徐 曄，劉詩宇，王藝倫，牛淑慧，楊壹芳，余沁芯，肖子涵，劉書亮，何 利，陳姝娟，劉愛平，楊 勇*

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014）

發(fā)酵香腸是指將絞碎的肉、皮下脂肪、鹽、糖、發(fā)酵劑和各類香辛料等充分混合后灌入腸衣，在自然或人工操控的條件下，利用微生物的發(fā)酵作用，再經(jīng)過后期干燥成熟制成的具有良好貯藏性和典型發(fā)酵風(fēng)味、色澤與質(zhì)地的發(fā)酵肉制品[1]。原料肉的品質(zhì)直接影響產(chǎn)品加工過程及最終產(chǎn)品中游離氨基酸含量、微生物種類和數(shù)量，進(jìn)而影響生物胺的產(chǎn)生與積累。原料肉如果處理不當(dāng)或受到污染就會積累不同種類和數(shù)量的微生物，而這些微生物可能在加工制作前就已經(jīng)產(chǎn)生一定量的某些生物胺，隨著后期生產(chǎn)加工，原料肉帶入的某些微生物可能會繼續(xù)生長繁殖，通過脫羧作用產(chǎn)生更多生物胺，從而影響香腸的品質(zhì)及安全性[2]。發(fā)酵香腸多以降溫至0～4 ℃的肉為原料，但隨著貯藏時間的延長，原料肉中污染的嗜冷菌仍會不斷積累，在微生物和酶的共同作用下，肌肉蛋白質(zhì)發(fā)生降解，從而使揮發(fā)性鹽基氮、氨基酸態(tài)氮以及游離氨基酸含量上升[3]，而產(chǎn)生的游離氨基酸會作為生物胺的前體物質(zhì)，在微生物的作用下形成生物胺，導(dǎo)致生物胺的積累[4]。

生物胺是由氨基酸脫羧或醛和酮氨基化生成的具有生物活性的小分子質(zhì)量含氮有機(jī)化合物[5]。適量生物胺可以維持正常的內(nèi)臟功能和免疫系統(tǒng)的代謝活性[6]，然而過量的生物胺會對人體心臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等造成 損害[7]。發(fā)酵香腸中生物胺主要是由氨基酸在具有氨基酸脫羧酶活性的微生物作用下脫羧產(chǎn)生，主要有組胺、腐胺、尸胺、酪胺4 種，色胺、苯乙胺、亞精胺含量 較少[8]。Tosukhowong等[9]研究發(fā)現(xiàn)，用新鮮肉制成的發(fā)酵香腸生物胺含量均低于-20 ℃貯藏2 d、4 ℃貯藏2 d、30 ℃貯藏6 h的原料肉制成的香腸，表明原料肉的貯藏溫度和貯藏時間很可能會影響肉制品中生物胺的含量。目前相關(guān)研究多為不同貯藏條件下原料肉對香腸安全質(zhì)量的影響，而0～4 ℃貯藏不同時間的原料肉對香腸安全質(zhì)量影響的研究鮮見報道。

本研究以新鮮牛肉為原料，在0～4 ℃冷藏條件下分別貯藏不同時間（0、12、24、36 h）后制作成發(fā)酵香腸，然后分析香腸在發(fā)酵、成熟和干燥過程中微生物菌相變化以及蛋白質(zhì)降解所致含氮化合物和生物胺含量的變化，探索原料肉的貯藏時間對發(fā)酵香腸安全質(zhì)量的影響，為牛肉發(fā)酵香腸生產(chǎn)中生物胺的有效控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、菌種與試劑

新鮮牛后腿肉購于四川雅安市屠宰場，置于冰盒中迅速轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室；豬肥膘、腸衣、食鹽等調(diào)料均購于四川雅安市蒼坪山農(nóng)貿(mào)市場。

