趙志娟 朱 歡 熊 雄 何玉邦 敖鴻毅 吳辰熙 胡愈炘 劉國(guó)祥

(1. 南寧師范大學(xué)北部灣環(huán)境演變與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南寧 530001; 2. 南寧師范大學(xué)廣西地表過(guò)程與智能模擬重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南寧 530001; 3. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072;4. 青海湖國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局, 西寧, 810007)

青海湖地處青藏高原東北部, 湖泊面積約4400 km2, 是我國(guó)最大的咸水湖泊(鹽度約6‰—12‰)。青海湖因其獨(dú)特的海拔、氣候和地理位置成為我國(guó)西部著名的旅游風(fēng)景區(qū)。但是自2013年以來(lái), 每年7—9月青海湖均頻頻暴發(fā)絲狀藻類水華, 大量黃綠色藻類漂浮于水體表面, 對(duì)水體生態(tài)系統(tǒng)造成了一定污染和危害。目前關(guān)于青海湖藻類的研究主要集中于浮游植物種類多樣性調(diào)查、生物量監(jiān)測(cè)及營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)藻類生長(zhǎng)的影響等方面[1—5]。已報(bào)道過(guò)的絲狀綠藻有轉(zhuǎn)板藻、無(wú)隔藻、絲藻、水綿、雙星藻和剛毛藻等,這些絲狀藻類的調(diào)查主要依靠形態(tài)學(xué)觀察, 極少結(jié)合分子序列進(jìn)行分析[3]。

本研究對(duì)青海湖岸邊暴發(fā)的水華絲狀藻類進(jìn)行樣品采集, 并將其帶回實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展顯微形態(tài)觀察和分子序列測(cè)定, 以分析絲狀藻類所屬種類及其典型特征, 以期為青海湖的水環(huán)境治理和生態(tài)建設(shè)提供理論參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究分別在2013—2015年8月對(duì)青海湖沿岸發(fā)生絲狀藻類水華的位點(diǎn)進(jìn)行樣品采集, 采集后的樣品同時(shí)進(jìn)行3種方式保存: 10%的甲醛固定保存、干燥保存及低溫新鮮樣品保存。所有保存樣品均帶回實(shí)驗(yàn)室處理, 樣品編號(hào)依次為QH1401、QH1402、QH1403、QH1404、QH1501、QH1502、QH1504和QH1505, 甲醛固定的樣品保存于中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所。

1.2 形態(tài)觀察

顯微形態(tài): 在體式鏡(KL1500 LCD; Zeiss, G?ttingen, Germany)下用解剖針小心將目的藻絲分離,置于磷酸鹽緩沖液(PBS, pH 7.0)中反復(fù)清洗3次, 去除表面附著的雜質(zhì)。將干凈藻絲置于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行顯微形態(tài)觀察并測(cè)量拍照。關(guān)注的形態(tài)特征包含藻絲分枝類型、直徑大小、細(xì)胞長(zhǎng)寬比和有無(wú)固著器等, 同時(shí)收集干凈藻絲以備DNA提取使用。

標(biāo)本制作: 將新鮮藻樣置于放有清水和標(biāo)本紙的干凈操作盤中, 在解剖鏡下用解剖針輕輕分開(kāi)各分枝, 吸走多余水分, 待標(biāo)本紙?zhí)幱诎敫蔂顟B(tài)時(shí)涂上適量膠水, 自然風(fēng)干壓制成標(biāo)本, 做好的干標(biāo)本可用于藻絲宏觀形態(tài)觀察, 標(biāo)本保存于中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所。

1.3 DNA提取

單細(xì)胞法提取藻絲DNA: 將收集的絲狀綠藻用ddH2O反復(fù)洗滌3—4次, 置于顯微鏡下鏡檢。鏡檢后的藻絲轉(zhuǎn)移至滴有緩沖液的載玻片上, 用解剖刀切割單個(gè)細(xì)胞, 使內(nèi)含物釋放; 用移液槍收集細(xì)胞內(nèi)含物并轉(zhuǎn)移至已滅菌的PCR管中。加入合適比例的蛋白酶K, 混勻, 置于55℃水浴0.5h; 最后高溫(95℃, 5min)滅活蛋白酶K, 即獲得樣品總DNA。

