黃 瑩 韓金高 朱曉鳴 趙一新 王壽昆 胡職豪 陳新華

(1. 福建農(nóng)林大學(xué)海洋研究院, 福建省海洋生物技術(shù)重點實驗室, 福州 350002; 2. 福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院, 福州 350002;3. 中國科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點實驗室, 武漢 430072)

黃曲霉毒素(Aflatoxins, AFT)污染是一個全球性的問題, 在熱帶或亞熱帶地區(qū)尤為嚴(yán)重, 而這些地區(qū)的水產(chǎn)品養(yǎng)殖量占到全球年產(chǎn)量的80%左右[1]。在高溫和高濕的天氣下, 飼料原料如花生、玉米、豆粕、魚粉和魚類副產(chǎn)品等在貯存期間, 或飼料在加工和青貯過程中, 處理不當(dāng)容易滋生霉菌, 并進(jìn)一步產(chǎn)生AFT污染[2]。Chen和Rawlings[3]抽查334個亞洲的商品飼料和原料有96.1%的樣品含有AFT。王國強等[4]對中國各省采集的321份飼料和原料樣品進(jìn)行了檢測, 平均AFB1檢出率為67.3%; 其中飼料中AFB1檢出率高達(dá)84.2%, 陽性樣品AFB1平均值和最高值分別為14.3和43.2 μg/kg。

AFT是由黃曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)產(chǎn)生的以二氫呋喃環(huán)和香豆素為基本結(jié)構(gòu)的次級代謝產(chǎn)物[5]。在天然谷物和食品中以AFB1最為常見[1]。AFB1被動物攝入后,轉(zhuǎn)化為AFB1-8,9-環(huán)氧化物(AFBO), AFBO 以共價鍵結(jié)合于DNA、RNA 和蛋白質(zhì), 形成加合物, 導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷和肝臟壞死, 而呈現(xiàn)其致癌性[2,6]。根據(jù)中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY5072-2002),我國漁用配合飼料中AFB1的安全限量標(biāo)準(zhǔn)為10 μg/kg[7]。目前的研究表明, AFB1會引起水生動物行為異常、生長減緩、免疫抑制、抗氧化損傷和組織病變等[8—13]。草魚(Ctenopharyngodon idellus)終末體重、攝食率和特定生長率隨日糧AFB1水平的升高呈線性下降, 抗氧化系統(tǒng)和腎臟、脾臟組織結(jié)構(gòu)均受到顯著影響[14]。AFB1會抑制虹鱒(Oncorhynchus mykiss)免疫球蛋白的生成以及免疫細(xì)胞的增殖[15]。另外, 動物攝入AFB1后, 由于AFB1的高脂溶性, 很快被胃腸道吸收, 并進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng), 而在各個組織中沉積[2]。異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)攝食1000 μg AFB1/kg飼料84d后肝胰臟和肌肉AFB1積累量分別達(dá)11.8和2.35 μg/kg[16]。黃河鯉(Cyprinus carpio var)攝食50 μg AFB1/kg飼料60d后性腺AFB1含量為2.71 μg/kg[17]。由于AFT具有熱穩(wěn)定性, 在溫度高達(dá) 268℃左右時才能分解[5], 食物烹調(diào)過程一般難以去除, 因此, AFT可能通過食物鏈而對人類食品安全造成危害。