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）為四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院肉品科學(xué)與技術(shù)實(shí)驗(yàn)室從川味香腸中篩選出的肉品發(fā)酵菌株。

PCA、MRS、PDA、VR生物胺合成培養(yǎng)基 雅安萬科有限責(zé)任公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 美國Omega公司；生物胺標(biāo)準(zhǔn)品、丹磺酰氯等 美國Sigma公司；乙腈、丙酮、甲醇（色譜純） 成都化學(xué)試劑有限公司；蒸餾水和超純水為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

BCD-539WDCO型電冰箱 青島海爾股份有限 公司；SYQ-DSX-280型高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械有限公司；BMS602型均質(zhì)機(jī) 德國BRT公司；LHS-250SC型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海榮豐科學(xué)儀器有限公司；LC-2010CHT型高效液相色譜儀、LC-solution型工作站 日本島津公司；Sorvall ST 16R型高速冷凍離心機(jī) 美國Thermo Fisher Scientific公司；LA8080型超高速全自動氨基酸分析儀 日本日立高新技術(shù)公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵牛肉香腸的制作

將牛肉切割成5 cm×2 cm×2 cm的肉條，分成4 份置于無菌的自封袋內(nèi)，于0～4 ℃冰箱中分別貯藏0、12、24、36 h，得到4 種不同貯藏時間的原料牛肉，參考鞏洋等[10]的配方和工藝流程制作為香腸。以植物乳桿菌作為發(fā)酵劑，接種量為107CFU/g。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后，確定發(fā)酵香腸的加工工藝參數(shù)為：發(fā)酵溫度18 ℃、相對濕度70%、時間8 h；成熟溫度13 ℃、相對濕度55%、時間120 h；干燥溫度55 ℃、時間24 h。

1.3.2 樣品的采集

參考鞏洋等[10]的樣品采集方式，在發(fā)酵香腸的生產(chǎn)過程中共設(shè)置5 個采樣點(diǎn)，分別為：原料肉（剛采購回實(shí)驗(yàn)室的新鮮牛肉以及不同時間貯藏處理后的牛肉）、發(fā)酵結(jié)束（從發(fā)酵工藝開始，至發(fā)酵8 h為止）、成熟中期（從發(fā)酵工藝結(jié)束開始，至成熟60 h為止）、成熟結(jié)束（從發(fā)酵工藝結(jié)束開始，至成熟120 h為止）、干燥結(jié)束（從成熟工藝結(jié)束開始，至干燥24 h為止）。每個采樣點(diǎn)各取3 份樣品（200 g左右），將用于高通量測序的樣品迅速保存于-80 ℃冰箱內(nèi)，其余指標(biāo)測定需立即進(jìn)行。

1.3.3 菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)的測定

菌落總數(shù)的測定參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》[11]。

大腸菌群數(shù)的測定參照GB 4789.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群測定》[12]中的第二法，即大腸菌群平板計(jì)數(shù)法。

1.3.4 高通量測序檢測微生物多樣性

細(xì)菌總DNA的提?。翰捎眉?xì)菌組DNA提取試劑盒提取樣品細(xì)菌的總DNA。經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，于-20 ℃條件貯藏備用。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增：擴(kuò)增體系（25 μL）：5×反應(yīng)緩沖液5 μL、5×GC緩沖液5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）2 μL、正向引物（10 μmol/L）1 μL、反向引物（10 μmol/L）1 μL、DNA模板2 μL、雙蒸水8.75 μL、Q5 DNA 聚合酶0.25 μL。擴(kuò)增參數(shù)：預(yù)變性98 ℃ 2 min；變性98 ℃ 15 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，25～30 次循環(huán)；最終延伸72 ℃ 5 min。

