牙甫禮，張春梅，陳彬林，谷仕艷，賈小娥

（1.大理大學公共衛(wèi)生學院，預防醫(yī)學研究所，云南 大理 671000；2.河口海關，云南 河口 661300；3.廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院營養(yǎng)科，廣西 南寧 530000）

心血管疾病的發(fā)病率和死亡率逐年上升，已經成為威脅我國人民健康的主要問題和突出的公共衛(wèi)生問題，動脈粥樣硬化和血栓形成是心血管疾病共同的病理變化[1]。誘發(fā)動脈粥樣硬化性心血管疾?。╝therosclerotic cardiovascular disease，ASCVD）的危險因素很多，主要包括年齡、血脂紊亂、肥胖、糖尿病等。近年來大量報道證明血小板在ASCVD病程中具有重要作用[2-3]。

血小板是成熟巨核細胞上脫落下來的細胞質碎片，是循環(huán)血液中的一種有形細胞，其主要生理功能是參與止血和凝血[4]。然而，當血小板受到病理性刺激時，尤其在心血管疾病中，血小板可發(fā)生激活、聚集以及釋放炎癥因子等參與動脈粥樣硬化和血栓的發(fā)生和發(fā)展過程，進而在ASCVD病程中發(fā)揮重要作用[5-6]。在血小板發(fā)生活化的過程中，其生成的血栓素A2（thromboxane A2，TxA2）被認為是促進動脈粥樣硬化和血栓形成的重要物質，抑制血小板TxA2生成對于防治心血管疾病中血栓的形成至關重要[7-8]。在冠心病、糖尿病和高脂血癥等疾病中，血小板受到血液中可溶性激動劑如凝血酶和二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）等刺激時，胞內眾多復雜的信號通路被激活，最終可促進TxA2生成[7]。TxA2半衰期很短（約30 s）且極不穩(wěn)定，其生成后在半衰期內可通過自分泌和旁分泌的方式作用于鄰近血小板、白細胞和內皮細胞等細胞表面的凝血惡烷前列腺素類（thromboxane prostanoid，TP）受體，進而介導一系列炎癥反應，如激活血小板、對血小板聚集和炎癥因子的釋放發(fā)揮放大效應，進而參與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程[8-9]。隨后，TxA2立即被代謝生成穩(wěn)定形式的血栓素B2（thromboxane B2，TxB2），TxB2從血小板釋放出后可進一步作用于其鄰近的細胞，參與動脈粥樣硬化和血栓形成[7]。由于TxB2較為穩(wěn)定，血小板釋放的TxB2水平常可用來反映胞內TxA2生成情況[10-11]。血小板中TxA2生成受多種信號蛋白分子的調控，血小板激動劑如凝血酶、ADP和膠原等通過激活血小板表面相應的受體，進而激活胞內一系列的信號通路，導致胞漿型磷脂酶A2（cytosolic phospholipase A2，cPLA2）發(fā)生磷酸化，使得花生四烯酸從細胞膜磷脂釋放出，最終在環(huán)氧合酶（cyclooxygenase，COX）和過氧化酶作用下生成TxA2；因此，cPLA2的活化在調控TxA2生成的過程中起關鍵作用[7]。

cPLA2的活化受多種信號通路的調控，其中蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPKs）介導的信號通路在其中發(fā)揮重要的調控作用[12-13]。研究表明，PKA信號通路對于負性調控血小板功能發(fā)揮著重要作用，激活該信號通路可使血小板血管擴張刺激磷蛋白酶發(fā)生磷酸化，進而抑制cPLA2磷酸化、血小板TxA2生成和顆粒物的釋放等，從而抑制血小板聚集、活化和血栓形成[14]。 另外，PKA也可通過抑制鈣離子動員和MAPKs信號通路（包括細胞外調節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）1/2、c-Jun氮端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）1/2和p38 MAPK）發(fā)揮抑制cPLA2磷酸化和TxA2生成的作用[7,13]。