1.4 PCR擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育分析

PCR擴(kuò)增核糖體小亞基編碼基因(Small subunit ribosomal encoding gene, SSU)和大亞基編碼基因(Large subunit ribosomal encoding gene, LSU)的方法參照Boedeker等[6]和Leliaert等[7]對(duì)剛毛藻目藻樣的處理方法[6,7], 參照Hayakawa等[8]的方法擴(kuò)增內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS序列。PCR產(chǎn)物送生物公司(擎科生物, 武漢)測(cè)序。對(duì)于直接測(cè)序效果不佳的PCR產(chǎn)物, 用pMD18-T(寶生物, 大連, 中國(guó))載體連接, 轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliDH5α中, 培養(yǎng)篩選后重新PCR并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果使用Seqman軟件拼接(Swindell and Plasterer, 1997)[9]。利用Mafft 7.2(Katoh and Standley, 2013)進(jìn)行序列比對(duì)[10], 使用Bioedit 7.0(Hall, 2004)手工校正[11], 人工校正后的序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。對(duì)ITS序列(序列間差異較大)開(kāi)展獨(dú)立進(jìn)化分析, 對(duì)于SSU和LSU序列(序列較為保守)開(kāi)展聯(lián)合進(jìn)化分析。分析前首先進(jìn)行SSULSU聯(lián)合序列不相合長(zhǎng)度差異檢驗(yàn),P＞0.05, 表明數(shù)據(jù)集可聯(lián)合分析。以上數(shù)據(jù)集分別采用似然法(ML)和貝葉斯算法(BI)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行運(yùn)算。前者通過(guò)RaxML(Stamatakis等[12])軟件完成, 后者通過(guò)MrBayes 3.1.2完成(Huelsenbeck 和 Ronquist[13])。RaxML樹(shù)和BI貝葉斯樹(shù)分別在相應(yīng)分支上獲得自展支持值(BP)和后驗(yàn)概率值(PP)。

2 結(jié)果

2.1 新種確認(rèn)

青海剛毛藻Cladophora qinghaiensisZ.J.ZHAO & G.X. LIU, sp. nov. 圖版 Ⅰ-a—h

植物體生長(zhǎng)于咸水環(huán)境, 鹽度范圍: 6‰—12‰。藻絲纖細(xì)柔軟, 呈綠色或淺綠色, 分枝旺盛, 具明顯的頂端生長(zhǎng)和居間生長(zhǎng)(圖版Ⅰ-a—c)。葉綠體網(wǎng)狀, 周生。大多數(shù)藻絲通過(guò)固著器著生于岸邊沙石等基質(zhì)上(圖版Ⅰ-d)。細(xì)胞均勻, 多圓柱形, 頂細(xì)胞逐漸變細(xì), 末端為鈍頂末梢(圖版Ⅰ-e)。細(xì)胞近頂端常產(chǎn)生分枝, 與主枝形成銳角(45°或更小), 典型的偽二歧分枝或者下方偽二歧分枝(圖版Ⅰ-f)。隨著生長(zhǎng), 有些細(xì)胞頂部可以產(chǎn)生3個(gè)、4個(gè)甚至5個(gè)分枝(圖版Ⅰ-g)。有時(shí)植物體末端分枝或細(xì)胞會(huì)呈現(xiàn)輕微彎曲或卷曲現(xiàn)象(圖版Ⅰ-h)。植物體細(xì)胞直徑較小, 主軸細(xì)胞直徑30.0—90.0 μm, 細(xì)胞長(zhǎng)寬比2.4—8.0。分枝細(xì)胞直徑25.0—70.0 μm, 長(zhǎng)寬比4.0—12.3。頂端細(xì)胞直徑25.0—50.0 μm, 長(zhǎng)寬比3.6—12.0。溫度變化、水流沖擊或者植物體老化等因素可能導(dǎo)致植物體斷裂或變短, 進(jìn)而形成絲狀團(tuán)塊漂浮于水面上, 顏色趨于黃色或淺黃色。漂浮的藻絲有時(shí)也繼續(xù)保持頂端或居間生長(zhǎng)。

生境及分布: 咸水(鹽度6‰—12‰), 著生, 生長(zhǎng)后期或漂浮。

新種詞源學(xué): 新種主要基于樣品采集地命名。

模式標(biāo)本: QH1501。

模式標(biāo)本產(chǎn)地: 青海湖(N36°38′25″, E100°27′01″)。

模式標(biāo)本保存地: 酒精及甲醛標(biāo)本均保存于中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所。

