馮麒鳳 李戰(zhàn)福 黃先智 李 虹 翟旭亮 薛 洋 林仕梅 陳擁軍 羅 莉

(1. 西南大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 400715; 2. 家蠶基因組生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400715; 3. 重慶市水產(chǎn)技術(shù)推廣總站, 重慶 401121)

大鯢(Andrias davidianus), 俗稱“娃娃魚”, 屬兩棲綱(Amphibia)、有尾目(Caudata)、隱鰓鯢科(Cryptobrachidae)。因其肉質(zhì)鮮嫩, 營(yíng)養(yǎng)豐富, 且具有極高的藥用價(jià)值[1], 被譽(yù)為“水中人參”, 是我國(guó)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化和特色農(nóng)業(yè)重點(diǎn)開發(fā)的品種。目前大鯢的人工養(yǎng)殖以飼喂活餌及冰鮮魚蝦為主, 配合飼料使用還不普遍。大鯢在養(yǎng)殖過程中易患胃腸相關(guān)疾病, 長(zhǎng)期投喂冰鮮魚蝦時(shí)疾病問題尤為突出。因此迫切需要綠色和高效的添加劑來增強(qiáng)配合飼料的功效, 以改善其胃和腸功能, 提高其生長(zhǎng)性能, 優(yōu)化腸道微生態(tài)環(huán)境, 同時(shí)增強(qiáng)其免疫能力和抗應(yīng)激能力, 減少疾病的發(fā)生。

桑葉物提取物(Mulberry leaf extract, MLE)是桑葉經(jīng)水浸提后干燥而得, 富含生物堿、黃酮類和多糖等多種生物活性成分。1-脫氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin, DNJ)是MLE中主要活性物質(zhì)之一, 是一種多羥基哌啶生物堿。目前關(guān)于DNJ的研究多集中在藥理活性方面, 而關(guān)于DNJ作為飼料添加劑在水生動(dòng)物上的研究未見報(bào)道。研究表明,MLE和DNJ均具有降糖降脂、抗菌抗氧化和抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)等作用[2—6]。研究表明, 在蛋雞[7]、矮腳黃雞[8]和AA肉雞[9]的日糧中添加桑葉提取物或桑枝提取物, 可以提高養(yǎng)殖動(dòng)物的采食量和生長(zhǎng)性能, 在飼料中添加桑葉黃酮[10,11]和桑葉多糖[12,13]可提高養(yǎng)殖動(dòng)物生長(zhǎng)性能和機(jī)體抗氧化性能及腸道菌群多樣性, 添加DNJ可以改善小鼠腸道內(nèi)環(huán)境,調(diào)節(jié)腸道菌群[14,15]。本課題組先前的研究發(fā)現(xiàn), 添加適宜的MLE可提高中國(guó)大鯢的生長(zhǎng)性能、抗氧化能力、消化吸收功能和免疫功能[16]。至于MLE與DNJ作為飼料添加劑對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物胃、腸結(jié)構(gòu)和功能有無不同影響的研究尚未見相關(guān)報(bào)道。

基于此, 本實(shí)驗(yàn)以中國(guó)大鯢為研究對(duì)象, 比較研究MLE和DNJ對(duì)大鯢生長(zhǎng)、消化、免疫功能及腸道菌群的影響, 評(píng)價(jià)二者作用效果的異同, 并初步揭示其作用機(jī)制, 為科學(xué)應(yīng)用該綠色飼料添加劑,生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、高效和安全的大鯢配合飼料提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)飼料

飼料原料均購(gòu)于重慶市大發(fā)飼料有限公司, MLE由家蠶基因組生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供, DNJ(HPLC≥98%)購(gòu)于北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司。

