王 勇,宋 歌,龐邵杰,綦文濤*
(國家糧食和物資儲備局科學研究院,北京 100037)
我國雜糧種類和產(chǎn)量位居世界第一,雜糧產(chǎn)量約占世界雜糧總產(chǎn)量的17%,占國內(nèi)糧食總產(chǎn)量的10%。越來越多證據(jù)表明膳食燕麥、蕎麥、小米等雜糧對降低人體慢性疾病發(fā)病風險具有重要作用,可調(diào)節(jié)血糖、降低血脂、降低血壓、預防冠心病及結(jié)腸癌等疾病[1-2]。腸道菌群失調(diào)可導致多種疾病,如肥胖、肝臟疾病和炎癥性腸道疾病[3]。飲食習慣是影響人體腸道菌群多樣性的主要因素,研究表明,非洲農(nóng)村兒童因食用小米、高粱等雜糧,較歐洲兒童腸道菌群多樣性和腸道短鏈脂肪酸含量更高[4]。從腸道菌群角度探索雜糧/全谷物的健康功能機制已成為近年來食品營養(yǎng)學領域研究的新熱點[5-6],相關基礎研究對指導國民健康膳食尤為重要。
燕麥、蕎麥等雜糧富含的膳食纖維和多酚可提高腸道菌群多樣性,促進腸道特定產(chǎn)短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)菌的生長,維持腸道結(jié)構(gòu)完整性,調(diào)節(jié)脂類代謝,從而緩解肥胖和2型糖尿病癥狀[7-8]。β-葡聚糖為燕麥中主要益生元,進入結(jié)腸后可被腸道菌群利用,其作為常見膳食纖維具有降低膽固醇和餐后血糖、減輕胰島素抵抗和代謝綜合征等作用[9]??嗍w中富含的抗性淀粉,具有提高腸道益生菌豐度、降低血液膽固醇和甘油三酯濃度的功效[10]。值得注意的是,純化的膳食纖維不具有全谷物增加腸道菌群多樣性的活性,可能是由于全谷物中的多種營養(yǎng)素間的協(xié)同作用發(fā)揮功效[11]。除了膳食纖維,雜糧富含黃酮、酚酸等多酚類物質(zhì),多酚作為重要的益生元,與腸道菌群的互作機制及對腸道健康的影響也受到越來越多的關注[12-13]。
升級后的Illumina NovaSeq測序平臺可實現(xiàn)雙端測序的PE250策略,測序通量高、深度大,成為更適用于16S擴增子測序的新平臺。本研究通過分析飼喂含不同雜糧飼料的大鼠體質(zhì)量、攝食量、能量攝入、肝臟和結(jié)腸結(jié)構(gòu)差異等,檢測結(jié)腸內(nèi)容物中SCFAs含量,通過Illumina NovaSeq高通量測序平臺對大鼠結(jié)腸細菌16S rRNA V4區(qū)進行定性分析,從操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)、不同水平物種組成分析、主坐標分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)、線性判別分析(linear discriminant analysis effect size,LEfSe)等方面系統(tǒng)闡釋攝食熟化后的燕麥、蕎麥和小米對大鼠結(jié)腸菌群的影響。
5 周齡SPF級雄性SD大鼠,體質(zhì)量180~200 g,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2016-0006。
燕麥(裸燕麥,‘壩莜1號’)購自河北省張家口張北縣;蕎麥(苦蕎,‘川蕎1號’)購自四川省涼山彝族自治州;小米(‘晉谷21號’)購自山西省呂梁興縣;AIN-93G標準維持飼料購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司;含燕麥、蕎麥和小米飼料訂制于南通特洛菲飼料科技有限公司。燕麥、蕎麥和小米均經(jīng)蒸煮、烘干后添加至飼料,飼料配方和熱量密度如表1所示。
表 1 飼料配方和熱量密度Table 1 Compositions and energy density of the diets employed in this study g/100 g
