ZnS量子點(diǎn)為熒光探針的比率熒光傳感器，以595 nm波長和490 nm波長處兩個(gè)發(fā)射峰比值作為檢測葉酸濃度的指標(biāo)（圖6）[46]。葉酸可以與銅、錳共同摻雜的ZnS量子點(diǎn)通過靜電作用發(fā)生強(qiáng)烈相互作用，且葉酸的羧酸基團(tuán)和氮原子對量子點(diǎn)表面的鋅具有很高的親和力。因此，在銅、錳共同摻雜的ZnS量子點(diǎn)表面可以很容易地吸附葉酸，并實(shí)現(xiàn)葉酸的檢測，線性范圍為0.01～5 μmol/L， 檢測限為6 nmol/L。He Yu等將氨基修飾的橙色量子點(diǎn)與 羧基修飾的藍(lán)色石墨烯量子點(diǎn)（graphene quantum dots，GQDs）共價(jià)連接，制備了一種雙發(fā)射納米探針（圖7）[47]。 當(dāng)激發(fā)波長為310 nm時(shí)，該探針在401 nm波長和605 nm波長處有兩個(gè)發(fā)射峰，其比值與體系中葉酸濃度存在線性關(guān)系。葉酸可以通過靜電作用吸附在量子點(diǎn)表面，同時(shí)葉酸的親水基團(tuán)與GQDs的親水基團(tuán)形成氫鍵，使發(fā)光量子點(diǎn)發(fā)生熒光猝滅。該方法檢測范圍為0.25～51.34 μmol/L，檢測限為0.03 nmol/L。這兩種傳感器由于在檢測時(shí)計(jì)算兩個(gè)發(fā)射強(qiáng)度的比值，具有自參考能力，可以減輕環(huán)境影響，使檢測更加靈敏準(zhǔn)確[46]。

圖 5 碳量子點(diǎn)合成示意圖[41]Fig. 5 Schematic illustration of synthesizing carbon quantum dots[41]

圖 6 基于銅、錳共同摻雜ZnS量子點(diǎn)為探針的比率熒光傳感器[46]Fig. 6 Schematic illustration of ratiometric fluorescent sensors based on Cu-Mn codoped ZnS quantum dots[46]

圖 7 基于雙發(fā)射納米探針的比率熒光傳感器[47]Fig. 7 Schematic illustration of ratiometric fluorescent sensors based on a dual-emission fluorescent nanoprobe[47]

1.3.2 基于金屬納米簇的熒光傳感器

熒光金屬納米簇是近年來新興起的一類發(fā)光材料，包括幾個(gè)至幾百個(gè)金屬原子[40]。金屬納米簇與其他材料相比，粒徑小、毒性低、生物相容性好。但是，由于熒光量子產(chǎn)率較低，限制了其在傳感應(yīng)用中的使用[48]。 因此，學(xué)者們尋找了許多有效的手段來提高其熒光量子產(chǎn)率。

在葉酸的傳感檢測中，學(xué)者們以納米簇作為構(gòu)筑基元，通過有效的超分子相互作用構(gòu)筑組裝體，以增強(qiáng)納米簇的熒光性能。Zhang Jianrong等應(yīng)用聚乙烯亞胺包封銀納米團(tuán)簇（polyethylenimine-capped silver nanoclusters，PEI-AgNCs）[49]。PEI與葉酸也可發(fā)生相互作用，使葉酸與AgNCs更加靠近，進(jìn)一步加強(qiáng)了二者之間的靜電作用。在體系中，電子可以通過PEI由葉酸轉(zhuǎn)移至AgNCs使其發(fā)生熒光猝滅，檢測限為0.032 nmol/L。Li Xinge等采用卵清蛋白（ovalbumin，OVA）與銅納米簇（CuNCs）相互作用并作為熒光探針（圖8）[24]。OVA含有豐富的氨基酸殘基，因此OVA表面眾多羧基可以與銅原子相互作用，進(jìn)而與銅納米簇形成OVA-CuNCs。葉酸可以通過靜態(tài)猝滅機(jī)制使OVA-CuNCs熒光發(fā)生猝滅，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)葉酸檢測，檢測限為0.18 μmol/L。Yan Xu等提出了應(yīng)用金屬納米簇的另一種策略：在體系中同時(shí)引入金納米團(tuán)簇（AuNCs）和巰基乙胺修飾的金納米顆粒（cysteamine-modified gold nanoparticles，cyst-AuNPs）[50]。