樣品編號(hào): QH1401, QH1402, QH1403, QH1404,QH1501, QH1502, QH1504和QH1505。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于SSU-LSU序列的聯(lián)合進(jìn)化分析(圖 1): 序列比對(duì)產(chǎn)生了一個(gè)包含53條SSU-LSU rDNA序列的矩陣, 以細(xì)弱根枝藻Rhizoclonium subtile和分枝根枝藻R. ramosum作為外類群。序列手工校正后的矩陣長(zhǎng)度為2230 bp。其中SSU全長(zhǎng)1651 bp, 有保守位點(diǎn)(Conserved sites)1594個(gè)(96.5%), 45個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)(Parsimony-informative sites)。LSU全長(zhǎng)579 bp, 有保守位點(diǎn)496個(gè)(85.7%), 57個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。堿基組成分析結(jié)果顯示平均的堿基組成為A=25.3%, T=23.2%, C=22.9%, G=28.7%, A+T的含量(48.4%)略低于G+C的含量(51.6%)。

基于ITS 序列的剛毛藻科系統(tǒng)發(fā)育分析(圖 2):本研究共選取86條ITS序列用于剛毛藻科的系統(tǒng)進(jìn)化分析, 選取細(xì)弱根枝藻R. subtile、厚壁根枝藻R.pachydermum和分枝根枝藻R. ramosum作為外類群。序列比對(duì)后產(chǎn)出一個(gè)長(zhǎng)度為1484 bp的基因序列矩陣。其中有820個(gè)可變位點(diǎn)(Variable sites),713個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)(Parsimony-informative sites)。堿基組成分析結(jié)果顯示平均的堿基組成為A=20.6%,T=21.9%, C=29.6%, G=27.9%, A+T的含量(42.5%)略低于G+C的含量(57.5%)。此外, 堿基的轉(zhuǎn)換/顛換偏好為0.89。

基于SSU-LSU和ITS序列所構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)中均包含了淡水、咸水和海洋剛毛藻樣品, 這兩個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致。其中淡水剛毛藻(以團(tuán)集剛毛藻C. glomerata為代表)單獨(dú)聚于一支, 位于進(jìn)化樹(shù)頂部, 與咸水剛毛藻(以散束剛毛藻C.vagabunda為代表)獨(dú)立開(kāi)來(lái)。而海洋剛毛藻(以蒼白剛毛藻C. albida為代表)則位于進(jìn)化樹(shù)的基部。在SSU-LSU聯(lián)合分析構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)中, QH1401和QH1402與其他5株青海湖的剛毛藻樣品存在一定遺傳差異, 其中QH1401/QH1402的SSU序列與其他樣品SSU序列存在1個(gè)堿基的差異、LSU序列存在4個(gè)堿基的差異。所有青海湖剛毛藻樣品(QH1401、QH1402、QH1403、QH1404、QH1501、QH1502、QH1504和QH1505)的ITS序列100%一致, 無(wú)遺傳差異。3個(gè)分子標(biāo)記比對(duì)結(jié)果表明青海湖剛毛藻樣品序列具有高度相似性, 堿基差異未達(dá)到種以上水平。SSU-LSU聯(lián)合分析顯示青海剛毛藻和達(dá)爾馬提亞剛毛藻C.cf.dalmatica和帕里亞迪剛毛藻C.cf.parriaudii具有較近親緣關(guān)系。青海剛毛藻與咸水剛毛藻聚為一個(gè)大支, 形成姐妹類群, 且支持率較高(1.00/88, 0.97/62)。在ITS進(jìn)化樹(shù)中, 青海剛毛藻C. qinghaiensis與史氏剛毛藻C. stimpsonii有較近的親緣關(guān)系, 支持值1.00/95。綜合比較構(gòu)建的2個(gè)進(jìn)化樹(shù), ITS構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)顯示了更大的基因序列差異, 各分支區(qū)分明顯, 支持度高。

圖 1 基于核糖體小亞基SSU和大亞基LSU聯(lián)合構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)Fig. 1 Molecular phylogenetic tree inferred based on sequences of SSU and LSU of the nuclear rDNA

3 討論

3.1 青海剛毛藻和相似種的形態(tài)學(xué)比較

青海剛毛藻具有剛毛藻屬的典型特征: 即植物體通過(guò)頂端分裂或居間分裂進(jìn)行生長(zhǎng), 具分枝, 色素體緊密排列在細(xì)胞側(cè)壁, 形成一個(gè)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。細(xì)胞長(zhǎng)寬比較大, 細(xì)胞核多數(shù), 蛋白核多數(shù)[14,15]。同時(shí)青海剛毛藻也具有咸水/海水剛毛藻類群的一些獨(dú)特特征, 如一個(gè)細(xì)胞頂部有時(shí)可同時(shí)形成4—5個(gè)分枝, 淡水類群一個(gè)細(xì)胞頂部通常則僅形成2—3個(gè)分枝[14]。此外, 青海剛毛藻藻絲分枝還具有內(nèi)折或輕微彎曲現(xiàn)象, 呈鐮刀形, 該特征也出現(xiàn)于散束剛毛藻、達(dá)爾馬提亞剛毛藻和亮剛毛藻C. laetevirens等剛毛藻中[14]。但此特征并不在同一個(gè)種的所有樣品或者培養(yǎng)樣品中均出現(xiàn), 說(shuō)明分枝內(nèi)折現(xiàn)象具有一定可塑性, 可能是受水流波動(dòng)影響所導(dǎo)致。

