楊賀舒 孫俊霄 袁勇超 樊啟學 李明波 莫愛杰

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院, 長江經(jīng)濟帶大宗水生生物產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展教育部工程研究中心, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物繁育重點實驗室, 湖北省水生動物病害防控工程技術(shù)研究中心, 武漢 430070; 2. 潛江市水產(chǎn)技術(shù)推廣中心, 潛江 433100)

隨著集約化養(yǎng)殖程度的不斷提高, 近年來魚粉供應量的短缺和不穩(wěn)定導致魚粉價格不斷飆升, 尋找優(yōu)質(zhì)蛋白源替代魚粉(FM)成為水產(chǎn)動物營養(yǎng)研究的熱點和難點[1—3]。目前, 許多研究學者開展了有關(guān)植物蛋白源替代魚粉對水生動物生長性能影響的研究。如果水產(chǎn)飼料中植物蛋白添加量達到適宜比例, 水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的生長性能及飼料利用效率達到最佳水平, 飼料性價比獲得最好體現(xiàn)[4]。這也是研究者們最期望達到的研究目標, 但該適宜添加水平因?qū)嶒瀯游锓N類、實驗動物大小、飼料配方組成和具體養(yǎng)殖條件而存在較大差異[5]。當水產(chǎn)飼料中植物蛋白添加量超過適宜比例時, 隨著飼料中植物蛋白源替代魚粉蛋白比例的上升, 水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的生長性能會表現(xiàn)出急劇下降[6,7]。與植物蛋白源相比, 動物蛋白源通常具有較好的適口性, 氨基酸組成也較為平衡[8,9]。其中, 昆蟲蛋白被認為是動物蛋白源中一種較為優(yōu)質(zhì)的潛在蛋白來源[3,10,11]。昆蟲蛋白原料蛋白質(zhì)含量高, 富含必需氨基酸和不飽和脂肪酸[12], 但因其成分具有不確定性, 限制了昆蟲蛋白在飼料中的廣泛使用。家蠅的繁殖速度快, 生命周期較短, 繁殖率高, 是優(yōu)質(zhì)的昆蟲資源之一[12]。蠅蛆粉的蛋白含量約為 50%, 粗脂肪含量為8%—20%, 富含礦物質(zhì)和微量元素等營養(yǎng)成分[3,11,13,14]。同時, 蠅蛆蛋白中含有幾丁質(zhì)、抗菌肽和溶菌酶等免疫活性物質(zhì), 在飼料中使用可以提高水產(chǎn)動物的抗病能力[15]。劉黎等[16]研究發(fā)現(xiàn), 在飼料中添加5%的蠅蛆蛋白青魚的終末體重和特定生長率顯著升高且可以提高青魚的肝胰臟消化酶活力。劉遠紅等[17]發(fā)現(xiàn), 蠅蛆粉替代魚粉水平小于40%時, 對黃顙魚的肌肉品質(zhì)沒有顯著影響。而蠅蛆粉在不同的養(yǎng)殖魚類中使用會對其幼魚的生長性能產(chǎn)生不同的影響, 有些魚類沒有表現(xiàn)出顯著性的差異, 而有些魚類的生長性能表現(xiàn)出顯著性下降,同時對魚類抗氧化能力也存在一定的影響[3,11,13,14]。