AuNCs的熒光可以被cyst-AuNPs猝滅，但在加入葉酸后其熒光得以恢復(fù)。這可能是由于葉酸吸附在 cyst-AuNPs表面使其聚集，或者葉酸通過氫鍵將相鄰兩個(gè) cyst-AuNPs的羧基和氨基連接，同時(shí)通過靜電作用使其聚集。因此，加入葉酸后，可以通過AuNCs的熒光增強(qiáng)實(shí)現(xiàn)對葉酸的檢測，檢測限為0.065 μmol/L。

圖 8 基于OVA-CuNCs的熒光傳感器[24]Fig. 8 Schematic illustration of fluorescent sensors based on ovalbumin-CuNCs[24]

在上述采用金屬納米簇的熒光傳感器中，葉酸與PEI-AgNCs需要反應(yīng)20 min以達(dá)到最大熒光猝滅效率，而其與AuNCs/cyst-AuNPs需要反應(yīng)15 min以達(dá)到最大熒光猝滅效率。這表明大多數(shù)采用金屬納米簇的熒光傳感器在進(jìn)行葉酸檢測時(shí)需要一定的反應(yīng)時(shí)間，未來一段時(shí)間內(nèi)，進(jìn)一步縮短檢測時(shí)間、提升檢測效率或成為該方向的研究重點(diǎn)。

1.3.3 基于片層納米材料的熒光傳感器

眾所周知，溶液中的有機(jī)發(fā)色團(tuán)在長時(shí)間的使用過程中，通常會受到活性物質(zhì)的浸出或降解，從而導(dǎo)致 熒光猝滅。為了針對復(fù)雜體系建立更加穩(wěn)定的葉酸檢測方法，學(xué)者們研究了新型納米傳感器。

Liu Pengfei等將8-氨基萘-1,3,6-三磺酸鹽（8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonate，ANTS）固定在層狀雙氫氧化物（layerd double hydroxides，LDH）表面，研制了一種新型的熒光納米傳感器[51]。LDH具有剛性的主體層板、良好的光熱穩(wěn)定性和紫外阻隔等優(yōu)點(diǎn)，LDH薄膜基熒光材料目前已經(jīng)被廣泛運(yùn)用到各類熒光傳感器中[52]。在LDH表面被ANTS錨定的—SO3中的氧原子很容易與葉酸發(fā)生碰撞并形成氫鍵，導(dǎo)致 ANTS-Zn-Al-CO3-LDH的熒光猝滅（圖9）[51]。該傳感器在模擬生理?xiàng)l件下，線性范圍為1～200 μmol/L，檢測限為0.1 μmol/L。

圖 9 基于ANTS-Zn-Al-CO3-LDH的熒光傳感器[51]Fig. 9 Schematic illustration of fluorescent sensors based on 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonate-anchored Zn-Al-CO3-layerd double hydroxides[51]

為更直觀地進(jìn)行性能對比，將上述傳感器優(yōu)點(diǎn)、缺點(diǎn)及檢測機(jī)理總結(jié)為表1。目前，針對檢測葉酸的熒光傳感器構(gòu)建均基于葉酸與傳感材料之間的非共價(jià)作用所導(dǎo)致的熒光信號改變。信號改變在單發(fā)射波長傳感器中主要為熒光猝滅或熒光增強(qiáng)；在雙發(fā)射比率熒光傳感器中為發(fā)光材料兩發(fā)射峰比值發(fā)生改變。

表 1 檢測葉酸的不同材料傳感器特點(diǎn)Table 1 Features of various sensors based on different sensing materials for folic acid detection

2 檢測葉酸的熒光傳感器應(yīng)用進(jìn)展

利用熒光檢測快速、靈敏、簡便的優(yōu)點(diǎn)，檢測葉酸的熒光傳感器可以在食品安全、生理生化檢測以及臨床診斷等諸多領(lǐng)域中發(fā)揮功效。

2.1 食品藥品質(zhì)量控制

隨著人們生活品質(zhì)的提高及營養(yǎng)知識的普及，選擇添加營養(yǎng)補(bǔ)充劑的食品來彌補(bǔ)原本膳食中攝入不足的葉酸成為熱點(diǎn)[53]。同時(shí)，葉酸藥品及保健品的開發(fā)也擁有非常廣闊的市場前景。