花鰻鱺(Anguilla marmorata)廣泛分布在熱帶和亞熱帶水域內(nèi), 是分布領(lǐng)域最廣的鰻鱺品種[18]?；狑~在苗種資源里具有較大的資源量, 且在生長后期體型較大, 具有較好的開發(fā)前景[19]。規(guī)?；狑~健康養(yǎng)殖的重要物質(zhì)基礎(chǔ)是優(yōu)質(zhì)配合飼料[20]。然而近年來隨著魚粉資源日趨緊張, 魚粉價格高漲,為緩解對魚粉的需求壓力, 一些蛋白原料替代了部分魚粉, 可能對鰻鱺飼料品質(zhì)造成了一定程度的影響[21]。迄今為止, 有關(guān)AFB1在水生動物中的毒理學(xué)研究尚不完整, 不同品種對AFB1的敏感性差別較大[1,5,8,12]。以往的研究表明溫水性魚類比冷水性魚類更能耐受AFB1[2,22—25]。本實驗以飼喂含AFB1飼料的方式, 開展花鰻鱺幼魚的亞慢性致毒實驗, 旨在研究長期攝食AFB1對花鰻鱺幼魚生長、攝食、抗氧化能力和組織學(xué)方面的影響, 及AFB1在肌肉中的積累情況, 進(jìn)而評估AFB1污染對花鰻鱺健康養(yǎng)殖造成的潛在威脅。

1 材料與方法

1.1 養(yǎng)殖系統(tǒng)

本實驗在微流水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行, 實驗系統(tǒng)由12個圓形的pp材質(zhì)養(yǎng)殖桶組成, 每個桶的底面直徑為80 cm, 桶高為70 cm, 實驗水體體積為180 L/缸。每缸的水流速度為0.5 L/min。每天監(jiān)測2次氣溫和水溫。每2周測定水體的溶氧和氨氮含量。實驗期間, 水溫范圍維持在24—28℃。飼養(yǎng)用水為經(jīng)充分曝氣的自來水以保正水體的溶氧含量大于5 mg/L,氨氮范圍為0.2—0.4 mg/L。實驗期間水體的pH為6.8—7.0, 光照周期為12L∶12D(6∶30至18∶30)。

1.2 實驗飼料及實驗設(shè)計

實驗選用的基礎(chǔ)飼料為天馬公司生產(chǎn)的幼鰻配合飼料。實驗基礎(chǔ)飼料的常規(guī)化學(xué)成分如表 1所示。實驗基礎(chǔ)飼料添加AFB1配制成不同毒素濃度(0、10、100和1000 μg/kg)的4種實驗飼料, 通過酶聯(lián)免疫法(ELISA)測得飼料中AFB1含量分別為1.3、11.6、103.5和989.5 μg/kg飼料, AFB1濃度的設(shè)計參考已有的關(guān)于AFB1在水產(chǎn)動物的研究報道[1,2,24,25,35]。制備實驗飼料前, 首先將AFB1(購自美國Sigma公司)溶于橄欖油, 以配制成濃度為500 μg/mL的母液。然后按照設(shè)計值添加相應(yīng)量到大豆油中, 最后將含有不同濃度AFB1的大豆油按照3%的添加量加到各組實驗飼料中混合均勻, 儲存于?20℃冰箱。

1.3 實驗魚與飼養(yǎng)實驗

實驗魚為花鰻鱺黑仔鰻, 來源于福建省福州市貴安鰻場, 將其在室內(nèi)養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)2周, 然后轉(zhuǎn)入實驗系統(tǒng)馴養(yǎng)1周。暫養(yǎng)和馴化階段均飼喂實驗基礎(chǔ)飼料。實驗開始前將實驗魚饑餓24h, 然后選取外表無損傷, 活力較好且規(guī)格較為一致的花鰻鱺幼魚240尾(平均體重為6.41 g), 隨機放入12個實驗魚缸中。將這12個缸隨機分成4個實驗組, 每組3個平行, 每缸20尾, 進(jìn)行為期56d的養(yǎng)殖實驗。暫養(yǎng)和實驗期間每日的飼喂時間均為7:00和16:30。將飼料加入一定比例的水制作成團(tuán)狀飼料, 投飼量為魚體重的3%—5%, 每天記錄各個缸的實際投喂量。投喂1h后撈取殘餌, 烘干后稱重。在實驗結(jié)束時,實驗魚饑餓24h后稱量和記錄每缸魚的終末體重。