以大鯢基礎(chǔ)飼料為對(duì)照組, 分別添加0.75%的MLE和0.04‰的DNJ為MLE組和DNJ組, 用膨潤(rùn)土調(diào)平, 配制3種等氮等脂的實(shí)驗(yàn)飼料, 實(shí)驗(yàn)飼料配方及主要營(yíng)養(yǎng)水平見表 1。其中, MLE和DNJ的添加劑量設(shè)置依據(jù)為根據(jù)前期大鯢配合飼料中MLE添加量的研究, 設(shè)置本實(shí)驗(yàn)MLE添加量為0.75%, 同時(shí)根據(jù)本批次桑葉提取物中DNJ的含量, 換算該MLE添加量下飼料中DNJ添加量為0.04‰。飼料原料過60目篩, 混合制粒機(jī)制成直徑3 mm的硬顆粒飼料, 風(fēng)干后–20℃保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)鯢飼養(yǎng)與管理

實(shí)驗(yàn)大鯢購(gòu)于陜西省漢中市綠源大鯢養(yǎng)殖場(chǎng),大鯢饑餓5d后以對(duì)照組飼料馴養(yǎng)15d。選擇72尾規(guī)格均勻、體質(zhì)健壯的大鯢[初始體質(zhì)量(47.81±0.23) g],隨機(jī)置于9個(gè)70 cm×45 cm×17.5 cm的塑料方形箱中, 每箱8尾大鯢, 分為3組, 每組3個(gè)重復(fù)。

每天17:00飽食投喂, 投喂2d停食1d。水深3—5 cm, 每天早晚用曝氣自來水100%換水, 正式實(shí)驗(yàn)90d。飼養(yǎng)期間避光, 水溫19—23℃, 溶解氧＞6.0 mg/L, 氨氮含量＜0.10 mg/L, 亞硝酸鹽含量＜0.10 mg/L, pH 6.5—7.0。

表 1 實(shí)驗(yàn)飼料配方及主要營(yíng)養(yǎng)成分(風(fēng)干基礎(chǔ))Tab. 1 Formulation and nutrient composition of diets (air-dry basis)

1.3 樣品采集

因大鯢消化食物時(shí)間較長(zhǎng), 在養(yǎng)殖結(jié)束后, 停食72h。MS-222麻醉, 分別計(jì)數(shù)、稱重。每個(gè)重復(fù)取3尾大鯢, 冰盤中解剖, 分離胃和腸道, 取前腸分別于多聚甲醛和戊二醛固定液中固定, 用于石蠟切片和掃描電鏡的制備; 胃及其余腸道組織液氮速凍后–80℃中保存。另外, 每重復(fù)取3尾實(shí)驗(yàn)鯢, MS-222麻醉后于無菌操作臺(tái)上分離腸道并收集腸道內(nèi)容物, 液氮速凍后–80℃保存, 用于腸道微生物多樣性分析; 取前腸于1.5 mL無酶管后液氮速凍, –80℃保存, 用于腸道免疫相關(guān)基因表達(dá)量測(cè)定。

1.4 生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定

生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定: 采用以下公式計(jì)算生長(zhǎng)性能和生物學(xué)性狀: 攝食量(Feed intake,FI, g)=∑F0–∑Fr; 增重率(Weight gain rate,WGR, %)=(Wt–W0)/W0×100;平均日增重(ADG, g/d)=(Wt–W0)/t; 飼料效率(Feed Efficiency,FE, %)=(Wt–W0)/F×100。式中,W0為起始鯢尾均重(g);Wt為終末鯢尾均重(g);F0為每次投喂量(g);Fr為每次殘餌量(g);F為尾均攝食量(g);t為飼喂天數(shù)。

1.5 腸道組織結(jié)構(gòu)與消化酶指標(biāo)測(cè)定

前腸石蠟組織切片制樣: 多聚甲醛固定后, 乙醇脫水, 置于二甲苯中透明, 用低熔點(diǎn)的石蠟包埋成蠟塊, 用Leica UC7 RT切片機(jī)連續(xù)切片, 厚度為4 μm, 展片后HE染色, 中性樹膠封片。