甲醇、甲酸(色譜純) 美國Thermo-Fisher Scientific公司;3-硝基苯肼、2,6-二叔丁基對甲酚 (色譜純) 美國Sigma-Aldrich公司。
ACQUITY UPLC I-CLASS高效液相色譜儀、C18BEH色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)、Xevo TQ-S Micro質(zhì)譜檢測儀 美國Waters公司;ML4002電子天平 瑞士Mettler Toledo公司;DW-86L338型-80 ℃超低溫 冰箱 青島海爾集團;3-30K高速冷凍離心機 德國希格瑪實驗室離心機公司。
1.3.1 分組及飼養(yǎng)
48 只SPF級雄性SD大鼠,用AIN-93G標準維持飼料預飼1 周后,按體質(zhì)量隨機分為4 組,每組12 只:空白對照組(飼喂標準維持飼料)、燕麥組(飼喂含22%(質(zhì)量分數(shù),下同)燕麥的飼料)、蕎麥組(飼喂含22%蕎麥的飼料)、小米組(飼喂含22%小米的飼料)。大鼠飼養(yǎng)于國家糧食和物資儲備局科學研究院昌平實驗基地SPF級動物房,實驗周期為12 周,飼養(yǎng)期間自由采食和飲水,維持室內(nèi)溫度(23±2)℃、相對濕度60%、12 h晝夜循環(huán)采光。每周稱量并記錄體質(zhì)量,每兩天記錄攝食量,每隔2~3 d更換一次墊料。
1.3.2 標本采集及處理
飼養(yǎng)12 周后稱量大鼠體質(zhì)量,CO2麻醉后,心臟取血。斷頸處死大鼠,將大鼠轉(zhuǎn)移至超凈工作臺內(nèi),使用體積分數(shù)75%的乙醇溶液擦拭大鼠腹部,使用消毒后的手術剪打開大鼠腹腔,迅速將肝臟、腸道完整分離出來,取部分肝臟和結(jié)腸組織用于病理檢測,其余部分保存于 -80 ℃待測。結(jié)腸內(nèi)容物保存于滅菌后的EP管中,液氮速凍后在-80 ℃冰箱中保存,用于提取腸道菌群DNA。
1.3.3 組織學觀察
1.3.3.1 肝臟組織學觀察
蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色:分離1 cm×1 cm肝臟右葉浸泡于質(zhì)量分數(shù)10%甲醛溶液中,石蠟包埋后進行組織切片制備和HE染色。光學顯微鏡下觀察脂肪空泡、肝細胞基本結(jié)構(gòu)及炎細胞浸潤情況等。
油紅O染色:分離1 cm×1 cm肝臟右葉,液氮冷凍制作切片,進行油紅O溶液染色(0.5 g/100 mL,溶解于異丙醇中)。將切片置于光學顯微鏡下觀察組織形態(tài)變化,參照中華肝病學會脂肪肝病診斷標準進行切片評分。
1.3.3.2 結(jié)腸組織學觀察
部分結(jié)腸組織經(jīng)體積分數(shù)10%甲醛溶液浸泡后進行石蠟包埋、切片制備與HE染色。光學顯微鏡下觀察結(jié)腸組織形態(tài)。
1.3.4 大鼠腸道菌群分析
1.3.4.1 大鼠結(jié)腸內(nèi)容物高通量測序分析
大鼠結(jié)腸內(nèi)容物樣品(每組隨機取8 個)從-80 ℃冰箱取出后立刻放入干冰,送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司,采用Illumina NovaSeq 6000測序平臺,通過擴增細菌16S rRNA基因的V4區(qū)域基因序列分析大鼠結(jié)腸菌群多樣性。
1.3.4.2 生物學信息分析
基于有效數(shù)據(jù)進行OTU聚類和物種分類分析,根據(jù)OTUs聚類結(jié)果,對每個OTU的代表序列做物種注釋,得到對應的物種信息和基于物種的豐度分布情況。同時,對OTUs進行豐度、Alpha多樣性計算、韋恩圖分析,以得到樣品內(nèi)物種豐富度和均勻度信息、不同樣品或分組間的共有和特有OTUs信息等。另一方面,對OTUs進行多序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹,進一步得到不同樣品和分組的群落結(jié)構(gòu)差異,通過PCoA降維圖和樣品聚類樹進行分析,并選用LEfSe方法對分組樣品的物種組成和群落結(jié)果進行差異顯著性檢驗。