營養(yǎng)膳食干預在心血管疾病，尤其是動脈粥樣硬化和血栓性疾病的早期防治中起著重要的作用[15]。輔酶Q10（coenzyme Q10，CoQ10）是一種類似于維生素的脂溶性苯醌，在動物臟器（心臟、肝臟、腎臟）、牛肉、豆油、花生等食物中含量相對較高[16]。大量的流行病學、臨床實驗、動物實驗和體外細胞實驗表明，CoQ10具有抑制心血管疾病、糖尿病、神經退行性疾病、線粒體疾病等的作用，其機制主要包括抗炎、抗氧化、調節(jié)糖脂代謝紊亂和改善內皮細胞等[17]。關于CoQ10對血小板功能調控作用的研究較少，僅有部分研究發(fā)現靜脈注射外源性CoQ10能顯著降低小腸缺血性再灌注動物模型的血小板活化與聚集[18]；健康成人每天服用100 mg CoQ10可以顯著減小外周血中血小板體積，并能顯著降低血小板整合素αVβ3受體的表達[19]。本課題組前期進行的體外實驗、動物實驗與人群干預研究結果表明，CoQ10可抑制激動劑誘導的人和小鼠血小板聚集和活化以及血栓形成，其中的機制可能是CoQ10抑制血小板整合素αIIbβ3介導的信號通路和上調cAMP/PKA信號通路[20-22]。但目前CoQ10是否影響血小板TxA2的生成尚鮮見報道，因此本研究通過體外實驗探討CoQ10對血小板TxA2生成的影響及其調控機制，為CoQ10防治心血管疾病提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CoQ10粉末（純度≥98%）、凝血酶（活 力≥2000 NIH units/mg）、PKA特異性抑制劑H89 美國 Sigma-Aldrich公司；膠原 美國Chrono-log公司；Convulxin、苯乙酮 德國Cayman Chemical公司；一抗phospho-cPLA2（Ser505）、β-actin以及二抗羊抗兔 美國Cell Signaling Technology公司；TxB2檢測試劑盒 美國Enzo Life Sciences公司；雙辛丁酸（bicinchonic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒 中國Beyotime 公司。其他試劑均為色譜級（純度≥95%），實驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設備

21號一次性采血針、真空負壓采血管和一次性注射器 湖南瀏陽市醫(yī)用儀器廠；低溫高速離心機 德國Eppendorf公司；小型高速離心機 美國Grant-Bio公司；多功能酶標儀 德國BMG LabTech公司；低溫冰箱 青島 海爾有限公司；萬分之一分析天平 瑞士Swiss公司。

1.3 方法

1.3.1 研究對象的篩選

從大理大學校內招募15 名健康成年志愿者（年齡25～40 歲），志愿者要求在至少2 周內未服用任何抗血小板的藥物（包括臨床上常用于治療血栓性疾病的藥物，如阿司匹林、P2Y12受體拮抗劑、αIIbβ3受體抑制劑和磷酸二酯酶抑制劑等），至少近4 周內無每天飲用茶、咖啡和紅酒，且近半年內未補充CoQ10、維生素等膳食營養(yǎng)補充產品；無吸煙（指每天吸卷煙≥1 支，且持續(xù)或累計6 個月）、酗酒（指成年男性每日飲酒量超過25 g，女性超過15 g）等不良生活習慣。志愿者出現以下至少1 種情況將予以排除，包括現在或既往患有冠心病、中風、糖尿病、高血壓、高血脂、免疫缺陷病、惡性腫瘤、血小板功能障礙等血液系統(tǒng)疾病等病史；或者濫用藥物、酗酒、吸煙半年以上；或現正服用或半年內服用任何影響血小板功能的藥物等。該研究實施前，每個志愿者均已簽署知情同意書，且該研究已通過大理大學倫理委員會批準，并完全按照赫爾辛基宣言和體制準則進行。

1.3.2 健康人血樣及純化血小板的制備

健康志愿者在清晨空腹狀態(tài)下，采用21號一次性采血針，抽取肘靜脈血15 mL，注入含枸櫞酸鈉的真空抗凝管中（V（血樣）∶V（抗凝劑）＝9∶1），輕輕混勻，室溫下靜置15 min后離心（300×g、7 min、22 ℃），為避免吸到白細胞層和紅細胞層，小心吸取上層3/4體積的上清液即可得到富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP），剩余血樣離心（10000×g、15 min、22 ℃），小心吸取上清液得到貧血小板血漿（platelet poor plasma，PPP），PRP和PPP放入37 ℃恒溫孵育箱中備用。純化血小板的制備過程采用本實驗室成熟的純化血小板分離方法[21-23]，通過Sepharose CL-2B凝膠系統(tǒng)純化PRP進行純化血小板的制備。