黃顙魚Pelteobagrus fulvidraco(Richardson)隸屬鲇形目 (Siluriformes)、鲿科 (Bagridae)、黃顙魚屬 (Pelteobagrus), 俗名黃姑魚、黃嘎、黃臘丁等,廣泛分布于我國江河、湖泊、水庫等自然水域的底棲、小型、經(jīng)濟魚類[18]。受市場消費需求的影響, 黃顙魚養(yǎng)殖面積增長較快, 養(yǎng)殖產(chǎn)量已從 2003年的 5.48×107kg增長至 2018 年的 51×107kg, 16 年時間增長了近 9 倍, 發(fā)展成為南至兩廣、北至遼寧、東起江浙、西至川陜及中部各大省份的全國性養(yǎng)殖魚類[19]。雜交黃顙魚“黃優(yōu) 1 號”是采用群體選育, 以主要生長性能指標(體重)為選育目標進行逐代選育和篩選, 嚴格按照“黃優(yōu)1號”繁育技術(shù)路線及工藝流程進行苗種繁育, 歷時多年培育出的水產(chǎn)新品種, 與普通黃顙魚相比, 雜交黃顙魚“黃優(yōu)1 號”具有生長快、攝食量大和更好的耐低氧等能力[20,21]。目前關(guān)于魚粉替代對普通黃顙魚的影響有少量報道[22—25], 但對雜交黃顙魚的影響還未見報道。本實驗的目的是評估蠅蛆粉替代魚粉對雜交黃顙魚生長性能、體組成和抗氧化能力的影響, 為蠅蛆蛋白在雜交黃顙魚飼料中的應用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 飼料配方與飼料制作

配置 6 組等蛋白的飼料(表 1), 在對照組(G0)中, 飼料粗蛋白含量為 42%, 魚粉提供 50% 的蛋白含量, 使用蠅蛆粉分別替代魚粉, 替代比例分別為 20%、40%、60%、80% 和 100% 的魚粉蛋白。使用的魚粉及蠅蛆粉的營養(yǎng)成分及氨基酸的組成見表 2。蠅蛆粉購自榮飛生態(tài)科技有限公司(安徽蕪湖)。飼料原料經(jīng)過 60 目篩, 在充分混勻后, 使用制粒機將其壓制為 2 mm直徑的飼料顆粒,50℃ 烘干水分, 使用自封袋封口, 并于 ?20℃ 冰箱中保存。

表 1 飼料配方及營養(yǎng)成分(干物質(zhì)基礎(chǔ))Tab. 1 Composition of diets (dry basis)

表 2 魚粉與蠅蛆粉常規(guī)營養(yǎng)成分與氨基酸含量(g/100 g, 干重)Tab. 2 Proximate and amino acid compositions of reference and ingredients used in the test diets (g/100 g, dry basic)

1.2 養(yǎng)殖實驗和樣品采集

本實驗使用的雜交黃顙魚“黃優(yōu) 1 號”(Pelteobagrus vachelli♂×Pelteobagrus fulvidraco♀)由湖北黃優(yōu)源漁業(yè)發(fā)展有限公司魯湖基地提供。挑選規(guī)格整齊, 健康無病的幼魚 720 條, 初始體重為(0.62±0.01) g。

實驗在華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院科研基地的流水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進行, 使用體積為 180 L 的玻璃養(yǎng)殖缸進行養(yǎng)殖。在實驗開始前, 所有實驗魚在流水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng) 2 周, 暫養(yǎng)期間投喂 G0 組飼料, 使實驗魚適應養(yǎng)殖環(huán)境。將實驗魚隨機分為 6 組, 每組3 個重復, 每個重復 40 尾幼魚。每組分別飼喂表 1中的 6 組飼料, 每天投喂2次, 投喂時間分別為 8:00和 18:00, 實驗周期為8周。在實驗過程中全程保持曝氣, 水溫維持在 23—29℃, 溶解氧 ≥6.5 mg/L,pH 7.0—7.3。

實驗開始前稱取雜交黃顙魚幼魚體長與體重。在養(yǎng)殖實驗結(jié)束時, 禁食 24h 后取出每個養(yǎng)殖缸中的所有實驗魚, 以 MS-222 溶液麻醉, 然后計數(shù)并稱重, 測量魚體體長, 每平行隨機撈取12條魚,其中6條直接置于?80℃ 保存, 用于測定全魚常規(guī)營養(yǎng)成分, 其余幼魚使用注射器尾靜脈采血置于離心管中, 之后解剖得到肝臟和內(nèi)臟并分別稱重。采集的血液樣本經(jīng)過靜置并于 3000 r/min離心 15min,取上清液即為血清。將得到的肝臟與血清樣本立即使用液氮冷凍, 并在取樣結(jié)束后轉(zhuǎn)入?80℃ 冰箱進行保存, 用于之后測定抗氧化指標。測定之前將肝臟組織以體積 1∶9 加預冷生理鹽水并勻漿, 在4℃下 3000 r/min 離心 10min, 取上清液, 按比例稀釋后用于抗氧化酶活性分析。