通過(guò)和目前已知的咸水剛毛藻種進(jìn)行比較, 青海剛毛藻具有一些較為細(xì)微的差異性特征。最明顯的區(qū)別是細(xì)胞直徑大小。史氏剛毛藻、散束剛毛藻、達(dá)爾馬提亞剛毛藻、束生剛毛藻C. fascicularis和亮剛毛藻等的細(xì)胞直徑均大于青海剛毛藻[14]。帕里亞迪剛毛藻植物體纖細(xì), 主枝和分枝細(xì)胞(14—20 μm)直徑小于青海剛毛藻[14]。此外, 分布、顏色及分枝特征也存在種間差異, 史氏剛毛藻主要分布于沿海和潮間帶地區(qū), 藻絲呈絹絲狀, 分枝多偏生[16,17]。細(xì)弱剛毛藻C. gracilis主要生長(zhǎng)與潮間帶石沼中, 藻絲亮灰綠色, 密集叢生, 有較多側(cè)生小枝[14,16,17]。

圖 2 基于內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)Fig. 2 Molecular phylogenetic tree inferred based on sequences of ITS

3.2 剛毛藻類群的系統(tǒng)進(jìn)化分析

從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)看, 剛毛藻屬目前可劃分為3大類群: 淡水類群(Freshwater group)、海洋類群(Marine water group)及咸水(過(guò)渡性)類群(Brackish water group)。海洋類群位于進(jìn)化樹(shù)的基部, 淡水類群位于進(jìn)化樹(shù)的頂部, 咸水支系則居于二者之間。這一進(jìn)化結(jié)果進(jìn)一步印證了剛毛藻是一個(gè)起源于海洋, 并逐漸向淡水過(guò)渡的類群[18—20]。Hayakawa等[8]對(duì)不同類型剛毛藻進(jìn)行的鹽度適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)顯示團(tuán)集剛毛藻在鹽度低于10‰的水環(huán)境有較好的生長(zhǎng)速率; 束生剛毛藻和亮剛毛藻在鹽度較高的水環(huán)境(海洋)中適宜生長(zhǎng), 鹽度低于16‰時(shí), 生長(zhǎng)速率降低;散束剛毛藻則對(duì)鹽度的耐受范圍較廣。這表明剛毛藻在進(jìn)化過(guò)程中, 面對(duì)不同生境產(chǎn)生了不同類型的種類, 這些種類具有各自的生理生態(tài)適應(yīng)范圍,這一范圍反過(guò)來(lái)又會(huì)影響剛毛藻的分布。因此本研究推測(cè), 青海剛毛藻這一種類的出現(xiàn)可能是剛毛藻適應(yīng)青海湖這一特殊生境的結(jié)果。

與形態(tài)特征相比, 分子數(shù)據(jù)可以較好的用于區(qū)分不同的剛毛藻類群。朱歡等[21]曾借助分子手段將淡水剛毛藻分為8個(gè)分支。盡管借助形態(tài)特征來(lái)清晰區(qū)分青海剛毛藻、史氏剛毛藻和散束剛毛藻較為困難, 但在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上三者則明顯分開(kāi), 形成不同種。此外, 剛毛藻屬樣品的SSU-LSU序列相對(duì)保守, 不同種間堿基差異較小, ITS序列卻呈現(xiàn)了較大的序列差異, 說(shuō)明在今后對(duì)剛毛藻進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析時(shí)選擇進(jìn)化速度相對(duì)較快的ITS序列可能更為有效。

基于以上形態(tài)和分子結(jié)果, 本研究建議將采集于青海湖的剛毛藻作為一個(gè)新種, 同時(shí)定名為青海剛毛藻。盡管剛毛藻類群形態(tài)具有一定可塑性, 種的鑒定相對(duì)困難, 但相信在今后更多分子數(shù)據(jù)和形態(tài)數(shù)據(jù)提供的基礎(chǔ)上, 剛毛藻的分類將日益清晰。

圖版Ⅰ 青海剛毛藻PlateⅠ Cladophora qinghaiensis sp. nov.