前腸掃描電鏡制樣: 經(jīng)戊二醛固定后, 蒸餾水漂洗樣品, 乙醇脫水, 環(huán)氧丙烷處理2次, 臨界點(diǎn)干燥, EIKO離子濺射儀鍍膜, 處理好的樣品在JSM-6380LV型掃描電鏡中觀察并拍照。

消化酶指標(biāo)的測(cè)定: 胃蛋白酶、胰蛋白酶、脂肪酶、H+-K+-ATP酶和Na+-K+-ATP酶活力采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定, 碳酸酐酶(CA)采用上海優(yōu)選Elisa試劑盒測(cè)定。

腸黏膜屏障指標(biāo)測(cè)定: 內(nèi)毒素和D-乳酸指標(biāo)采用上海優(yōu)選Elisa試劑盒測(cè)定。

1.6 腸道抗氧化指標(biāo)測(cè)定

腸道總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定。

1.7 Illumina-HiSeq宏基因組測(cè)序

采用DNA提取試劑盒(TaKaRa)提取腸道細(xì)菌總DNA后進(jìn)行16S rDNA(V3+V4)區(qū)擴(kuò)增特異區(qū)域,細(xì)菌16S rDNA(V3+V4)區(qū)域引物為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。擴(kuò)增好的DNA序列, 經(jīng)1.8%瓊脂糖(TaKaRa, 100 bp)電泳檢測(cè)陽性后, 委托百邁客生物科技有限公司用Illumina HiSeq高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行序列測(cè)定和分析。

1.8 總RNA的提取與免疫相關(guān)基因表達(dá)量測(cè)定

按照RNAiso Plus試劑盒(TaKaRa)的方法提取肝臟組織總RNA, 用1.2%瓊脂糖凝膠Agarose Regular (TaKaRa) 電泳檢測(cè)RNA完整性, 并用核酸測(cè)定儀(Thermo Fisher)測(cè)定RNA的純度和濃度。采用Premix ScriptTMRT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)得到cDNA, 于–20℃保存?zhèn)溆?。根?jù)本課題組大鯢腸道轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA Seq)結(jié)果, 設(shè)計(jì)特異性引物(表 2), 委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用ABI7500 型熒光定量PCR儀(Applied Biosystems,美國(guó))進(jìn)行RT-PCR。反應(yīng)體系: 總體積20 μL, 2 μL cDNA模板, 10 μL SYBR Premix ExTaqTM(TaKaRa),上、下游引物各0.5 μL, 7 μL ddH2O。RT-PCR反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性60s, 95℃變性5s, 60℃退火30s, 共40個(gè)循環(huán), 每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù), 以EF l-α作為內(nèi)參, 分別測(cè)定腸道組織IL-8、IL-10、TOR、pIgR、TLR2、MyD88和IRAK4相對(duì)表達(dá)量, 結(jié)果以2–ΔΔCt表示。

表 2 免疫相關(guān)基因及內(nèi)參基因引物序列Tab. 2 Primers used for quantitative real-time PCR

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析(One-way ANOVA)。用Duncan氏多重比較分析組間差異顯著性程度, 顯著水平為(P＜0.05)。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)形式表示。

2 結(jié)果

2.1 生長(zhǎng)性能及飼料利用指標(biāo)

由表 3可知, MLE和DNJ組的FBW、WGR、ADG及FE均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05), 而MLE和DNJ組間無顯著差異(P＞0.05)。其中, MLE和DNJ組的WGR分別較對(duì)照組提高了39%和46%,FE提高了20%和27%。此外, MLE組的FI顯著高于對(duì)照組(P＞0.05)。

表 3 MLE和DNJ對(duì)大鯢生長(zhǎng)性能及飼料效率的影響Tab. 3 Effects of MLE and DNJ on growth performance and feed utilization of Andrias davidianus

2.2 胃的消化、泌酸能力指標(biāo)