Blanco等采用熒光素建立了檢測葉酸的熒光傳感器并在某運(yùn)動飲料中進(jìn)行了實(shí)際檢測[54]。隨著研究的不斷深入，針對葉酸制劑、面粉及制品、奶制品、蔬菜、飲料等多種體系檢測葉酸的熒光傳感器的應(yīng)用有諸多報(bào)道。Hassanzadeh等設(shè)計(jì)了一種基于納米銀增強(qiáng)鋱熒光強(qiáng)度的新型熒光探針，該探針可以與葉酸形成三元復(fù)合物導(dǎo)致熒光猝滅[55]。在實(shí)際應(yīng)用中進(jìn)行藥片及面粉中的葉酸檢測時(shí)，加標(biāo)回收率在97%～102%之間，且與HPLC法檢測結(jié)果相近。Li Xinge等在食品、藥品體系中應(yīng)用OVA-CuNCs熒光傳感器[24]。在檢測過程中，OVA可以保護(hù)CuNCs在一定程度上免受pH值、溫度、陰離子干擾等影響。

2.2 臨床檢測評估

葉酸缺乏與多種臨床表現(xiàn)有關(guān)，因此準(zhǔn)確地評估人體內(nèi)葉酸的狀態(tài)非常重要。目前，血清葉酸和紅細(xì)胞葉酸檢測在臨床實(shí)驗(yàn)室中較為常見，其中，血清葉酸可反映體內(nèi)葉酸的短期水平，因而能夠更及時(shí)地體現(xiàn)疾病的發(fā)生與發(fā)展[56]。

圖 10 Fe3O4-ZnS:Mn2＋/SiO2-NH2納米復(fù)合材料的熒光傳感器[57]Fig. 10 Schematic illustration of fluorescent sensors based on Fe3O4-ZnS:Mn2+/SiO2-NH2 nanocomposite[57]

為了實(shí)現(xiàn)臨床中快速準(zhǔn)確的檢測，學(xué)者們在尿液[14]及血清[50]中應(yīng)用傳感器進(jìn)行實(shí)際檢測。Chakravarty等設(shè)計(jì)了以聚乙烯醇為基底的色氨酸-碲化鎘量子點(diǎn)納米熒光傳感器[4]。該傳感器被應(yīng)用于經(jīng)過血漿蛋白去除的急性骨髓性白血病患者與卵巢癌患者血清樣品，表現(xiàn)出很高的傳感效率，檢測限分別為95.81 nmol/L與826.91 nmol/L。 Li Xiaowan（圖10）[57]和Wang Meng[58]等均在其傳感體系中加入磁性納米顆粒作為吸附劑進(jìn)行檢測。作為吸附劑的磁性納米粒子在水溶液中有獨(dú)特的分散能力，與樣品溶液之間的接觸比表面積極大，可以高效地吸附樣品。與傳統(tǒng)樣品前處理方法相比，磁性納米粒子可以在外加磁場的條件下更容易與血清基質(zhì)分離，無需額外的過濾和離心步驟即可進(jìn)行檢測，更加方便、經(jīng)濟(jì)、高效。因此，該磁性復(fù)合熒光材料可以更直接地用于復(fù)雜生物血清樣品的檢測，促進(jìn)了葉酸臨床檢測評估的發(fā)展。

2.3 細(xì)胞成像

熒光傳感器擁有良好的發(fā)光性能，因此，基于熒光探針的生物成像技術(shù)擁有巨大的潛力[59]。研究者們設(shè)計(jì)了一系列生物相容性良好且毒性低的熒光探針，以此探究生物體內(nèi)微環(huán)境并實(shí)現(xiàn)對疾病的可視化評估。

Jiang Shengjie等研究發(fā)現(xiàn)含有熒光探針Bis-TPE-1的細(xì)胞呈現(xiàn)出綠色熒光，當(dāng)加入葉酸后該熒光變?yōu)樗{(lán)色，這說明Bis-TPE-1有良好的生物成像能力[29]，可以用于檢測人體環(huán)境中的葉酸。Mu Zhao等制備了氮、硫、碘共同摻雜的熒光碳點(diǎn)（N, S, I co-doped carbon dots， N, S, I-CDs），該熒光碳點(diǎn)具有良好的穩(wěn)定性、親水性、低毒性和良好的生物相容性[60]。對U-2OS和結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，N, S, I-CDs在體內(nèi)外均可用于葉酸和溫度傳感，是良好的細(xì)胞顯像劑。

圖 11 熒光探針AA-CDs葉酸檢測及其用于癌細(xì)胞靶向檢測示意圖[62]Fig. 11 Schematic illustration of AA-CDs for the detection of folic acid and fluorescence targeted imaging of folate receptor overexpressed cancer cells[62]