1.4 實驗取樣

在實驗結(jié)束時, 每缸隨機取15尾魚用MS-222麻醉, 麻醉后隨機取3尾在冰盤上解剖出肝臟, 后放入凍存管中經(jīng)液氮急凍, 稍后轉(zhuǎn)移到?80℃冰箱中保存,用作抗氧化酶的測定。另外隨機取3尾魚進(jìn)行解剖,取肝臟用中性甲醛固定后采用HE染色法進(jìn)行組織切片制作。剩余所有肝臟冷凍干燥后用于肝臟中AFB1含量分析。每缸12尾魚均在冰盤上解剖, 取背部白肌進(jìn)行冷凍干燥, 用于測定肌肉中AFB1含量。

1.5 樣品的測定

本實驗基礎(chǔ)飼料中干物質(zhì)、粗蛋白、粗脂肪和灰分的含量測定參照文獻(xiàn)[26]的方法進(jìn)行。飼料干物質(zhì)在105℃下烘干至恒重, 通過失重法測定。飼料粗蛋白含量使用凱氏定氮儀(Kjeltec8400,FOSS)測定。飼料粗脂肪含量使用索氏抽提儀(ST243, FOSS)進(jìn)行測定。飼料樣品在馬福爐中550℃燃燒3h, 以失重法測定灰分。

采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定肝臟中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)活性、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)活性和丙二醛(MDA) 含量。魚體肝臟和肌肉AFB1積累量采用ELISA法[11,23]進(jìn)行測定(試劑盒購自北京百靈康源生物公司)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用以下公式計算存活率、攝食率、飼料效率和特定生長率:

存活率(SR, %)=100×(剩余尾數(shù)/初始尾數(shù))

攝食率(FR, %BW/d)=100×I/[(W1+W2)/2]/t

飼料效率(FE, %)=100×(W2?W1)/I

特定生長率(SGR, %/d)=100×(lnW2?lnW1)/t

式中,W1為平均初始體重(g),W2為平均終末體重(g),t為實驗天數(shù)(d),I為攝食量(g)。實驗數(shù)據(jù)使用SPSS Statistics 17.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。實驗結(jié)果經(jīng)一元方差分析(One-way ANOVA)后, 用Duncan’s 進(jìn)行多重比較, 當(dāng)P＜0.05時, 為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 飼料中AFB1水平對花鰻鱺幼魚存活和生長的影響

在整個實驗過程中, 各實驗組花鰻鱺幼魚均未表現(xiàn)出行為異常和體色變化。如表 1所示, 10與100 μg/kg毒素組花鰻鱺幼魚的終末體重(FBM)、存活率(SR)、攝食率(FR)、特定生長率(SGR)、飼料效率(FE)均與對照組無顯著性差異(P＞0.05)。1000 μg/kg毒素組的FBW、SR、FR、SGR和FE均顯著低于對照組(P＜0.05)。

2.2 飼料AFB1水平對花鰻鱺幼魚抗氧化指標(biāo)的影響

如表 2所示, 10 μg/kg毒素組花鰻鱺幼魚肝臟的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)活性和丙二醛(MDA)含量均與對照組無顯著性差異(P＞0.05)。100 μg/kg毒素組花鰻鱺幼魚肝臟的SOD、GSH-Px和GST活性均顯著低于對照組(P＜0.05), CAT活性和MDA含量均與對照組無顯著差異(P＞0.05)。與對照組相比, 1000 μg/kg毒素組花鰻鱺肝臟幼魚的SOD、CAT、GSH-Px和GST活性均顯著降低(P＜0.05), MDA含量顯著升高(P＜0.05)。

表 2 飼料AFB1水平對花鰻鱺幼魚肝臟超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)活性和丙二醛(MDA)含量的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Tab. 2 Effects of dietary AFB1 on liver activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GSHPx), glutathione S-transferase (GST), and malondialdehyde(MDA) of juvenile marbled eel (Mean±SE)