由表 4可知, MLE組和DNJ組CA酶活性均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05), 而MLE組與DNJ組差異不顯著(P＞0.05)。MLE組胃蛋白酶和H+-K+-ATP酶活性均顯著高于對(duì)照組和DNJ組(P＜0.05), 而DNJ組與對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05), MLE組胃蛋白酶和H+-K+-ATP酶活性分別較DNJ組提高了45%和9%。

2.3 腸道消化、吸收能力指標(biāo)

由表 5可知, 與對(duì)照組相比, MLE組和DNJ組胰蛋白酶和脂肪酶活力均顯著提高(P＜0.05), 淀粉酶活力顯著降低(P＜0.05)。其中, MLE組和DNJ組胰蛋白酶活力較對(duì)照組分別升高了69%和59%, 脂肪酶較對(duì)照組分別升高了16%和13%。MLE組胰蛋白酶和Na+-K+-ATP酶活力均顯著高于DNJ組(P＜0.05), 其中, Na+-K+-ATP酶活性較DNJ組提高了14%。MLE組和DNJ組的脂肪酶和淀粉酶活力無顯著性差異(P＞0.05)。

2.4 腸黏膜通透性指標(biāo)

由表 6可知, 與對(duì)照組相比, MLE和DNJ組血漿內(nèi)毒素含量顯著降低, 其中, MLE組顯著低于DNJ組(P＜0.05)。MLE組D-乳酸含量顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。DNJ組D-乳酸含量與對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05)。

表 4 MLE和DNJ對(duì)大鯢胃功能的影響Tab. 4 Effects of MLE and DNJ on gastric function of Andrias davidianus (U/mg)

表 5 MLE和DNJ對(duì)大鯢腸道消化吸收功能的影響Tab. 5 Effects of MLE and DNJ on intestinal digestion and absorption function of Andrias davidianus (U/mg)

表 6 MLE和DNJ對(duì)大鯢腸黏膜通透性影響的比較Tab. 6 Effects of MLE and DNJ on intestinal permeability of Andrias davidianus

2.5 腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)及腸黏膜上皮細(xì)胞緊密連接結(jié)構(gòu)觀察

由圖 1和表 7可知, 與對(duì)照組相比, MLE組和DNJ組腸道絨毛數(shù)量分別增加了16%和12%(P＜0.05)。MLE組絨毛高度顯著高于對(duì)照組和DNJ組(P＜0.05)。MLE組和DNJ組的腸道空腔率分別較對(duì)照組降低27%和12%(P＜0.05), MLE組空腔率顯著低于DNJ組。

圖 1 MLE與DNJ對(duì)大鯢前腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響(HE染色，40×)Fig. 1 Effects of MLE and DNJ on intestinal morphology and structure of Andrias davidianus

表 7 MLE與DNJ對(duì)大鯢腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響Tab. 7 Effects of MLE and DNJ on intestinal morphology and structure of Andrias davidianus

通過圖 2掃描電鏡結(jié)果的觀察, MLE組和DNJ組上皮細(xì)胞間緊密程度高于對(duì)照組, 且相比之下,MLE組上皮細(xì)胞間的連接更加緊密。

圖 2 MLE與DNJ對(duì)大鯢腸黏膜細(xì)胞緊密連接結(jié)構(gòu)的影響Fig. 2 Effects of MLE and DNJ on tight junctions in intestinal mucosa of Andrias davidianus

2.6 腸道抗氧化能力指標(biāo)

由表 8可知, MLE組腸道總抗氧化能力(T-AOC)顯著高于對(duì)照組和DNJ組(P＜0.05)。MLE組和DNJ組腸道MDA含量顯著低于對(duì)照組(P＜0.05), 分別較對(duì)照組降低了28%和16%, MLE組和DNJ組的T-AOC和MDA含量無顯著差異(P＞0.05)。