1.3.3 實驗分組

本研究涉及的實驗組別有：靜息組：既不經激動劑（如凝血酶、膠原和Convulxin）激活，也不經二甲基亞砜 （dimethyl sulfoxide，DMSO）處理；DMSO組：即溶劑對照組，在血小板懸液中加入體積分數0.05%的DMSO；CoQ10組：分別經1、10 μmol/L和100 μmol/L CoQ10處理；苯乙酮組：血小板經1 μmol/L的苯乙酮處理；CoQ10+苯乙酮組：血小板經100 μmol/L CoQ10和1 μmol/L的苯乙酮聯(lián)合處理；H89組：血小板經10 μmol/L的H89處理；CoQ10+H89組：血小板經100 μmol/L CoQ10和10 μmol/L的H89聯(lián)合處理。除了靜息組外，其他各組血小板均經激動劑誘導激活。

1.3.4 血小板TxB2釋放水平的檢測

血小板TxB2釋放水平的檢測采用酶聯(lián)免疫吸附法進行檢測。用不同濃度（1、10、100 μmol/L）的CoQ10或溶劑對照與健康成人純化血小板（1×108個/mL）在體外共同孵育50 min，然后加入1 mmol/L的CaCl2溶液，用0.5 U/mL 的凝血酶或2 μg/mL的膠原或50 ng/mL的Convulxin激活血小板5 min后，放于冰上終止反應，然后離心（10000×g、15 min、4 ℃），收集上清液，-80 ℃保存?zhèn)溆?，用于檢測血小板釋放TxB2水平。

進一步在cPLA2特異性抑制劑苯乙酮或者PKA特異性抑制劑H89存在的條件下，考察CoQ10對TxA2生成水平的調控作用。1 μmol/L苯乙酮或10 μmol/L H89提前與血小板共同孵育30 min，然后用100 μmol/L CoQ10或溶劑對照與血小板共同孵育50 min，并加入1 mmol/L CaCl2溶液，用0.5 U/mL凝血酶或者2 μg/mL膠原激活血小板5 min后，放于冰上終止反應，然后離心（10000×g、15 min、4 ℃），收集上清液，檢測血小板釋放的TxB2水平。

1.3.5 蛋白免疫印跡法檢測蛋白表達水平

用不同濃度（1、10、100 μmol/L）的CoQ10或者溶劑對照與健康成人純化血小板（2.5×108個/mL）在體外共同孵育50 min，然后加入1 mmol/L CaCl2溶液，用0.5 U/mL的凝血酶或2 μg/mL的膠原激活血小板5 min后，放于冰上終止反應，然后離心（10000×g、15 min、4 ℃），棄上清液。向血小板沉淀中加入細胞裂解液和蛋白酶抑制劑，然后置于冰上裂解30 min，離心（12000×g、15 min、4 ℃），收集上清液得到血小板蛋白，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質量濃度后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜后分別加入一抗（phospho-cPLA2、β-actin）和二抗，然后用自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)對條帶曝光，并用Quantity One軟件分析條帶灰度，計算蛋白表達相對表達量[21-23]。

1.4 數據處理與分析

實驗結果用平均值±標準差表示，用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件采用單因素方差分析進行多組間比較，采用Bonferroni Post-hoc Analysis法進行組間兩兩比較，雙側P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義；同時采用GraphPad Prism 5.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 CoQ10對激動劑誘導的血小板TxA2生成的影響

圖 1 CoQ10對激動劑誘導的血小板TxA2生成的影響Fig. 1 Effect of CoQ10 on agonist-induced platelet TxA2 generation

由于激動劑激活血小板生成的TxA2不穩(wěn)定，極易被代謝生成穩(wěn)定的代謝物TxB2，因此通常檢測TxB2的水平，用TxB2質量濃度反映血小板TxA2的生成情況[10-11]。如圖1A～C所示，通過酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測發(fā)現，與靜息組相比，DMSO組TxB2質量濃度高度顯著升高（P＜0.001）， 表明血小板激動劑凝血酶、膠原和糖蛋白VI激動劑Convulxin激活后血小板TxA2生成水平顯著提高。經不同濃度CoQ10預處理后，與DMSO組相比，雖然1 μmol/L CoQ10對凝血酶和膠原誘導的血小板TxA2生成水平沒有顯著影響（P＞0.05），但是10 μmol/L和100 μmol/L的CoQ10可顯著降低血小板TxA2生成水平（P＜0.05、P＜0.01）。 在Convulxin刺激下，僅100 μmol/L的CoQ10可極顯著抑制血小板TxA2生成水平（P＜0.01）。以上結果表明，CoQ10可顯著抑制激動劑誘導的血小板TxA2生成。

2.2 CoQ10對激動劑誘導的血小板cPLA2活化的影響

圖 2 CoQ10對激動劑誘導的血小板cPLA2磷酸化的影響Fig. 2 Effect of CoQ10 on agonist-induced platelet cPLA2 phosphorylation