癌癥嚴(yán)重威脅著人類的健康和生命，其早期的診斷目前被視為世界性的重大醫(yī)學(xué)難題。光學(xué)成像技術(shù)作為一種新興的影像技術(shù)，在靈敏度和分辨率方面均有巨大的優(yōu)勢，能夠?yàn)閷ふ矣行У陌┌Y早期診斷辦法奠定 基礎(chǔ)[61]。Qian Jiali等由抗壞血酸（aconitic acid，AA）與碳量子點(diǎn)通過水熱反應(yīng)合成了熒光探針AA-CDs，該探針可與葉酸形成三元復(fù)合物，導(dǎo)致熒光猝滅[62]。FA-AA-CDs 被認(rèn)為是一種弱熒光納米探針，可以被細(xì)胞表面的葉酸受體識別。當(dāng)AA-CDs被釋放到細(xì)胞內(nèi)后發(fā)出熒光，這一動態(tài)過程有利于對葉酸受體過度表達(dá)的癌細(xì)胞進(jìn)行靶向檢測，并依據(jù)細(xì)胞熒光強(qiáng)度區(qū)分葉酸受體表達(dá)水平 不同的細(xì)胞（圖11）[62]。Kundu等采用多價(jià)樹枝狀 高分子-半導(dǎo)體納米復(fù)合材料，增強(qiáng)了探針與葉酸受體的結(jié)合程度，可作為顯像劑對細(xì)胞表面葉酸受體進(jìn)行 檢測[63]。同時(shí)，該研究中的葉酸-多按樹突狀分子偶聯(lián)物也為開發(fā)針對癌細(xì)胞的藥物傳遞系統(tǒng)提供啟發(fā)，為藥物靶向輸送奠定基礎(chǔ)。

3 結(jié) 語

綜上，盡管基于熒光信號的葉酸傳感器數(shù)量不多，但其發(fā)展已經(jīng)趨于成熟。目前，各種各樣的材料都被用于構(gòu)建檢測葉酸的熒光傳感器，檢測材料覆蓋了有機(jī)分子探針、發(fā)光聚合物和納米材料。采用熒光傳感器的葉酸檢測方法最低檢測限可達(dá)到0.03 nmol/L，可操作范圍覆蓋0.1～200 μmol/L，已在食品、藥品、血清、尿液等多種實(shí)際樣品或環(huán)境中進(jìn)行應(yīng)用，抗干擾性良好。然而針對葉酸與探針的結(jié)合常數(shù)鮮見報(bào)道，這或許是后續(xù)工作中評價(jià)葉酸檢測特異性及抗干擾能力的客觀指標(biāo)之一。可見熒光傳感器已成為快速、靈敏、簡便的理想葉酸檢測方法之一，極大地促進(jìn)了葉酸檢測技術(shù)的發(fā)展。

隨著檢測需求日益增多以及葉酸標(biāo)準(zhǔn)化檢測需求的增加，檢測葉酸的傳感器依然面臨著巨大的挑戰(zhàn)：1）食品基質(zhì)十分復(fù)雜，實(shí)際樣品體系中可能存在多種干擾物的協(xié)同效應(yīng)。為提升實(shí)際樣品檢測中的準(zhǔn)確性，增加協(xié)同干擾測試、提升傳感器抗干擾能力或優(yōu)化檢測前處理方法等將有效提高葉酸在復(fù)雜體系中的檢測能力；2）生理?xiàng)l件下，葉酸有不同的存在形式，在醫(yī)學(xué)檢測中各種存在形式的葉酸均需納入檢測范圍；3）目前葉酸的檢測與應(yīng)用主要在水溶液體系中進(jìn)行，為了增強(qiáng)檢測的便利性，應(yīng)考慮更加便攜、直觀的檢測模式；4）目前針對檢測葉酸的熒光傳感器的研究方向較為單一，多集中于采用納米量子點(diǎn)的傳感器，且大多采用熒光猝滅法、單發(fā)射波長表征的方式，因此，研制更加多樣化的檢測葉酸的熒光傳感器是未來發(fā)展趨勢。綜上所述，檢測葉酸的傳感器展現(xiàn)出了極大的應(yīng)用潛力和市場價(jià)值，隨著進(jìn)一步的開發(fā)，該方法有望在食品檢測、生化檢查、疾病診斷等多個(gè)領(lǐng)域投入生產(chǎn)和應(yīng)用。