1.3 測定指標與計算方法

常規(guī)營養(yǎng)指標的測定全魚及飼料常規(guī)營養(yǎng)成分使用以下方法進行分析: 水分含量采用 105℃烘干法, 粗蛋白含量通過凱氏定氮法測定, 粗脂質(zhì)通過索氏抽提法測定, 粗灰分使用馬弗爐在 550℃高溫燒灼測定。氨基酸測定采用酸水解法(色氨酸用 NaOH 水解)測定。

抗氧化酶活性的測定血清和肝臟谷胱甘肽還原酶(GR)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性、總抗氧化能力(T-AOC)測定采用南京建成生物工程研究所的試劑盒, 具體測定方法見試劑盒說明書。

指標計算增重率(Weight gain rate,WGR, %) =100×(終末均重?初始均重)/初始均重

特定生長率(Specific growth rate,SGR, %/d)=100×(ln 終末均重–ln 初始均重)/養(yǎng)殖天數(shù);

飼料系數(shù)(Feed Conversion ratio,FCR)=攝食飼料干重/(終末均重?初始均重)

存活率(Survival rate,SR, %)=100×終末尾數(shù)/初始尾數(shù)

臟體比(Viscerosomatic index,VSI)=100×內(nèi)臟重/終末體重

肝體比(Hepatosomatic index,HSI)=100×肝臟重/終末體重

肥滿度(Condition factor,CF, g/cm3)=100×體重/體長3

1.4 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均使用 SPSS Statistics 19 軟件進行單因素方差分析(ANOVA), 差異顯著時(P＜0.05)通過 Duncan 氏檢驗進行多重比較分析, 所有結(jié)果均以(平均值±標準差)表示。

2 結(jié)果

2.1 蠅蛆粉替代魚粉對雜交黃顙魚生長性能的影響

如表 3所示, 各處理組雜交黃顙魚存活率無顯著性差異, 且均大于 95%。增重率(WGR)與特定生長率(SGR)出現(xiàn)了下降的趨勢, 其中G20、G40與G0相比,WGR與SGR沒有顯著性差異(P＞0.05), 當替代水平高于 60% 時, 雜交黃顙魚WGR與SG顯著下降(P＜0.05), G60、G80與G100組增重率(WGR)的下降比例分別為9.32%、13.01%與15.24%。與G0相比, G20與G40的飼料系數(shù)(FCR)沒有顯著性差異(P＞0.05), 當替代水平高于60% 時, 飼料系數(shù)顯著升高, G60、G80與G100組的升高比例分別為 9.32%、13.56%與16.10%。各組實驗魚的肝體比(HSI)、臟體比(VSI)與肥滿度(CF)均未出現(xiàn)顯著性差異(P＞0.05)。HSI為1.34%—1.53%, 且G0與G20組的HSI大于其余各組(P＞0.05);VSI為8.60%—9.82%,G0、G20與G40組的VSI大于其余各組(P＞0.05);CF為1.50%—1.63%。如圖 1所示,SGR和飼料中蠅蛆蛋白的水平關(guān)系呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(R2=0.9911)。

表 3 蠅蛆粉替代魚粉對雜交黃顙魚生長性能的影響Tab. 3 Effects of fishmeal replacement by maggot meal on growth performance of juvenile hybrid yellow catfish

2.2 蠅蛆粉替代魚粉對雜交黃顙魚體組成的影響

從表 4可知, 不同水平蠅蛆粉替代魚粉后全魚體組成包括水分、粗蛋白、粗脂肪與粗灰分各組之間沒有顯著性差異(P＞0.05)。水分含量為74.74%—76.27%; 粗脂肪含量為 4.65%—4.78%, 其中高水平替代組即G80與G100的全魚粗脂肪較其他處理組表現(xiàn)出下降趨勢(P＞0.05), 但差異不顯著,粗蛋白含量為 13.98%—14.51%, 粗灰分含量為2.19%—2.42%。