2.3 飼料中AFB1水平對花鰻鱺幼魚肝臟組織學(xué)的影響

肝臟組織學(xué)觀察結(jié)果如圖 1所示, 對照組花鰻鱺幼魚的肝細(xì)胞排列整齊, 細(xì)胞界限清晰, 核大而圓, 液泡較為豐富。10 μg/kg毒素組花鰻鱺幼魚的肝細(xì)胞呈現(xiàn)出正常的均勻分布, 與對照組肝臟細(xì)胞的大小、形狀和排列方式均無明顯差別。100 μg/kg毒素組花鰻鱺幼魚的部分肝細(xì)胞形狀不規(guī)則, 細(xì)胞之間界限不清晰, 部分區(qū)域出現(xiàn)了空泡化。1000 μg/kg毒素組花鰻鱺幼魚的肝臟則觀察到較嚴(yán)重的病理變化, 肝細(xì)胞界限基本消失, 細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)溶解, 細(xì)胞核呈多形; 細(xì)胞空泡化明顯增多, 細(xì)胞核被擠到細(xì)胞一側(cè)。

圖 1 飼料中AFB1對花鰻鱺幼魚肝臟組織學(xué)的影響(H&E, 標(biāo)尺為50 μm)Fig. 1 Liver of juvenile marbled eel fed with diets containing AFB1 (H&E, Bar=50 μm)

2.4 飼料AFB1水平對花鰻鱺幼魚肝臟和肌肉的AFB1積累水平的影響

如表 3所示, 隨著飼料中AFB1水平的增加, 花鰻鱺幼魚肝臟和肌肉中AFB1的含量均顯著升高(P＜0.05), 各組間均存在顯著差異(P＜0.05)。

3 討論

3.1 飼料中AFB1水平對花鰻鱺幼魚的存活和生長的影響

AFB1會導(dǎo)致部分水生動物的行為異常, 體表黃化, 食欲下降及體重減輕, 甚至死亡率增高[2]。喂食含AFB1的飼料可引起銀鯰(Rhamdia quelen)腦突觸乙酰膽堿酯酶活性變化, 造成血腦屏障的紊亂和腦損傷, 這些可能是導(dǎo)致魚類行為變化的部分原因[27]。當(dāng)日糧中AFB1水平達(dá)到或超過59 μg/kg時,草魚出現(xiàn)體表變黃、尾鰭畸形和骨骼發(fā)育異常等現(xiàn)象[14]。在本實驗中, 攝食不同濃度AFB1飼料的花鰻鱺均未出現(xiàn)明顯的行為異常和體色的變化。尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)攝食10 mg/kg AFB1的飼料8周后, 對其死亡率無顯著影響[24]。在飼料中添加25、50、100、500和1000 μg/kg AFB1,均不會對凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)的存活率造成負(fù)面影響, 但是顯著影響增重率和特定生長率[13]。奧尼羅非魚(Oreochromis niloticus♀×O.aureus♂)的攝食率和飼料中AFB1濃度存在劑量效應(yīng), 攝食率隨AFB1濃度的升高而降低[11]。尼羅羅非魚攝入2 mg/kg AFB1, 終末體重、增重率和飼料轉(zhuǎn)化率分別比對照組降低了19.85%、24.18%和34.21%[28]。但斑點叉尾鮰(Ictalurus punctutus)攝入AFT12周, 對其攝食、生長和飼料效率均無顯著影響[29]。這些研究結(jié)果表明, 不同魚類對AFB1的耐受性存在較大的差別, 虹鱒等被證明是對AFB1最敏感的魚類之一[1,2,15,22]。在本實驗中, 當(dāng)飼料中AFB1≤100 μg/kg時花鰻鱺幼魚的終末體重、存活率、攝食率、特定生長率和飼料效率均與對照組無顯著性差異; 但當(dāng)AFB1達(dá)1000 μg/kg時, 以上指標(biāo)均顯著低于對照組。AFB1對生長的負(fù)面影響可能是由于高劑量的AFB1造成機體消化機能受損,消化酶活性下降, 對糖類及脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用率降低, 影響了機體的生長發(fā)育[5,30]。

