李永格

肝癌是一種常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，在我國(guó)發(fā)病率非常高，居所有惡性腫瘤的第2位。肝癌的治療多通過(guò)手術(shù)切除、肝臟移植以及化療等綜合療法，雖然取得了一定進(jìn)展但預(yù)后還是很差，導(dǎo)致其5年生存率不足5%[1，2]。中草藥在防治肝癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，延長(zhǎng)生存期方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。香菇多糖(Lentinan，LNT)是從香菇分離出來(lái)的最有效的活性物質(zhì)，有研究表明其對(duì)肝癌細(xì)胞有明顯的直接抑制作用[3]，但具體機(jī)制不清。本課題擬通過(guò)不同濃度LNT體外作用于HepG2肝癌細(xì)胞系，觀(guān)察肝癌細(xì)胞增殖變化；western-blot檢測(cè)軸突導(dǎo)向蛋白4C(Sema4C)和G蛋白偶聯(lián)受體激酶相互作用蛋白1(GIT1)表達(dá)，分析其作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞株人肝癌細(xì)胞系HepG2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 藥品及試劑LNT購(gòu)自武漢勝天科技有限公司，(批號(hào)：1541023)；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；10%胎牛血清；DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Invitrogen公司)；抗體(武漢博士德)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或化學(xué)純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞系HepG2采用10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基作常規(guī)培養(yǎng)，其中培養(yǎng)溫度保持37 ℃、CO2含量5%，取生長(zhǎng)良好并處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于下述實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT法檢測(cè)LNT對(duì)細(xì)胞增殖抑制率的影響LNT采用完全培養(yǎng)基配置成6.25、12.5、25、50、100 μg/ml濃度。根據(jù)不同濃度LNT將肝癌細(xì)胞分為以下幾組：①對(duì)照組：完全培養(yǎng)基作用5 h；②6.25 μg/ml LNT組：完全培養(yǎng)基聯(lián)合6.25 μg/ml LNT作用5 h；③12.5 μg/ml LNT組：完全培養(yǎng)基聯(lián)合12.5 μg/ml LNT作用5 h；④25 μg/ml LNT組：完全培養(yǎng)基聯(lián)合25 μg/ml LNT作用5 h；⑤50 μg/ml LNT組：完全培養(yǎng)基聯(lián)合50 μg/ml LNT作用5 h；⑥100 μg/ml LNT組：完全培養(yǎng)基聯(lián)合100 μg/ml LNT作用5 h。將細(xì)胞按每孔5×105個(gè)接種于96孔板中，各組分別設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔，加入不同濃度LNT處理5 h后洗去上清液，然后加入完全培養(yǎng)基，向每孔中加入20 μl MTT溶液(濃度為5 mg/ml，用PBS配)，37 ℃培養(yǎng)4 h后吸去上清，加入200 μl DMSO溶液，振蕩20 min，使細(xì)胞充分溶解，在OD 490 nm處通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)其吸光值并記錄。參照上述方法，每隔24 h檢測(cè)1次細(xì)胞增殖情況，共計(jì)3次。

1.2.3 western-blot檢測(cè)GIT1蛋白、Sema4C蛋白在肝癌細(xì)胞株中表達(dá)根據(jù)MTT結(jié)果選取100 μg/ml LNT組肝癌細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行western-blot實(shí)驗(yàn)。參照試劑盒說(shuō)明書(shū)裂解細(xì)胞，提取總蛋白并進(jìn)行蛋白定量。灌制10%SDS-PAGE凝膠，每孔上樣30 μg，250 V轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，于37 °C置5%脫脂奶粉封閉液中封閉1 h。滴加一抗，4 °C孵育過(guò)夜，37 °C下與HRP標(biāo)記的二抗孵育1 h，洗滌后ECL曝光。同樣的方法對(duì)β-actin進(jìn)行檢測(cè)并作為內(nèi)參對(duì)照。所得圖像用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析，以目的基因灰度值/內(nèi)參β-actin灰度值半定量計(jì)算蛋白含量。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度LNT對(duì)HepG2細(xì)胞增殖影響不同濃度LNT對(duì)HepG2細(xì)胞增殖都有明顯抑制作用且表現(xiàn)為量效、時(shí)間依賴(lài)性，100 μg/ml LNT作用48 h后，細(xì)胞生長(zhǎng)出現(xiàn)半抑制，故選擇100 μg/ml LNT作用48 h來(lái)進(jìn)行后續(xù)研究。見(jiàn)表2。

表1 不同濃度LNT對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用 (例，

2.2 western-blot檢測(cè)LNT作用后HepG2細(xì)胞Sema4C、GIT1蛋白表達(dá)應(yīng)用western-blot檢測(cè)100 μg/ml LNT對(duì)HepG2細(xì)胞Sema4C蛋白、GIT1蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示：100 μg/ml LNT組HepG2細(xì)胞Sema4C蛋白、GIT1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，提示100 μg/ml LNT下調(diào)HepG2細(xì)胞Sema4C蛋白與GIT1蛋白表達(dá)。見(jiàn)表2、圖1、圖2。

圖1 GIT1蛋白表達(dá)電泳圖

圖2 Sema4C蛋白表達(dá)電泳圖

表2 Sema4C、GIT1蛋白相對(duì)表達(dá)量

3 討論

多糖是構(gòu)成生物體的重要組成部分，具有增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老等作用[4，5]，尤其是抗腫瘤的作用成為現(xiàn)在研究的熱點(diǎn)。目前關(guān)于多糖抗腫瘤的作用機(jī)制還不清楚，多數(shù)研究集中在免疫調(diào)節(jié)方面。本實(shí)驗(yàn)室前期體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)LNT能夠抑制肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為[6，7]，說(shuō)明LNT抗腫瘤作用可能通過(guò)其他途徑產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)MTT法檢測(cè)肝癌細(xì)胞增殖，發(fā)現(xiàn)不同濃度LNT對(duì)Huh7.5.1細(xì)胞增殖有明顯抑制作用且表現(xiàn)為量效、時(shí)間依賴(lài)性，與前期研究結(jié)果相符。

Sema4C為SemaⅣ亞族一員，有報(bào)道表明常見(jiàn)惡性腫瘤乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌和前列腺癌組織和細(xì)胞水平上均見(jiàn)Sema4C較強(qiáng)表達(dá)，且腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能不同，Sema4C蛋白表達(dá)的強(qiáng)弱是有差別的[8]。因此，推測(cè)Sema4C在人類(lèi)惡性腫瘤的表達(dá)可能具有普遍意義，并且與惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。G蛋白偶聯(lián)受體激酶相互作用蛋白1(G protein coupled receptor kinase interacting protein1，GIT1)為GIT家族分子，被N-α-乙酰轉(zhuǎn)移酶10(N-α-acetyltransferase10，NAA10)干擾作用后，抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移[9]，提示GIT1蛋白可能是腫瘤轉(zhuǎn)移的促進(jìn)因子。通過(guò)western-blot研究發(fā)現(xiàn)LNT組肝癌細(xì)胞Sema4C蛋白和GIT1蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，說(shuō)明LNT下調(diào)肝癌細(xì)胞Sema4C蛋白和GIT1蛋白表達(dá)。

綜上所述，LNT抑制肝癌細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能通過(guò)下調(diào)SEMA4C蛋白和GIT1蛋白表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用，為L(zhǎng)NT治療肝癌作用機(jī)制提供新思路。