2.3 蠅蛆粉替代魚粉對雜交黃顙魚抗氧化酶活性的影響

如表 5所示, 在肝臟中, CAT、GR、SOD和TAOC均出現(xiàn)了先上升后下降的趨勢。肝臟CAT活性在 G40 組最高, 且顯著高于G0組(P＜0.05), 在G100組最低, 顯著低于其他組(P＜0.05)。肝臟GR與SOD活性則在 G20 組最高, 但與G0組相比并未出現(xiàn)顯著性差異(P＞0.05), 隨著替代比例的升高,G60、G80與G100組的GR與SOD活性顯著低G0與G20組(P＜0.05)。與G0相比, G20與G80組的MDA沒有顯著性差異(P＞0.05), G40、G60組的MDA顯著下降, G100組的MDA顯著升高(P＜0.05)。T-AOC在G60組最高, 顯著高于其他替代組(P＜0.05)。

血清中CAT、GR和SOD出現(xiàn)了先上升后下降的趨勢。血清CAT在G60組最高, 且顯著高于其他替代組(P＜0.05)。血清 GR 在替代水平小于 80%時, 各組之間沒有顯著性差異, G100組GR活性顯著低于其他替代組。血清SOD活性在G20組最高, 但與G0組相比并未出現(xiàn)顯著性差異(P＞0.05), 隨著替代比例的升高, G60、G80與G100組的SOD活性顯著低于G0與G20組(P＜0.05)。血清與肝臟中MDA呈現(xiàn)先下降后上升趨勢, 且當替代比例大于40%時, 肝臟中 MDA顯著小于G0(P＜0.05), G100組血清與肝臟MDA顯著大于G0組。血清T-AOC呈現(xiàn)下降趨勢, 替代比例大于40%時, 與對照組相比, TAOC顯著下降(P＜0.05)。

3 討論

3.1 蠅蛆粉替代魚粉對雜交黃顙魚生長性能的影響

在本實驗條件下, 蠅蛆粉的替代水平低于 40%時, 雜交黃顙魚的生長性能沒有顯著性差異, 當替代水平大于 60% 時, 雜交黃顙魚的生長性能顯著降低。使用昆蟲蛋白源替代魚粉在普通黃顙魚的研究中, 蠅蛆粉替代水平為 20% 時, 黃顙魚的生長性能沒有顯著性差異, 大于 20% 時, 黃顙魚的生長性能顯著下降[22]; 黑水虻粉替代水平小于 30% 時,黃顙魚的生長性能沒有顯著性差異, 替代水平大于30% 時, 黃顙魚的生長性能顯著下降[23]; 黃粉蟲粉與蠶蛹粉完全替代魚粉, 黃顙魚的生長性能顯著下降[24]。綜合上述研究結(jié)果表明, 昆蟲蛋白在一定替代水平內(nèi), 不會影響黃顙魚的生長性能, 而使用過高水平的昆蟲蛋白源替代魚粉會導致黃顙魚生長性能降低。然而, 使用黑水虻粉完全替代飼料中的魚粉不會對大西洋鮭(Salmo salar)的生長性能產(chǎn)生顯著的負面影響[10]。同時在一些研究中, 使用其他昆蟲蛋白部分替代魚粉時, 金頭鯛(Sparus aurata)和尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)的生長性能得到改善[14,26]。這些結(jié)果的差異可能與不同的魚類所需的必需氨基酸(EAA)模式和對氨基酸利用的差異相關(guān)[26]。在本研究中, 蠅蛆粉的必需氨基酸模式與魚粉較為相似(表 2), 但是當蠅蛆粉完全替代魚粉時, 飼料中的亮氨酸和精氨酸含量低于其他組,這可能是高水平蠅蛆粉替代魚粉處理組實驗魚表現(xiàn)出生長性能降低的主要原因。另外, 蠅蛆粉的蛋白質(zhì)質(zhì)量受到蠅蛆的飼養(yǎng)條件和加工方法及其他因素的限制, 這些可能也會對幼魚的生長性能產(chǎn)生影響。同時, 昆蟲體內(nèi)含有一定的幾丁質(zhì), 而一般認為魚類不能消化幾丁質(zhì)[27]。隨著替代水平的提高, 飼料中幾丁質(zhì)含量也在增加。有研究表明, 魚類攝入過多的幾丁質(zhì)可能會降低飼料中脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的消化率, 從而降低營養(yǎng)利用率, 影響魚類的生長性能[12]。