大量研究表明，cPLA2蛋白酶活化對于調控血小板TxA2的生成起關鍵作用，當cPLA2活化時，表現為其Ser505位點發(fā)生磷酸化[7]。如圖2A、B所示，與靜息組相比，當血小板與DMSO共同孵育后，受到激動劑凝血酶和膠原的刺激時cPLA2（Ser505）磷酸化水平高度顯著升高（P＜0.001）。當CoQ10與血小板共同孵育后，100 μmol/L的CoQ10可顯著下調凝血酶誘導的血小板cPLA2（Ser505）磷酸化水平，與DMSO組相比差異高度顯著（P＜0.001）；然而較低濃度（1 μmol/L和10 μmol/L）的CoQ10則不能抑制凝血酶誘導的血小板cPLA2（Ser505）發(fā)生磷酸化（P＞0.05）。與DMSO組相比，1、10 μmol/L和100 μmol/L的CoQ10均可高度顯著降低膠原誘導的血小板cPLA2（Ser505）磷酸化水平 （P＜0.001）。以上結果表明，CoQ10可顯著抑制激動劑誘導的血小板cPLA2活化。

2.3 cPLA2活化在CoQ10抑制激動劑誘導的血小板TxA2生成中的作用

前期研究已發(fā)現，CoQ10可顯著抑制激動劑誘導的血小板TxA2生成以及cPLA2活化，但是CoQ10抑制TxA2生成是否通過其下調cPLA2磷酸化水平尚不清楚。由 圖3A、B可知，與DMSO組相比，cPLA2的特異性抑制劑苯乙酮可極顯著抑制凝血酶和膠原誘導的血小板TxA2生成（P＜0.01）；此外，1 μmol/L苯乙酮和100 μmol/L CoQ10聯(lián)合處理組與單獨的1 μmol/L苯乙酮處理、100 μmol/L CoQ10處理組相比，對TxA2生成的影響無顯著差異 （P＞0.05），表明1 μmol/L苯乙酮和100 μmol/L CoQ10聯(lián)合使用時對TxA2生成的抑制作用無相加或協(xié)同作用。以上結果說明，CoQ10抑制激動劑誘導的血小板TxA2生成主要通過抑制cPLA2活化來實現。

圖 3 cPLA2活化在CoQ10抑制激動劑誘導的血小板TxA2生成中的作用Fig. 3 Roles of cPLA2 activation in CoQ10-inhibited platelet TxA2 generation induced by agonists

2.4 PKA介導的信號通路在CoQ10調控激動劑誘導的 血小板cPLA2活化和TxA2生成中的作用

圖 4 PKA信號通路在CoQ10抑制凝血酶誘導的血小板cPLA2活化（A）和TxA2生成（B）中的作用Fig. 4 Roles of PKA signaling pathway in the inhibitory effect of CoQ10 to platelet cPLA2 activation (A) and TxA2 generation (B) induced by thrombin

CoQ10通過激活環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）/PKA介導的信號通路，進而發(fā)揮抑制血小板激活、聚集和血栓形成的作用[21]。因此，進一步探討CoQ10抑制血小板cPLA2活化和TxA2生成是否受其激活cAMP/PKA信號通路所調控。由圖4A可知，PKA特異性抑制劑H89對凝血酶誘導的血小板cPLA2磷酸化的影響與DMSO組相比無顯著差異（P＞0.05），表明凝血酶誘導的cPLA2磷酸化水平可能已達到最大值；10 μmol/L H89與100 μmol/L CoQ10聯(lián)合處理組與DMSO組相比無顯著差異（P＞0.05），表明10 μmol/L H89幾乎可完全逆轉100 μmol/L CoQ10對凝血酶誘導cPLA2磷酸化的抑制作用。H89對凝血酶誘導的血小板TxA2生成的影響與cPLA2磷酸化類似（圖4B）。以上結果表明，CoQ10抑制凝血酶誘導的血小板cPLA2活化和TxA2生成主要通過激活PKA介導的信號通路來實現?？傊?，本研究結果表明，CoQ10抑制激動劑誘導的血小板TxA2生成的主要機制是調控PKA/cPLA2介導的信號通路。