表 8 MLE與DNJ對(duì)大鯢腸道抗氧化能力的影響Tab. 8 Effects of MLE and DNJ on intestinal antioxidant of Andrias davidianus

2.7 腸道免疫基因相對(duì)表達(dá)量

由圖 3可知, MLE和DNJ的添加對(duì)大鯢腸道免疫相關(guān)基因表達(dá)量有不同程度的影響。相較對(duì)照組, MLE組TOR、IL-10、pIgR、TLR2、MyD88和IRAK4表達(dá)量顯著提高(P＜0.05), DNJ組pIgR和MyD88表達(dá)量顯著提高(P＜0.05)。

MLE組TOR、IL-10和pIgR表達(dá)量較DNJ組顯著提高(P＜0.05), 其他基因表達(dá)量與DNJ組無顯著差異(P＞0.05)。

2.8 腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

運(yùn)用usearch進(jìn)行聚類劃分共獲得255個(gè)OTUs(圖 4a), 其中有180個(gè)OTUs是3個(gè)組共有的, 占三者的70.59%; MLE與DNJ共有OTUs占兩者總數(shù)的93%, CTR與MLE、DNJ共有OTUs分別占兩者總數(shù)的73%和75%。通過圖 4b發(fā)現(xiàn), MLE組與DNJ組聚為一枝, 而CTR組獨(dú)立一枝。在門和屬水平上進(jìn)行物種豐度分析, 共有14個(gè)門163個(gè)屬的細(xì)菌被發(fā)現(xiàn),3個(gè)處理組的最具優(yōu)勢(shì)菌門均為厚壁菌門(Firmicutes), MLE和DNJ組厚壁菌門豐度較對(duì)照組下降,MLE組變形菌門(Proteobacteria)豐度高于CTR及DNJ組(圖 4c)。在屬水平上, MLE組和DNJ組均以Romboutsia為優(yōu)勢(shì)菌屬, 而對(duì)照組以Runimococcaceae為優(yōu)勢(shì)菌屬(圖 4d)。

測(cè)試結(jié)果覆蓋率均在99.9%以上, MLE組和DNJ組Chao1和Ace指數(shù)要比CTR組高, MLE組的香農(nóng)指數(shù)最高, 辛普森指數(shù)最低(表 9)。

3 討論

3.1 MLE和DNJ對(duì)大鯢生長(zhǎng)性能影響的比較

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 添加MLE和DNJ均提高了大鯢的生長(zhǎng)性能和飼料效率。宋瓊莉等[8]在矮腳黃雞飼料中分別添加0.2%、0.5%和0.8%的MLE, 發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的日增重和平均日采食量均比對(duì)照組顯著增高; 范京輝等[9]在AA肉雞上添加0.3%的MLE, 肉雞生長(zhǎng)速度和日糧表觀消化率均提高[17]; 李婉濤等[18]在日糧中添加0.3%的杜仲和MLE, 發(fā)現(xiàn)育肥豬的平均日增重和飼料報(bào)酬顯著提高; 此外, 本課題組先前的研究已經(jīng)證明添加適宜含量的MLE可以提高大鯢的生長(zhǎng)性能以及飼料利用率[16], 與本研究結(jié)果相似。而關(guān)于DNJ對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)性能影響的研究未見報(bào)道。桑葉提取物富含多種天然活性成分, 其中,桑葉黃酮[19]和多糖[12]等已被證明可以提高養(yǎng)殖動(dòng)物生長(zhǎng)性能, 這些單體活性成分可能在大鯢體內(nèi)發(fā)揮了協(xié)同效應(yīng)共同起到了促生長(zhǎng)作用。另外, MLE組和DNJ組大鯢攝食量提高是其生長(zhǎng)性能提高的可能原因之一, 關(guān)于MLE提高養(yǎng)殖動(dòng)物攝食量在大鯢[16]和矮腳黃雞[8]等的研究中得到了證實(shí)。