高通量測序：提取的樣品DNA送至上海派森諾公司進(jìn)行Illumina Miseq高通量測序，測序區(qū)域?yàn)榧?xì)菌16S rDNA的V3～V4可變區(qū)，引物為：338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’），擴(kuò)增片段長度約為500 bp。基因序列的生物信息學(xué)分析[13]：1）操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類和物種分類分析：提取非重復(fù)序列，與數(shù)據(jù)庫中的16S核糖體序列進(jìn)行比對，相似性在97%以上的序列歸并，生成OTU；2）菌群分類學(xué)分析：將OTU中全部序列與Silva數(shù)據(jù)庫[14]進(jìn)行比對，找出其最相近且可信度達(dá)80%以上的種屬信息。并將每一個OTU中的所有序列進(jìn)行類比，找出同一OTU中不同序列最近祖先的種屬信息。根據(jù)Silva數(shù)據(jù)庫中的參考序列對OTU進(jìn)行種屬鑒定；根據(jù)分類學(xué)分析比對結(jié)果，在各個分類水平上對樣品中群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行菌群種類和豐度分析。

1.3.5 含氮化合物含量測定

1.3.5.1 總揮發(fā)性鹽基氮含量測定

總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量參照 GB 5009.228—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[15]中第二法進(jìn)行測定，單位為mg/100 g。

1.3.5.2 氨基酸態(tài)氮含量測定

氨基酸態(tài)氮（amino acid nitrogen，AAN）含量參照GB 5009.235—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測定》[16]中第一法進(jìn)行測定，單位為g/100 g。

1.3.5.3 游離氨基酸含量測定

游離氨基酸（free amino acids，F(xiàn)AA）含量的測定參考Lorenzo等[17]的方法，超高速全自動氨基酸分析儀上機(jī)檢測之前通過0.22 μm的過濾器進(jìn)行樣品的注射過濾。

1.3.6 生物胺含量測定

參考張楠等[18]的方法，樣品經(jīng)丹磺酰氯丙酮溶液進(jìn)行柱前衍生后，采用高效液相色譜法測定其中生物胺含量，單位為mg/kg。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

本研究所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)3 次重復(fù)，結(jié)果表示為平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差，所有涉及含量的結(jié)果均以干質(zhì)量計(jì)。采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析，P＜0.05為顯著性差異。使用Microsoft Excel 2007軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛肉貯藏時間對牛肉發(fā)酵香腸中微生物的影響

2.1.1 菌落總數(shù)

圖 1 牛肉發(fā)酵香腸加工過程中菌落總數(shù)的變化Fig. 1 Changes in total bacterial count of fermented beef sausages during processing

由圖1可知，在香腸加工過程中，4 組香腸中菌落總數(shù)均呈先上升后下降的趨勢，這是因?yàn)橄隳c發(fā)酵階段溫度較高、濕度較大，利于微生物的生長繁殖，而成熟階段溫度、水分含量的降低以及發(fā)酵劑產(chǎn)生大量酸，導(dǎo)致香腸內(nèi)pH值下降，微生物的生長繁殖受到抑制。對比不同處理組可知，發(fā)酵香腸中的菌落總數(shù)隨原料肉貯藏時間的延長而增加，貯藏36 h組的菌落總數(shù)均顯著高于其他3 組（P＜0.05），說明牛肉在0～4 ℃貯藏過程中仍有微生物不斷積累。其中，貯藏36 h牛肉與未經(jīng)貯藏牛肉加工的香腸對比，菌落總數(shù)平均值由2.40×107CFU/g增加到4.03×107CFU/g（P＜0.05）。

2.1.2 大腸菌群數(shù)

大腸菌群數(shù)是衡量原料肉衛(wèi)生質(zhì)量與腸道致病菌的重要指標(biāo)[19]。由圖2可知，在香腸加工過程中，4 組香腸中大腸菌群數(shù)均呈先上升再下降，最后降為0的趨勢， 干燥階段降為0是因?yàn)?5 ℃、24 h的干燥環(huán)境會使大腸菌群失活或死亡。對比不同處理組可知，貯藏0 h組在整個加工過程中大腸菌群數(shù)最低，且顯著低于貯藏36 h組 （P＜0.05）。結(jié)果表明，未經(jīng)貯藏的原料牛肉制作的發(fā)酵香腸中大腸菌群數(shù)一直處于最低水平。