3 討 論

動脈粥樣硬化性和血栓性心血管疾病，如中風、冠心病等，已經成為全球范圍內的重要疾病，血小板TxA2的異常生成和分泌在心血管疾病發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[9-10]。抑制血小板TxA2的生成及其介導的信號通路已經成為防治動脈粥樣硬化和血栓性心血管疾病的重要靶標之一。開發(fā)研究抑制調控TxA2合成通路中的關鍵酶（包括COX和cPLA2等）以及抑制TxA2受體（如TP受體）對于抑制TxA2介導的血栓形成至關重要[7]。目前，市面上已出現的一些抗血小板藥物可通過抑制TxA2信號通路發(fā)揮有效抑制血栓形成的作用，其中最重要的是阿司匹林，其作用機制主要是抑制COX[24]。此外，奧扎格雷可抑制血栓素合成酶的活性，利多格雷可作為TP受體的拮抗劑[7]。但是這些藥物發(fā)揮抗血栓形成作用的過程中往往伴有嚴重的副反應，其中最嚴重的是易導致出血以及藥物性抵抗等，因此在心血管疾病尤其是血栓性疾病的早期治療中受到很大的限制[25]。臨床干預研究證實，CoQ10是一種較為安全的膳食補充劑，可長期使用以防治心血管疾病，而且鮮有出血副反應的報道[26]。本研究通過使用體外實驗的方法闡明CoQ10可顯著抑制激動劑誘導的血小板TxA2生成，這為膳食補充CoQ10防治血栓性疾病提供新的理論依據。

調控血小板TxA2生成的機制復雜，cPLA2的活化在其中起關鍵作用[7]。當血小板受到血液中可溶性激動劑如凝血酶、ADP等或者損傷血管內皮暴露的膠原蛋白刺激時，可促發(fā)胞內一系列信號傳導事件，如激活糖蛋白VI信號通路、G蛋白偶聯(lián)受體和鈣離子動員等，最終導致血小板cPLA2磷酸化，進而促進TxA2的生成[9]。CoQ10抑制凝血酶和膠原誘導血小板TxA2生成的主要機制是抑制cPLA2活化，因為cPLA2的特異性抑制劑苯乙酮與CoQ10聯(lián)合使用時，對TxA2生成的抑制作用無相加或協(xié)同作用。其他信號通路也可能在CoQ10調控血小板TxA2生成的過程中起調控作用，這需要在后續(xù)研究中進一步探討。此外，前期研究結果表明cAMP/PKA信號通路在CoQ10抑制血小板活化、聚集和血栓形成中具有重要作用[14]， 本研究發(fā)現CoQ10抑制cPLA2活化和TxA2生成受其激活PKA信號通路的調控作用，因為PKA抑制劑H89可完全逆轉CoQ10的作用。因此可以推斷，CoQ10可能通過激活cAMP/PKA信號通路抑制cPLA2活化和TxA2生成，進而抑制血小板整合素αIIbβ3活化，從而發(fā)揮抑制血小板化、聚集和血栓形成的作用。

前期的人群干預研究結果表明，膳食補充CoQ10顯著抑制血脂紊亂人群血小板聚集和顆粒物的釋放，但是值得注意的是，經過24 周的CoQ10（120 mg/d）干預后，檢測發(fā)現患者血漿CoQ10濃度約為2 μmol/L[21]。而本研究的體外實驗中所用CoQ10劑量為1、10 μmol/L和 100 μmol/L，與其他體外實驗研究所用的劑量一致[27-28]，并且發(fā)現對血小板功能具有顯著抑制作用的劑量主要為10 μmol/L和100 μmol/L，這遠高于人群干預研究中能抑制血小板功能的血漿CoQ10濃度（約2 μmol/L），原因可能是在體外實驗中短時間（50 min）作用于血小板需要更高的劑量才能有效地抑制血小板功能，而在人群干預研究中通過24 周的長期膳食干預，血液中即使較低濃度的CoQ10也可以顯著抑制血小板聚集和活化等。研究發(fā)現膳食補充CoQ10具有較高的安全性，健康人攝入CoQ10劑量高達2400 mg/d時未見顯著的毒副作用[26]。在其他臨床干預研究中，如對高脂血癥、糖尿病、心力衰竭和帕金森疾病等患者使用劑量不等（50～1500 mg/d）的CoQ10進行干預，發(fā)現患者對該劑量范圍的CoQ10耐受性良好，血液中CoQ10濃度可高達10.2 μmol/L[26]。因此， 在本研究的體外實驗中CoQ10產生效應的濃度在人群血液中是可以達到的。

綜上，CoQ10具有顯著抑制激動劑誘導的血小板TxA2生成的作用，其機制主要是調控PKA/cPLA2介導的信號通路。本研究從營養(yǎng)膳食或從功能食品途徑為CoQ10防治血栓性心血管疾病提供了一定的理論依據。