圖 3 MLE和DNJ對(duì)大鯢腸道免疫相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig. 3 Effects of MLE and DNJ on intestinal immune related gene expression of Andrias davidianus

3.2 MLE和DNJ對(duì)大鯢胃和腸道消化、吸收能力影響的比較

動(dòng)物獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要是通過胃、腸的消化與吸收作用實(shí)現(xiàn)的。在胃酸和胃蛋白酶的作用下,實(shí)現(xiàn)對(duì)飼料蛋白的初步消化。鹽酸的分泌是在H+-K+-ATP酶(又稱為胃質(zhì)子泵或酸泵)和碳酸酐酶(CA)的共同作用下完成的, 這2種酶是反映胃泌酸能力的指標(biāo)[20,21]。關(guān)于MLE和DNJ對(duì)胃消化酶的影響尚未見報(bào)道。在本研究中, 添加MLE提高了胃CA酶、蛋白酶和H+-K+-ATP酶活力, 添加DNJ提高了胃CA酶活力?？梢娞砑覯LE可以提高大鯢胃的消化及泌酸能力, 而添加DNJ僅對(duì)胃的泌酸能力有所改善, 這可能是桑葉提取物中除了DNJ之外, 有其他活性成分在提高胃的消化及泌酸能力方面了發(fā)揮作用。楊春濤[22]的研究表明, 桑葉黃酮可以提高瘤胃a-淀粉酶以及皺胃蛋白酶活性從而提高犢牛對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化能力; 彭思博等[23]發(fā)現(xiàn)飼料中添加60—120 mg/kg的γ-氨基丁酸, 烏鱧(Ophicephalus argus)腸道胰蛋白酶和脂肪酶活性顯著提高。

腸道是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的主要場(chǎng)所。在腸道內(nèi), 食物在胰蛋白酶和脂肪酶等的作用下消化分解為小分子物質(zhì), 通過腸絨毛內(nèi)的乳糜管和毛細(xì)血管吸收入血, 為機(jī)體提供營(yíng)養(yǎng)。腸道消化吸收酶活力、絨毛高度和數(shù)量的提高及空腔率的降低反映腸道消化、吸收能力的提高。王永昌[24]和王詠梅等[10]的研究表明, 桑葉粉和桑葉黃酮可以改善腸道結(jié)構(gòu), 提高消化吸收能力。在本研究中, 飼料中添加MLE和DNJ均能促進(jìn)大鯢腸道發(fā)育, 改善腸道的形態(tài)結(jié)構(gòu), 提高腸道蛋白酶和脂肪酶活力, 同時(shí)降低了腸道淀粉酶活力。大鯢作為肉食性水產(chǎn)動(dòng)物, 對(duì)淀粉的利用率較低。對(duì)于肉食性動(dòng)物來說,提高機(jī)體對(duì)飼料蛋白和脂肪的消化吸收, 降低對(duì)淀粉的利用是有利的。MLE和DNJ對(duì)腸道淀粉酶活力有抑制作用, 這可能與桑葉中的生物堿抑制機(jī)體對(duì)二糖類分解酶活性密切相關(guān)[25], 相似的結(jié)果在Nuraniye等[26]的研究中也有發(fā)現(xiàn)。

圖 4 MLE和DNJ對(duì)大鯢腸道菌群的結(jié)構(gòu)分析Fig. 4 Effects of MLE and DNJ on intestinal flora structure of Andrias davidianus