1.3.5 大鼠結(jié)腸內(nèi)容物SCFAs含量的測定
稱取樣本約80 mg,加入250 μL水、250 μL甲醇,漩渦提取30 min。13200 r/min離心取上清液50 μL,加入50 μL內(nèi)標(質(zhì)量濃度5 μg/mL同位素標記的丙酸)、50 μL衍生試劑(200 μmol/L 3-硝基苯肼),常溫衍生30 min,加入50 μL質(zhì)量濃度2 μg/mL抗氧化劑2,6-二叔丁基對甲酚,漩渦10 s。13200 r/min離心10 min,取上清液檢測,采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用外標法進行檢測和定量。
流動相A:含體積分數(shù)0.1%甲酸的去離子水;流動相B:甲醇。梯度洗脫:0~2 min,90%~80% A;2~9 min,80%~40% A;9~10 min,40%~5% A;10~11 min,5%~0%;11~11.1 min,0~90%;11.1~13 min,90%。檢測條件:流速0.3 mL/min,進樣量5 μL,柱溫45 ℃。
質(zhì)譜條件:毛細管電壓2.7 kV、錐孔電壓30 V、錐孔流速20 L/h、離子源溫度150 ℃、離子化溫度450 ℃、離子化氣流流速1000 L/h。
使用Graphpad Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計分析,采用One-way ANOVA和Duncan’s test分析差異顯著性,P<0.05時被認為差異具有統(tǒng)計學意義,統(tǒng)計結(jié)果采用平均值±標準差表示。
雜糧的健康作用與其含量豐富的功能活性物質(zhì)密切相關。本研究所選取的燕麥中β-葡聚糖質(zhì)量分數(shù)為(4.19±0.42)%。蕎麥中總黃酮質(zhì)量分數(shù)為(1.76±0.06)%(以蘆丁計),抗性淀粉質(zhì)量分數(shù)為(0.39±0.01)%。小米中VB1含量為(0.27±0.04)mg/100 g, 總膳食纖維質(zhì)量分數(shù)為(2.16±0.02)%,粗脂肪質(zhì)量分數(shù)為(4.40±0.36)%。與前期報道的3 種雜糧特征功能活性成分含量[14-16]基本一致,因此,本研究所選取雜糧品種具有代表性。
表 2 大鼠體質(zhì)量、攝食量和能量攝入Table 2 Body mass, food intake and energy intake of rats
如表2所示,空白對照組、燕麥組、蕎麥組和小米組大鼠初始體質(zhì)量基本相同(P>0.05)。處死前第12周時,蕎麥組大鼠的體質(zhì)量最大,與空白對照組相比增長6.99%,但無顯著性差異(P>0.05),與Peng Lianxin等[17]研究結(jié)果一致,飼喂蕎麥可增加高脂飲食大鼠體質(zhì)量。燕麥組、蕎麥組和小米組攝食量及能量攝入均與空白對照組無顯著性差異(P>0.05)。表明添加3 種雜糧均未影響大鼠的正常生長。
圖 1 飼喂燕麥、蕎麥和小米對正常大鼠肝臟組織的影響Fig. 1 Effects of oats, tartary buckwheat and foxtail millet supplementation on liver histology in normal rats
如圖1所示,空白對照組、燕麥組和小米組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)存在,肝小葉內(nèi)肝細胞無水腫,10%肝細胞微泡性脂肪變性,偶見點狀肝細胞壞死和很少量單核淋巴細胞灶狀浸潤,未見肝細胞嗜酸性變,肝血竇輕度淤血,未見肝Kupffer細胞增生,匯管區(qū)未見炎細胞浸潤;油紅O染色顯示空白對照組、燕麥組和小米組10%的肝細胞內(nèi)可見紅染的細小脂滴。蕎麥組大鼠未見肝細胞脂肪變性,油紅O染色顯示肝細胞內(nèi)未見紅染的脂滴,表明膳食蕎麥具有一定預防肝細胞脂肪變性的作用。