表 3 飼料中AFB1水平對花鰻鱺幼魚肝臟和肌肉AFB1積累(μg/kg 濕重)的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Tab. 3 Effects of dietary AFB1 on AFB1 accumulation (μg/kg wet weight) in liver and muscle of juvenile marbled eel (Mean±SE)

3.2 飼料中AFB1水平對花鰻鱺幼魚抗氧化能力的影響

需氧生物體內(nèi)抗氧化的防御系統(tǒng)主要由一系列抗氧化酶構(gòu)成, 其酶活性的高低在一定程度上反映了生物體的健康狀況。肝臟中的抗氧化酶主要由超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷光甘肽過氧化物酶等構(gòu)成, 抗氧化酶可清除或中和自由基和活性氧(ROS)[31]。AFB1經(jīng)過細(xì)胞色素P450活化轉(zhuǎn)化成的AFBO具有親電性, 導(dǎo)致體內(nèi)產(chǎn)生的大量自由基和ROS, 肝細(xì)胞自由基清除系統(tǒng)受損, 機體的抗氧化能力大大降低[32]。ROS還可破壞細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸, 并引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng), 產(chǎn)生MDA、羥基、羰基及新的氧自由基[1]。MDA的含量不僅可以反映出生物體體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度, 而且間接地體現(xiàn)出機體細(xì)胞受損傷的程度[5]。AFB1可上調(diào)草魚細(xì)胞內(nèi)信號通路中的調(diào)節(jié)蛋白keap1a, 下調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2, 從而抑制SOD、CAT、GSH-Px和GST等抗氧化酶的基因表達(dá)和酶活力[14]。AFB1顯著降低了羅非魚體內(nèi)GSH、SOD、GSH-Px和CAT的活性[28]。飼喂含AFB1的飼料后黃河鯉血清和肝臟SOD、CAT 和GSH-Px 活性均顯著降低, MDA含量顯著升高[5]。GST在AFB1的代謝過程中起著非常重要的作用, 可催化AFBO與GSH共軛生成水溶性化合物, 使AFB1及其代謝物得以排出體外, 緩解AFB1造成的毒性[33]。凡納濱對蝦攝入5 mg/kg AFB1后, 肝臟GST活性受到顯著影響[34]。在本實驗中, 花鰻鱺幼魚攝入1000 μg/kg AFB1后, 肝臟SOD、CAT、GSH-Px和GST活性均顯著降低, MDA含量顯著升高, 表明AFB1可顯著影響花鰻鱺幼魚抗氧化能力。該結(jié)果與王靜[35]的報道相似,AFB1通過削弱機體的抗氧化能力, 使對蝦的抗病能力減弱, 從而降低其對外界細(xì)菌的抵御性。

3.3 飼料中AFB1水平對花鰻鱺幼魚的肝臟組織學(xué)影響

AFB1的主要靶器官是肝臟, 會引起肝臟功能紊亂和損傷, 表現(xiàn)為肝臟水腫, 肝臟細(xì)胞受損, 空泡化嚴(yán)重, 炎癥細(xì)胞增多[2]。用15 mg/kg的AFB1飼喂凡納濱對蝦12d會導(dǎo)致肝胰腺嚴(yán)重?fù)p傷, 肌上皮層和肝胰腺上皮細(xì)胞分離; 空泡細(xì)胞內(nèi)脂肪過多, 核固縮, 細(xì)胞溶解, 細(xì)胞壞死; 基膜部分區(qū)域溶解, 管腔星形結(jié)構(gòu)消失, 儲存細(xì)胞萎縮或消失[34]。尼羅羅非魚攝入2.5 mg/kg AFB184d后肝胰腺內(nèi)腺泡壞死,核固縮; 肝臟出現(xiàn)較大規(guī)模壞死、淤血、充血和淋巴細(xì)胞浸潤[36]。大蓋巨脂鯉(Colossoma macropomum)攝入1000 μg AFB1/kg飼料后肝細(xì)胞空泡、壞死, 細(xì)胞核萎縮[37]。凡納濱對蝦攝入含38.1和54.9 μg/kg AFB1的飼料56d后, 其肝臟無明顯病變; 當(dāng)飼料中AFB1水平超過107.6 μg/kg時, 對蝦肝胰腺出現(xiàn)明顯的萎縮和不規(guī)則的管狀結(jié)構(gòu), 儲存細(xì)胞和分泌細(xì)胞減少[13]。與以上研究結(jié)果不同, 異育銀鯽攝食500 μg AFB1/kg飼料56d后肝臟未見明顯的組織學(xué)病理變化[23]。在本實驗中, 飼料AFB1含量為100 μg/kg時會引起花鰻鱺幼魚細(xì)胞界限不清晰和小部分細(xì)胞空泡化。隨著AFB1濃度的升高, 肝臟損傷更為明顯, 出現(xiàn)嚴(yán)重的空泡樣變性。上述結(jié)果表明,AFB1對肝臟組織的損傷程度與毒素的劑量及受試動物的種類有關(guān)。