圖 1 飼料中蠅蛆蛋白水平對雜交黃顙魚特定生長率(SGR)的影響Fig. 1 The effect of replacement level of maggot meal level in diet on SGR (%/d) in hybrid yellow catfish

3.2 蠅蛆粉替代魚粉對雜交黃顙魚形體指標與全魚體組成的影響

在本實驗中, 全魚水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分這些體組成指標各組之間均沒有顯著性差異,這一結(jié)果與非洲尖齒胡子鯰(Clarias gariepinus)的投喂實驗相似[28]。全魚的蛋白質(zhì)含量通常相對穩(wěn)定, 魚體的粗蛋白含量不會顯著變化, 而脂肪含量往往會隨著飼料中脂肪含量或種類的變化而發(fā)生變化。在對大菱鲆幼魚(Psetta maxima)的試驗中,當黑水虻對魚粉的替代水平達到 64% 時, 飼喂 56d后全魚的粗脂肪含量顯著降低[7], 作者將這一結(jié)果歸因于2種蛋白源的脂肪類型不同, 而魚體對不同種類脂肪的利用率存在差異。Panini 等[29]則在研究中發(fā)現(xiàn), 當黃粉蟲對魚粉的替代比例高于 25%時, 太平洋白蝦的粗脂肪含量顯示出增加的趨勢,而這一結(jié)果的出現(xiàn)則由于隨著替代水平的升高, 飼料中脂肪化含量隨之升高。Fasakin等[30]使用了不同加工方法生產(chǎn)的全脂和脫脂的蠅蛆粉來代替魚粉, 結(jié)果表明不同的加工方法與蛋白源的脂肪含量均會對非洲尖齒胡子鯰的粗脂肪結(jié)果產(chǎn)生不同的影響。這些均表明昆蟲蛋白的脂肪水平和脂肪類型都可能影響魚體組成中粗脂肪的含量。

表 4 蠅蛆粉替代魚粉對雜交黃顙魚全魚體組成的影響(%濕重)Tab. 4 Effects of fishmeal replacement by maggot meal on body composition (% whole body weight) of juvenile hybrid yellow catfish

表 5 蠅蛆粉替代魚粉對雜交黃顙魚抗氧化酶活性的影響 (U/g prot)Tab. 5 Effects of fishmeal replacement by maggot meal on antioxidase of juvenile hybrid yellow catfish (U/g prot)

3.3 蠅蛆粉替代魚粉對雜交黃顙魚抗氧化酶活性的影響

抗氧化酶系統(tǒng)是一種抗氧化防御機制, 可防止由活性氧引起的損害并維持自由基產(chǎn)生和清除之間的平衡, 包括谷胱甘肽過氧化物酶(GPX), 過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)[31]等。谷胱甘肽還原酶(GR)是體內(nèi)重要的抗氧化酶。它利用還原的 NAD(P) 催化 GSSG 轉(zhuǎn)化為 GSH, 從而為去除細胞內(nèi)活性氧(ROS)提供了還原能力[32]。SOD 則可以清除機體內(nèi)的活性氧自由基, 將其轉(zhuǎn)化為H2O2, 再通過 CAT 進一步還原生成 H2O 和 O2。丙二醛(MDA)是機體中的脂質(zhì)過氧化物的最終產(chǎn)物, 間接反應機體受自由基攻擊的嚴重程度。同時總抗氧化能力(T-AOC)也是反映機體抗氧化能力的重要指標之一。