圖 2 飼喂燕麥、蕎麥、小米對正常大鼠結(jié)腸組織的影響Fig. 2 Effects of oats, tartary buckwheat and foxtail millet supplementation on colon histology in normal rats
如圖2所示,空白對照組大鼠結(jié)腸黏膜無損傷,未見隱窩膿腫,杯狀細胞無減少,腸壁內(nèi)未見炎細胞浸潤。燕麥組大鼠結(jié)腸黏膜無損傷,未見隱窩膿腫,杯狀細胞無減少,黏膜層內(nèi)很少量單核淋巴細胞散在浸潤。蕎麥組大鼠結(jié)腸黏膜無損傷,未見隱窩膿腫,杯狀細胞無減少,黏膜層和黏膜下層可見中等量單核淋巴細胞灶狀浸潤。小米組大鼠結(jié)腸黏膜無損傷,未見隱窩膿腫,杯狀細胞輕微減少,腸壁全層中等量單核淋巴細胞灶狀浸潤。綜上,飼料中添加3 種雜糧后,大鼠結(jié)腸結(jié)構(gòu)保持正常的形態(tài),未出現(xiàn)明顯病變。
2.5.1 結(jié)腸菌群OTU數(shù)量
韋恩圖可用于統(tǒng)計多組或多個樣本中所共有和獨有的物種(如OTU)數(shù)目,由圖3可知,4 組大鼠結(jié)腸內(nèi)容物樣本共產(chǎn)生724 個OTU,燕麥組的OTU數(shù)量最多(559 個),蕎麥組的OTU數(shù)量其次(540 個),空白對照組和小米組的OTU數(shù)量均為508 個,4 組樣品的共有物種為390 個,燕麥組特有物種數(shù)量最多(59 個)。由此可見,飼喂燕麥后大鼠結(jié)腸菌群會增加新的物種,結(jié)腸菌群的多樣性得到提升。
圖 3 大鼠結(jié)腸菌群OTU的韋恩圖Fig. 3 Venn diagram showing unique and shared colonic flora in normal rats supplemented with different kinds of coarse cereals
2.5.2 基于門分類水平分析結(jié)果
圖 4 大鼠結(jié)腸菌群門水平物種組成分析Fig. 4 Analysis of colonic microbiota composition at the phylum level in normal rats
本實驗通過Illumina NovaSeq測序技術分析了大鼠結(jié)腸內(nèi)容物的菌群,重點分析飼喂燕麥、蕎麥和小米對門水平和屬水平上大鼠結(jié)腸菌群組成的影響。由圖4可知,各組樣本生成的OTU主要由5 個菌門構(gòu)成:厚壁菌門(Firmicutes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、軟壁菌門(Tenericutes)和放線菌門(Actinobacteria),其中厚壁菌門、疣微菌門和擬桿菌門占絕對主導地位。燕麥組厚壁菌門相對豐度與對照組無顯著差異(P>0.05),蕎麥組和小米組使厚壁菌門相對豐度分別提高23.29%和30.03%,使疣微菌門相對豐度分別下降41.05%和55.48%,使擬桿菌門相對豐度分別下降49.87%和58.58%。據(jù)報道2型糖尿病患者糞便菌群中厚壁菌門/擬桿菌門比值下降,這是腸道菌群失調(diào)的重要標志之一[18]。Martínez等[19]研究發(fā)現(xiàn),28 個健康受試者每天食用60 g全谷物大麥、糙米、大麥與糙米復合物(質(zhì)量比1∶1),4 周后3 組受試者糞便中菌群多樣性顯著增加,厚壁菌門/擬桿菌門比值增加。
2.5.3 基于屬分類水平的分析結(jié)果