表 9 腸道菌群Alpha多樣性指數(shù)Tab. 9 Alpha diversity indices of samples

3.3 MLE和DNJ對(duì)大鯢腸黏膜屏障功能影響的比較

腸道是機(jī)體抵御病原體入侵的第一道屏障, 其結(jié)構(gòu)和功能完整性是維持養(yǎng)殖動(dòng)物腸道健康的基礎(chǔ)。腸道上皮細(xì)胞緊密連接及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)是維持腸道通透性的物質(zhì)基礎(chǔ), 保證營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的正常運(yùn)轉(zhuǎn),同時(shí)阻止有害物質(zhì)進(jìn)入[27]。腸道上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損會(huì)破壞腸黏膜屏障功能, 致使腸道通透性增加,使得內(nèi)毒素等有害物質(zhì)透過上皮細(xì)胞, 隨血液循環(huán)至全身各處, 危害養(yǎng)殖動(dòng)物健康。D-乳酸是胃腸道細(xì)菌的代謝產(chǎn)物; 內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁成分, 正常情況下由于腸黏膜屏障功能完整難以進(jìn)入血液循環(huán)[28]。當(dāng)屏障功能受損時(shí), 細(xì)胞內(nèi)的D乳酸會(huì)釋放出來, LPS穿過腸黏膜, 進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng),從而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒害作用。因此, 血漿中的DAO活力及內(nèi)毒素、D-乳酸含量可反映腸道損傷狀態(tài)。有研究表明, 在NASH小鼠日糧中添加DNJ可以上調(diào)腸道ZO-1的表達(dá)水平, 增強(qiáng)腸黏膜屏障功能[15],與本研究結(jié)果相似。在本研究中, 添加MLE和DNJ均降低了血液中內(nèi)毒素和D-乳酸, 但二者差異較大, MLE降低幅度較大, DNJ降低幅度較小。有研究表明, 植物多糖[29]和黃酮[29]等活性物質(zhì)可以增加細(xì)胞間緊密連接蛋白的表達(dá), 有利于調(diào)節(jié)腸黏膜屏障通透性、保持上皮結(jié)構(gòu)完整和修復(fù)受損的腸黏膜屏障。MLE中的多糖和黃酮類物質(zhì)可能與DNJ發(fā)揮了協(xié)同作用增強(qiáng)了大鯢的腸黏膜屏障功能。

3.4 MLE和DNJ對(duì)大鯢腸道抗氧化能力影響的比較

抗氧化能力的強(qiáng)弱是衡量機(jī)體健康程度重要指標(biāo)。腸道與外源物質(zhì)直接接觸, 因此極易產(chǎn)生各種氧化應(yīng)激反應(yīng), 影響腸道的正常生理功能。TAOC和MDA是反映機(jī)體抗氧化綜合能力的指標(biāo)。MDA是體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物, 其含量的高低反映了體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度。MLE和DNJ的抗氧化作用在其他研究中得到證實(shí), 如桑葉水提物可以降低糖尿病大鼠血清中MDA含量[30], DNJ可以提高胃潰瘍小鼠胃的抗氧化能力, 具體表現(xiàn)為抗氧化酶活性提高, MDA含量降低[31]。本研究得到了與前人相似的結(jié)果, 在大鯢飼料中添加MLE和DNJ均可提高腸道總抗氧化能力, 降低丙二醛含量,但二者差異較大, MLE對(duì)腸道抗氧化能力的增強(qiáng)效果優(yōu)于DNJ。除DNJ外, 桑葉提取物中所含的桑葉多酚[32]、黃酮[33]和多糖[34]等物質(zhì)也具有較好的抗氧化作用, 這些活性成分與DNJ一同發(fā)揮了抗氧化作用, 這可能是本研究中MLE組腸道抗氧化能力強(qiáng)于DNJ組的主要原因。