在本研究中, 替代水平到達 40% 時, 肝臟中的CAT 與 T-AOC 活性顯著升高, 肝臟MDA 含量顯著降低。而當替代水平高于 80% 時, 血清與肝臟中多種抗氧化酶活性均顯著降低, MDA含量顯著升高。一般來說, 血清中各項抗氧化酶活性的升高代表魚體的抗氧化能力增強。昆蟲粉替代魚粉往往會對魚類的抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生不同的影響。有研究表明, 黃粉蟲粉可以改善虹鱒(Oncorhynchus mykiss)腸道中的抗氧化酶活性(SOD、CAT、GPx和GR)[33]。Ogunji等[14]使用蠅蛆粉替代魚粉時, 并未對尼羅羅非魚的 CAT 活性造成顯著影響。而在一項異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)和瓦氏黃顙魚(Pelteobagrus vachelli)的飼養(yǎng)實驗中, 當蠅蛆粉替代魚粉時, 抗氧化酶活性在兩種魚中表現(xiàn)出了相反的結(jié)果[34]。以上研究進展表明, 不同物種對食物中不同蛋白質(zhì)的應答采取了不同防御策略。

在本實驗中, 當替代水平等于 40% 時, 蠅蛆粉替代魚粉對雜交黃顙魚的抗氧化能力有一定提高作用, 這與蠅蛆蛋白中的幾丁質(zhì)、抗菌肽、凝集素和溶菌酶等免疫活性物質(zhì)有關(guān), 這些成分可以對幼魚的抗氧化能力產(chǎn)生積極影響[35]。然而, 隨著替代水平的提高, 幼魚的抗氧化能力開始顯著下降。造成這一現(xiàn)象可能原因為: 隨著替代水平的升高, 飼料中亮氨酸和精氨酸的含量呈下降趨勢。亮氨酸(Leu)是魚類必需的支鏈氨基酸(BCAA), 具有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)代謝和增強免疫力等生理功能[36]。有研究表明, 亮氨酸可以增強草魚肌肉和腸道的抗氧化能力[37], 缺乏亮氨酸可能會導致高水平替代飲食中抗氧化酶活性的降低。T-AOC 是一項評估組織與血清抗氧化能力的指標, 代表包括酶類與非酶類物質(zhì)的綜合水平。在本實驗中, G40 組的 T-AOC 在血清中與肝臟中呈現(xiàn)了相反的趨勢, 分析可能的原因為, 肝臟是魚類抗氧化系統(tǒng)的重要靶器官, 當機體氧自由基產(chǎn)生的時候, 肝臟發(fā)揮作用, 所以肝臟中的 T-AOC 升高, 但血清中的 T-AOC 含量反應的是機體包含各組織器官中 T-AOC 的整體水平, 在G40 階段, 可能其他器官已經(jīng)造成了一定損傷, 血清中 T-AOC 降低, 而當替代水平大于 60% 時, 肝臟達到了其對氧化物質(zhì)的調(diào)節(jié)閾值, T-AOC 出現(xiàn)下降趨勢。由于蠅蛆蛋白中的氨基酸含量受養(yǎng)殖與加工環(huán)節(jié)影響較大, 在使用蠅蛆粉替代魚粉之前,應考慮原料中各種氨基酸的平衡。

4 結(jié)論

使用蠅蛆粉替代魚粉, 替代水平為 40% 時可以提高雜交黃顙魚肝臟中抗氧化酶的活性, 但不會影響雜交黃顙魚的生長性能、形體指標與體組成。當替代水平大于 60% 時, 雜交黃顙魚生長性能開始顯著降低, 肝臟與血清中 SOD 活性顯著降低。實驗結(jié)果表明蠅蛆蛋白可以替代40%左右的魚粉蛋白, 但有關(guān)大量替代造成生長性能與抗氧化酶活性降低的原因還有待進一步研究。