由圖5可知,在屬水平上,各組優(yōu)勢菌群主要有阿克曼氏菌屬、瘤胃菌科未定屬(unidentified_Ruminococcaceae)、布勞特氏菌屬(Blautia)、擬桿菌屬、乳桿菌屬(Lactobacillus)和羅姆布茨菌屬(Romboutsia)等。飼喂燕麥、蕎麥和小米會影響大鼠結(jié)腸菌群屬水平上的組成,結(jié)果分析表明攝食燕麥顯著增加乳桿菌屬和阿克曼氏菌屬相對豐度,攝食蕎麥和小米顯著降低阿克曼氏菌屬相對豐度,攝食小米顯著增加布勞特氏菌屬豐度。膳食全谷物人群腸道厚壁菌門中布勞特氏菌屬、乳桿菌屬和放線菌門中柯林斯菌屬(Collinsella)豐度增加[20]。乳桿菌屬不同菌種具有顯著的益生效果,包括抑制致病菌,改善腸道菌群結(jié)構(gòu),促進腸上皮細胞增殖,增強機體免疫功能,改善血脂,抗氧化等功效[21]。燕麥組和小米組使乳桿菌屬相對豐度分別提高196.40%和48.65%。大量研究表明腸道中嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)的豐度與宿主患肥胖、2型糖尿病、炎癥性腸病等呈負相關,嗜黏蛋白阿克曼氏菌在代謝炎癥、屏障功能和脂肪儲存中起關鍵作用,其定植情況是反映機體健康水平的標志之一[22-23]。擬桿菌屬豐度升高與結(jié)腸直腸癌、肝病等多種疾病相關,本實驗中攝食燕麥、蕎麥和小米分別使擬桿菌屬相對豐度下降38.53%、51.98%和57.29%。針對中國健康年輕人群的腸道菌群結(jié)構(gòu)特征分析研究表明,布勞特氏菌屬具有在人體腸道內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)生SCFAs的能力,其主要參與丁酸鹽的產(chǎn)生[24]。因此,本實驗結(jié)果表明燕麥、蕎麥和小米攝入可促進腸道益生菌的繁殖,并抑制腸道有害菌的生長。通過體外模型研究燕麥和蕎麥對人腸道菌群的影響,發(fā)現(xiàn)燕麥和蕎麥對有益菌(雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和乳桿菌屬)具有一定的增殖作用,同時對有害菌(腸球菌和大腸桿菌)的生長具有一定的抑制作用[10,25]。此外,蕎麥殼提取物因富含多酚類化合物,可改善糖尿病大鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu),提高腸道內(nèi)乳桿菌屬、布勞特氏菌屬和普氏菌屬(Prevotella)等菌屬豐度[26]。
圖 5 大鼠結(jié)腸菌群屬水平物種組成分析Fig. 5 Analysis of colonic microbiota composition at the genus level in normal rats
2.5.4 菌群PCoA結(jié)果
圖 6 大鼠結(jié)腸菌群PCoA圖Fig. 6 Principal co-ordinate analysis of colonic microbiota in normal rats
利用每個樣品OTU的豐度信息進行PCoA,結(jié)果表明,空白對照組、燕麥組、蕎麥組和小米組大鼠腸道內(nèi)菌群多樣性均有明顯的聚類現(xiàn)象(圖6),說明飼喂3 種雜糧對大鼠結(jié)腸菌群結(jié)構(gòu)的影響顯著,且蕎麥和小米對結(jié)腸菌群的影響相似度較高。
2.5.5 LEfSe菌群差異分析結(jié)果
圖 7 大鼠結(jié)腸菌群差異分析Fig. 7 LEfSe analysis of differences in colonic microbiota in normal rats supplemented with different kinds of coarse cereals