3.4 飼料AFB1水平對花鰻鱺幼魚肝臟和肌肉AFB1積累水平的影響

AFB1進(jìn)入動物體內(nèi)后, 部分會被轉(zhuǎn)化成AFBO,或者通過其他代謝物形式積累在不同組織中[1]。FDA規(guī)定食品中AFB1的安全限量為5 μg/kg[38]。尼羅羅非魚攝入2000 μg/kg AFB1后, 全魚魚體AFB1積累達(dá)到21.18 μg/kg[28]。飼喂黃河鯉55 μg AFB1/kg飼料30d后, 肝胰臟中 AFB1積累量為5.52 μg/kg[5]。大蓋巨脂鯉攝入1000 μg AFB1/kg 飼料39d后, 肌肉AFB1含量為3.28 μg/kg[37]。雜交鱘(Acipenser ruthenus♀×A. baerii♂)肝臟和肌肉中的AFB1積累均隨著飼料中AFB1水平的升高而增加, 且呈線性相關(guān)[25]。草魚攝食10、20、100和1000 μg/kg AFB184d后, 其肌肉中均未檢測出AFB1, 僅在飼喂5000 μg/kg AFB1的草魚肌肉中檢測出1.21 μg/kg AFB1[39]。凡納濱對蝦攝入0、25、50、100和1000 μg/kg AFB156d, 肌肉中均未發(fā)現(xiàn)AFB1殘留[13]。在本實驗中, 花鰻鱺幼魚肝臟和肌肉AFB1積累隨著飼料中AFB1水平的增加而顯著增加, 在同一AFB1水平下, 肝臟中AFB1的積累要高于肌肉中; 當(dāng)飼料中AFB1達(dá)100 μg/kg時, 肝臟AFB1積累量高于FDA食品安全限定標(biāo)準(zhǔn); 當(dāng)飼料中AFB1達(dá)1000 μg/kg時,花鰻鱺幼魚肝臟和肌肉中AFB1積累量均超過FDA食品安全限定標(biāo)準(zhǔn)。以上研究結(jié)果說明, 不同水產(chǎn)動物對AFB1的代謝率可能存在較大差別?？傮w上說, 大多數(shù)的動物肌肉中AFB1的積累量要比肝臟中低, 肝膽系統(tǒng)是AFB1及其代謝物積累和排泄的主要場所[1,2,16]。

4 結(jié)論

花鰻鱺幼魚攝入AFB1含量為10 μg/kg的飼料56d后, 其存活率、攝食、生長、抗氧化指標(biāo)和肝臟組織學(xué)均未受到顯著影響。飼料中AFB1含量≥100 μg/kg時會損傷花鰻鱺幼魚的抗氧化能力和肝臟組織。1000 μg/kg毒素組花鰻鱺幼魚肝臟和肌肉中AFB1積累量均超過FDA食品安全限定標(biāo)準(zhǔn)。