圖 2 牛肉發(fā)酵香腸加工過程中大腸菌群數(shù)的變化Fig. 2 Changes in coliform count of fermented beef sausages during processing

2.1.3 高通量測序檢測微生物結(jié)果

圖 3 細(xì)菌16S rDNA的V3～V4區(qū)PCR產(chǎn)物電泳圖Fig. 3 Electrophoresis of polymerase chain reaction products of the V3-V4 region of bacterial 16S rDNA

由圖3可知，對細(xì)菌的V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，6 個樣品均擴(kuò)增成功，擴(kuò)增片段長度約為500 bp，回收濃度均高于后續(xù)建庫要求。將0～4 ℃貯藏0 h和36 h的牛肉分別制作發(fā)酵香腸，分別采集不同加工階段的樣品進(jìn)行微生物的高通量測序分析，結(jié)果見表1。

表 1 牛肉發(fā)酵香腸菌群多樣性指數(shù)Table 1 Bacterial diversity indexes of fermented beef sausages

Chao1和ACE指數(shù)均為豐富度指數(shù)，用來估計(jì)群落中實(shí)際存在的物種數(shù)，指數(shù)越大，表明群落豐富度越高；Shannon和Simpson指數(shù)均為多樣性指數(shù)，分別用來估計(jì)群落的豐富度和均勻度，值越大，表明群落多樣性 越高[21-23]。由表1可知，B1、B2、B3的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)整體上高于A1、A2、A3，說明貯藏36 h牛肉制作的香腸中微生物群落豐富度更高；B1、B2、B3的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均高于A1、A2、A3，說明貯藏36 h牛肉制作的香腸中微生物群落多樣性更高。其中，貯藏36 h牛肉與未經(jīng)貯藏牛肉加工的香腸相比Shannon指數(shù)平均值由1.39增長為2.89。

圖 4 牛肉發(fā)酵香腸中微生物基于門水平上的變化Fig. 4 Changes in bacterial community composition in fermented beef sausages at the phylum level

圖 5 牛肉發(fā)酵香腸中微生物基于屬水平上的變化Fig. 5 Changes in bacterial community composition in fermented beef sausages at the genus level

根據(jù)OTU劃分和分類鑒定結(jié)果，可以獲得每個樣本在門、屬水平的具體組成，結(jié)果分別如圖4、5所示。在門水平，A組中厚壁菌門（Firmicutes）豐度最高，B組中變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）相對豐度最高，變形菌門包括較多病原菌，如大腸桿菌、沙門氏菌等。Santos等[24]研究的30 株大腸桿菌均有鳥氨酸和賴氨酸脫羧酶活性，經(jīng)脫羧作用可以將鳥氨酸和賴氨酸轉(zhuǎn)化為腐胺和尸胺。在屬水平，A組中葡萄球菌屬（Staphylococcusspp.）占比最高。葡萄球菌常存在于發(fā)酵肉制品中，可降解蛋白質(zhì)、脂肪以促進(jìn)風(fēng)味物質(zhì)的形成，消除過氧化氫[25]，有研究證實(shí)葡萄球菌屬微生物還具有降解生物胺的能力[26]。B1、B2中魏斯氏菌屬（Weissellaspp.）相對豐度最高，魏斯氏菌已被證實(shí)為發(fā)酵食品中的產(chǎn)胺菌[27]。Takebe等[28]研究表明從日本豆腐醬中分離得到的魏斯氏菌均為生物胺產(chǎn)生菌，且均具有酪氨酸脫羧酶基因和組氨酸脫羧酶基因。Pereira等[29]選擇一株既能發(fā)生鳥氨酸脫羧反應(yīng)，又能發(fā)生精氨酸脫羧反應(yīng)的魏斯氏菌（Weissella halotoleransW22）進(jìn)行研究，結(jié)果表明這株菌具有反轉(zhuǎn)運(yùn)精氨酸、產(chǎn)生腐胺的作用，從而導(dǎo)致肉制品中腐胺的產(chǎn)生與積累。B3中葡萄球菌屬相對豐度最高。綜上所述，貯藏0 h牛肉制作的香腸在加工過程中優(yōu)勢菌群為多具有降解生物胺能力的葡萄球菌；貯藏36 h牛肉制作的香腸在發(fā)酵階段優(yōu)勢菌群為魏斯氏菌，成熟階段優(yōu)勢菌群為葡萄球菌，其中魏斯氏菌可能與生物胺形成有關(guān)。