圖7A顯示了不同組中豐度差異顯著的物種,柱狀圖的長度代表攝食3 種雜糧對大鼠腸道內(nèi)差異物種的影響,通過將差異映射到已知層級結(jié)構(gòu)的分類樹上的方式得到進化分支圖(圖7B)。利用LEfSe軟件分析大鼠結(jié)腸菌群差異,先對4 組樣品進行Kruskal-Wallis秩和檢驗,將篩選出的差異再通過Wilcoxon秩和檢驗進行兩兩組間比較。篩選P<0.05、線性判別分析(linear discriminant analysis,LDA)值大于4的菌群進行展示和比較,如圖7A所示,相對于其他3 組,飼喂燕麥后大鼠結(jié)腸中疣微菌門豐度增加,阿克曼氏菌屬豐度增加; 飼喂蕎麥后大鼠結(jié)腸中瘤胃菌科未定屬豐度增加;飼喂小米后大鼠結(jié)腸中厚壁菌門豐度增加,布勞特氏菌屬和閻氏菌屬(Yaniella)豐度增加。
表 3 結(jié)腸內(nèi)容物SCFAs含量Table 3 SCFA concentrations in colonic contents of rats μg/g
如表3所示,飼喂燕麥和小米后,大鼠結(jié)腸中乙酸和總SCFAs含量顯著高于對照組(P<0.05),小米組丙酸和異丁酸含量顯著高于對照組(P<0.05)。腸道內(nèi)的SCFAs主要來自食物中不能被人體直接消化的碳水化合物,如纖維素、半纖維素、抗性淀粉和低聚糖等,被腸道微生物發(fā)酵形成有益代謝終產(chǎn)物SCFAs等,SCFAs在調(diào)節(jié)宿主代謝、降低結(jié)腸pH值、改善腸道屏障功能、降低膽固醇水平等方面具有關鍵作用[27-28]。全谷物膳食人群較精制谷物膳食人群糞便中乙酸和丁酸含量高[29]。Dong Jilin等[14]研究發(fā)現(xiàn)3 種燕麥產(chǎn)品(燕麥片、去皮燕麥面粉、精制燕麥麩)飼喂的高脂飲食大鼠的結(jié)腸中總SCFAs含量增加,燕麥產(chǎn)品可通過增加乳桿菌屬和雙歧桿菌屬數(shù)量,改變腸道菌群結(jié)構(gòu)而影響機體能量和脂肪代謝。近期研究表明高脂飲食模式下,小米可提高大鼠盲腸中乙酸、丙酸和丁酸含量[30]。本實驗中攝食小米顯著增加布勞特氏菌屬豐度,該菌屬具有發(fā)酵產(chǎn)生SCFAs的能力,因此推測布勞特氏菌屬豐度的增加可能為小米提高腸道SCFAs含量的機制之一。
本研究評價熟化形式雜糧對體內(nèi)腸道健康的影響,雜糧的健康作用與其含量豐富的營養(yǎng)物質(zhì)、功能活性成分密切相關,雜糧富含膳食纖維和抗性淀粉,進入腸道后經(jīng)細菌發(fā)酵,促進腸道有益菌的增殖,改善腸道微生態(tài)環(huán)境,對多種代謝性疾病具有干預作用[8]。Knudsen等[31]研究表明,燕麥中可溶性膳食纖維β-葡聚糖可調(diào)整大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu),促進益生菌在腸道內(nèi)定植,減少腸道有害菌的黏附;Peng Lianxin等[17]研究發(fā)現(xiàn)蕎麥中黃酮類抗氧化物質(zhì)(如蘆?。┚哂懈纳聘咧嬍炒笫竽c道菌群的功效,但是蕎麥和蘆丁對SCFAs的產(chǎn)生均無明顯作用;Yang Ruipeng等[32]研究發(fā)現(xiàn)小米谷糠內(nèi)殼的結(jié)合態(tài)多酚可顯著增加小鼠糞便中厚壁菌門豐度,降低擬桿菌門豐度,以上研究結(jié)果均與本實驗結(jié)果一致。
本實驗應用Illumina NovaSeq高通量測序技術探究熟化后燕麥、蕎麥和小米對正常大鼠的腸道菌群影響,并比較3 種雜糧對腸道有益代謝產(chǎn)物、腸道結(jié)構(gòu)等方面的作用。主要結(jié)論如下:1)攝食燕麥可增加大鼠腸道菌群多樣性,顯著增加益生菌乳桿菌屬和阿克曼氏菌屬豐度,對腸道菌群具有一定的改善作用。2)蕎麥和小米可增加結(jié)腸中厚壁菌門相對豐度,降低疣微菌門和擬桿菌門相對豐度,蕎麥和小米對結(jié)腸菌群的影響相似度較高。 3)燕麥和小米可提高大鼠結(jié)腸內(nèi)乙酸和總SCFAs含量,小米還可增加結(jié)腸內(nèi)丙酸和異丁酸含量。本研究通過系統(tǒng)比較3 種雜糧對腸道菌群的影響,為谷物功能食品的開發(fā)提供科學依據(jù)。