3.5 MLE和DNJ對(duì)大鯢腸道免疫相關(guān)基因影響的比較

腸道不僅是主要的消化吸收與抗氧化器官, 也是機(jī)體重要的免疫器官。IL-8和IL-10由活化的免疫細(xì)胞產(chǎn)生, IL-8是重要的促炎細(xì)胞因子, IL-10是抗炎因子, 在控制和消除炎癥中起重要作用[35,36]。多聚免疫球蛋白受體(pIgR)參與多聚免疫球蛋白(pIg)的轉(zhuǎn)運(yùn), 與免疫球蛋白的形成有關(guān)。TLRs識(shí)別病原體表面的脂多糖、酵母多糖、肽聚糖和脂蛋白等PAMP, 通過MAL與接頭蛋白MyD88結(jié)合,并向下游傳遞信號(hào), 募集IRAK家族成員, 引起一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng), 調(diào)控炎癥因子的轉(zhuǎn)錄。DNJ及其他桑葉活性成分如桑葉黃酮等的免疫作用在其他研究中得到證實(shí), 例如, DNJ降低了糖尿病小鼠肝臟組織中TNF-α, IL-1β和IL-6的水平[31,37]。在本實(shí)驗(yàn)中,添加MLE和DNJ均可以提高大鯢腸道免疫能力,MLE不同程度上調(diào)了IL-10、pIgR、TLR2、MyD88和IRAK4的表達(dá), 可能是通過TLR2→MyD88→IRAK4信號(hào)通路途徑激活機(jī)體免疫系統(tǒng), 提高抗炎因子IL-10和多聚免疫球蛋白受體的表達(dá), 改善大鯢腸道免疫功能, 而DNJ的提高效果不及MLE, 這可能是MLE中所含的桑葉多糖增強(qiáng)了大鯢的免疫功能。有研究表明, 桑葉多糖能增強(qiáng)長(zhǎng)期大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)小鼠機(jī)體免疫功能, 調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞及免疫分子,其中桑葉多糖中、高劑量的效果尤為明顯[38]。

3.6 MLE和DNJ對(duì)大鯢腸道菌群結(jié)構(gòu)影響的比較

腸道微生物群作為一種新的功能器官和營(yíng)養(yǎng)靶點(diǎn), 參與人體多種代謝, 其重要性受到越來越多的關(guān)注[39]。通過Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)等Alpha多樣性指標(biāo)反映了腸道微生物的豐富度和均勻度。本研究顯示, 在飼料中添加MLE和DNJ對(duì)腸道菌群有影響, 可以提高腸道菌群的豐富性和多樣性, MLE組和DNJ組腸道菌群結(jié)構(gòu)也更加接近; 在門水平上, 厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinbacteria)為大鯢腸道優(yōu)勢(shì)菌群, 這一結(jié)果與許超[40]在大鯢上的研究一致。有研究表明, 添加DNJ[14,15]、桑葉多糖[41]和桑葉粉[42]等可以促進(jìn)小鼠腸道有益菌的生長(zhǎng)并抑制有害菌的生長(zhǎng), 改善腸道菌群結(jié)構(gòu)。此外, 在本實(shí)驗(yàn)中, 添加MLE和DNJ降低了大鯢腸道厚壁菌門的豐度, 添加MLE提高了擬桿菌門的豐度, Yuan等[42]和Zheng等[15]在桑葉粉和DNJ上的研究得到了相似的結(jié)果。在屬水平上, 對(duì)照組腸道優(yōu)勢(shì)菌群為瘤胃球菌科中的屬, 添加MLE和DNJ后, 瘤胃球菌科細(xì)菌豐度降低, 而Romboutsia豐度增加并成為優(yōu)勢(shì)菌屬。瘤胃球菌科細(xì)菌和Romboutsia均屬梭菌目, 能夠降解纖維素, 是腸道中的有益菌[43,44]。

4 結(jié)論

在日糧中添加MLE可以提高大鯢生長(zhǎng)性能, 促進(jìn)腸道發(fā)育, 提高大鯢胃和腸消化吸收、抗氧化與免疫功能, 改善腸道菌群結(jié)構(gòu), 提高腸道微生物多樣性; 而添加DNJ對(duì)大鯢腸道消化、抗氧化、免疫能力及腸道發(fā)育有一定改善作用, 改善腸道菌群結(jié)構(gòu)。綜合胃和腸結(jié)構(gòu)和功能, 復(fù)合MLE較單體DNJ效果更優(yōu)。