2.2 原料肉貯藏時間對牛肉發(fā)酵香腸中含氮化合物含量的影響

2.2.1 對牛肉發(fā)酵香腸中TVB-N含量的影響

圖 6 牛肉發(fā)酵香腸加工過程中TVB-N含量的變化Fig. 6 Changes in TVB-N content of fermented beef sausages during processing

TVB-N指動物性食品在腐敗過程中，酶和細(xì)菌的作用使得蛋白質(zhì)分解而產(chǎn)生氨及胺類等堿性含氮物質(zhì)，其含量越高，表明氨基酸被破壞得越多[30]。由圖6可知，在香腸加工工程中，4 組香腸中TVB-N含量均呈上升趨勢，這是因?yàn)橄隳c發(fā)酵和成熟過程中，微生物產(chǎn)生的蛋白酶和氨基酸脫羧酶等不斷分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨和胺類物質(zhì)，而這些化合物通常具有揮發(fā)性；對比不同處理組可知，同一加工階段時貯藏0 h組中TVB-N含量（6.49～19.78 mg/100 g）顯著低于貯藏36 h組（8.41～32.34 mg/100 g）（P＜0.05），可能是因?yàn)殡S著貯藏時間延長，微生物數(shù)量增加，產(chǎn)生的蛋白酶較多，蛋白質(zhì)在其作用下產(chǎn)生的TVB-N也較多。

2.2.2 對牛肉發(fā)酵香腸中ANN含量的影響

由圖7可知，在香腸加工過程中，4 組香腸中含量大體呈緩慢上升再趨于穩(wěn)定的規(guī)律，這可能是由于前期蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生游離氨基酸和多肽，后期氨基酸和多肽會在微生物和酶的作用下進(jìn)一步降解或脫羧、脫氨生成醛酮等小分子化合物，使得AAN含量變化不明顯。對比不同處理組可知，貯藏0 h組中AAN含量（最高為0.28 g/100 g，最低為0.15 g/100 g）顯著低于貯藏36 h組（最高為0.38 g/100 g，最低為0.29 g/100 g）（P＜0.05）， 可能是因?yàn)橘A藏時間的延長導(dǎo)致細(xì)胞中水分滲出，原料肉中水分含量減少，制作的香腸中鹽含量相對增大，脫羧酶活性受到抑制，同時微生物大量生長繁殖，蛋白質(zhì)在其作用下降解產(chǎn)生氨基酸等小分子化合物[31]， 使得氨基酸大量積累，AAN含量增多，這與本研究中菌落總數(shù)的變化結(jié)果一致。

圖 7 牛肉發(fā)酵香腸加工過程中AAN含量的變化Fig. 7 Changes in amino acid nitrogen content of fermented beef sausages during processing

2.2.3 對牛肉發(fā)酵香腸中FAA含量的影響

表 2 牛肉發(fā)酵香腸加工過程中FAA含量的變化Table 2 Changes in free amino acid contents of fermented beef sausages during processing mg/g

香腸中的蛋白質(zhì)在微生物作用下能分解產(chǎn)生較多FAA，其能夠在具有氨基酸脫羧酶活性的微生物作用下脫羧形成生物胺，F(xiàn)AA含量既能反映蛋白質(zhì)降解程度，又可反映生物胺的生成與積累情況[32]。其中酪氨酸、組氨酸、賴氨酸分別為酪胺、組胺、尸胺的前體物質(zhì)， 鳥氨酸、精氨酸為腐胺的前體物質(zhì)。由表2可知，在香腸加工過程中，4 組香腸中組氨酸、賴氨酸、鳥氨酸和總FAA含量均呈上升趨勢。在原料肉階段，貯藏0 h組中鳥氨酸、賴氨酸、精氨酸、總FAA含量均高于貯藏36 h組；在發(fā)酵結(jié)束階段，貯藏0 h組中鳥氨酸、總FAA含量均高于貯藏36 h組；在干燥結(jié)束階段，貯藏0 h組中鳥氨酸、組氨酸、總FAA含量均高于貯藏36 h組。對比不同處理組可知，貯藏時間越長，F(xiàn)AA含量越低，這可能是因?yàn)橘A藏36 h組的香腸在發(fā)酵階段中優(yōu)勢菌群為魏斯氏菌，在其產(chǎn)生的氨基酸脫羧酶作用下，可以將某些FAA如鳥氨酸、精氨酸、組胺酸等作為生物胺的前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化成生物胺[28]， 從而導(dǎo)致貯藏36 h組中FAA含量低于0 h組。其中，貯藏36 h牛肉加工的香腸與未經(jīng)貯藏牛肉加工的香腸對比，總FAA含量平均值由7.09 mg/g減少至6.44 mg/g。

2.3 原料肉貯藏時間對牛肉發(fā)酵香腸中生物胺含量變化的影響

表 3 牛肉發(fā)酵香腸加工過程中生物胺含量的變化Table 3 Changes in biogenic amine contents of fermented beef sausages during processing

由表3可知，香腸中的生物胺主要有酪胺、組胺、尸胺、腐胺，其中酪胺含量最高，腐胺含量最低，而色胺、苯乙胺、亞精胺的含量較低。香腸的加工過程中酪胺含量呈上升趨勢，組胺、腐胺和尸胺含量呈下降趨勢。對比不同處理組可知，貯藏36 h組中酪胺、組胺、尸胺、腐胺以及總生物胺含量顯著高于貯藏0 h組 （P＜0.05）。其中，貯藏0 h牛肉制作的發(fā)酵香腸中總生物胺含量平均值為92.14 mg/kg；貯藏36 h牛肉制作的香腸中總生物胺含量平均值為117.42 mg/kg。貯藏0 h組中

優(yōu)勢菌群為具有生物胺降解能力的葡萄球菌屬，能夠降解已生成的生物胺，這可能是貯藏0 h組中總生物胺含量顯著低于36 h組的原因之一。貯藏36 h組中酪胺、尸胺、總生物胺含量在發(fā)酵階段增多，在成熟階段減少，這可能是在貯藏36 h組中原料肉和香腸發(fā)酵階段的優(yōu)勢菌為能夠產(chǎn)生物胺的魏斯氏菌，成熟階段生物胺含量升高為葡萄球菌造成的。在干燥結(jié)束后酪胺的含量最高，為主要的生物胺，這可能是因?yàn)橄隳c在55 ℃環(huán)境下干燥，使得酪氨酸殘基暴露，酪胺前體物質(zhì)增多[33]。綜上所述，控制原料肉的貯藏時間可以有效抑制發(fā)酵香腸中生物胺的積累，從而有效控制其中生物胺含量，保障產(chǎn)品的安全性。

2.4 原料肉貯藏時間對香腸成熟階段中微生物數(shù)量、含氮化合物含量與生物胺含量相關(guān)性的影響

表 4 成熟階段牛肉發(fā)酵香腸中生物胺與微生物、含氮化合物 指標(biāo)之間的皮爾遜相關(guān)系數(shù)Table 4 Pearson’s correlation coefficients of biogenic amines with microbial load and nitrogen-containing compound contents during the ripening of fermented beef sausages

由表4可知，香腸成熟階段中菌落總數(shù)與組胺、尸胺、總生物胺含量之間呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.745、0.846、0.847；大腸菌群數(shù)與組胺含量之間呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)為0.902；TVB-N含量與尸胺、總生物胺含量之間呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.762、0.772；AAN含量與組胺、總生物胺含量之間呈極顯著正相關(guān) （P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.924、0.721。綜上所述，香腸成熟階段中微生物數(shù)量與生物胺含量多呈正相關(guān)，這可能是因?yàn)橘A藏過程中仍有一些具有適應(yīng)低溫的耐冷細(xì)菌的積累，如假單胞菌屬、微球菌屬、嗜冷桿菌屬，其中假單胞菌為產(chǎn)胺菌，所以貯藏后的原料肉中已經(jīng)存在與生物胺產(chǎn)生密切相關(guān)的微生物，其在香腸成熟階段大量生長，對生物胺的產(chǎn)生起到較大作用；原料肉貯藏時間對香腸成熟階段中TVB-N含量與生物胺含量相關(guān)性的影響較強(qiáng)，這可能是因?yàn)榕Ｈ庵械牡鞍踪|(zhì)在耐冷微生物作用下降解為TVB-N。

3 討 論

原料肉貯藏時間對牛肉發(fā)酵香腸中菌群結(jié)構(gòu)變化的影響較為顯著（P＜0.05）。未經(jīng)貯藏牛肉制作的 香腸中菌落總數(shù)、大腸菌群數(shù)顯著低于貯藏36 h牛肉制作的香腸（P＜0.05），這與?oban等[34]對鯉魚香腸中微生物數(shù)量變化的研究結(jié)果一致，這是因?yàn)?～4 ℃環(huán)境中微生物生長繁殖雖然受到抑制，但其細(xì)胞結(jié)構(gòu)并未破壞，不會很快造成死亡并能在較長時間內(nèi)保持活力，當(dāng)溫度升高時，微生物又可以恢復(fù)正常生命活動。還有一些耐冷細(xì)菌，如假單胞菌屬、微球菌屬、嗜冷桿菌屬具有適應(yīng)低溫環(huán)境的生長能力[35]；貯藏36 h牛肉制作的香腸中微生物群落豐富度和多樣性均高于未經(jīng)貯藏牛肉制作的香腸，這與滕安國等[13]關(guān)于腐敗香腸中微生物豐富度和多樣性高于新鮮香腸的研究結(jié)果一致；未經(jīng)貯藏牛肉制作的香腸中優(yōu)勢菌群一直為葡萄球菌（Staphylococcus），貯藏36 h牛肉及制作的香腸在發(fā)酵階段優(yōu)勢菌群為魏斯氏菌（Weissella），成熟階段優(yōu)勢菌群為葡萄球菌（Staphylococcus），這與Wang Xinhui等[36]研究的自然發(fā)酵四川臘腸成熟過程中優(yōu)勢菌群為魏斯氏菌的結(jié)果不一致，這可能是因?yàn)槲核故暇?5 ℃環(huán)境下生長便會受到抑制[37]，而本研究中成熟溫度為13 ℃；這與張巍[38]研究的接種發(fā)酵香腸成熟過程中優(yōu)勢菌群為葡萄球菌這一結(jié)果一致，說明接種發(fā)酵劑且控溫控濕的加工工藝可以有效抑制魏斯氏菌的生長繁殖，使得優(yōu)勢菌群變?yōu)槠咸亚蚓?/p>

原料肉貯藏時間對牛肉發(fā)酵香腸中含氮化合物含量變化的影響較為顯著（P＜0.05），隨著牛肉貯藏時間的延長，制作的發(fā)酵香腸中TVB-N、AAN含量增多，總FAA含量減少。這與Zhang Xin等[39]對意大利香腸中TVB-N含量變化規(guī)律的研究結(jié)果一致，與張楠[40]對川味香腸中AAN含量的變化研究結(jié)果一致，這可能是因?yàn)榕Ｈ赓A藏時間較長，細(xì)胞中水分滲出，水分含量降低，制作的香腸中鹽含量相對增大，脫羧酶活性受到抑制，同時微生物大量生長繁殖，降解蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨基酸等小分子化合物，使得氨基酸大量積累，TVB-N和AAN含量增多，同時微生物的大量繁殖使得FAA轉(zhuǎn)化為生物胺，F(xiàn)AA含量相應(yīng)減少。與韋友兵等[41]研究的薩拉米香腸中FAA含量在加工過程中先增加后降低的結(jié)果不一致，可能是因?yàn)樵撗芯恐邢隳c的原材料沒有進(jìn)行4 ℃貯藏處理，而且香腸的加工工藝條件也不一樣。

香腸的加工過程中，組胺、腐胺和尸胺含量呈下降趨勢，該結(jié)果與孫霞等[42]對傳統(tǒng)自然發(fā)酵四川香腸加工貯藏過程中這3 種生物胺含量顯著增加的研究結(jié)果不一致。這可能與香腸中微生物群落豐富度和多樣性隨著加工的進(jìn)行而降低有關(guān)（貯藏0 h組：Chao1和ACE指數(shù)分別由234.63、251.83降低到226.94、239.35，Shannon和Simpson指數(shù)分別由1.66、0.384433降低到1.48、0.309312；貯藏36 h組：Chao1和ACE指數(shù)分別由365.03、355降低到237、237，Shannon和Simpson指數(shù)分別由3.07、0.655673降低到2.17、0.440064）；也可能 與所采用的香腸加工工藝有關(guān)，孫霞等[42]采用的自然發(fā)酵工藝成熟時間較長，而本研究為人工控溫控濕條件，且發(fā)酵成熟時間較短；原料肉貯藏時間對牛肉發(fā)酵香腸中生物胺含量變化的影響較為顯著（P＜0.05），未經(jīng)貯藏牛肉制作的香腸中酪胺、組胺、尸胺、腐胺含量均低于貯藏36 h牛肉制作的香腸，這與Tosukhowong等[9]研究發(fā)現(xiàn)泰國發(fā)酵香腸中生物胺含量的變化結(jié)果一致，也與本研究中貯藏36 h牛肉及制作的香腸在發(fā)酵階段的優(yōu)勢菌群是多具有產(chǎn)生物胺能力的魏斯氏菌結(jié)果一致。說明貯藏后的牛肉中具有氨基酸脫羧酶活性的微生物大量繁殖，經(jīng)脫羧作用將FAA轉(zhuǎn)化為生物胺。

4 結(jié) 論

隨著原料肉在0～4 ℃條件下貯藏時間的延長，發(fā)酵香腸加工過程中菌落總數(shù)、大腸菌群數(shù)、菌群多樣性以及TVB-N、AAN含量均呈上升趨勢。貯藏0 h牛肉制作的發(fā)酵香腸在加工過程中的優(yōu)勢菌群為葡萄球菌，總生物胺含量平均值為92.14 mg/kg；貯藏36 h牛肉制作的香腸在發(fā)酵階段優(yōu)勢菌群為魏斯氏菌，成熟階段優(yōu)勢菌群為葡萄球菌，加工過程中總生物胺含量平均值為 117.42 mg/kg。因此，通過縮短原料肉貯藏時間可以有效減少發(fā)酵香腸中微生物數(shù)量，降低菌群多樣性和豐富度，抑制蛋白質(zhì)的降解，減少生物胺的產(chǎn)生，從而提高發(fā)酵香腸的食用安全性。