李蘭蘭 邢露梅 俞兆曦, 肖 偉, 賽清云, 劉彥斌, 田永華,王 燕,劉 哲連總強,*

(1. 甘肅農業(yè)大學動物科學技術學院, 蘭州 730070; 2. 寧夏回族自治區(qū)水產研究所(有限公司), 銀川 750001;3. 寧夏漁業(yè)工程技術研究中心, 銀川 750001; 4. 寧夏漁業(yè)科技院士工作站, 銀川 750001)

蘭州鲇(Silurus lanzhouensis)又名黃河鯰, 隸屬于鲇形目(Siluriformes)鲇科(Siluridea)鲇屬(Silurus)[1], 為我國黃河中上游特有的大型土著魚類, 2004年已被《中國物種紅色名錄》列為瀕危物種[2]。2007年農業(yè)部批準建立寧夏衛(wèi)寧段蘭州鲇國家級水產種質資源保護區(qū), 2014年蘭州鲇被評為黃河生物名片[3]。近些年寧夏回族自治區(qū)水產研究所已先后攻克了蘭州鲇人工繁育等技術難題, 成為目前國內最大的保種救護繁育基地, 每年向黃河增殖放流大規(guī)格苗種50萬尾以上, 在一定程度上恢復了這一瀕危魚類種質資源, 但同時也面臨著因多年累代繁育引起的種質退化問題。針對近些年產業(yè)結構調整、市場需求度較大和養(yǎng)殖戶積極性較高的實際需求, 課題組也在加快蘭州鲇良種新品種的選育工作[4,5], 但以往家系選育中采用不同家系不同池塘或不同網箱培育選擇, 面臨環(huán)境差異、基礎設施投入及管理力度加大等問題; 采用電子標記進行家系個體標記存在幼體無法標記、標記易脫落、標記昂貴和標記費時費力等困難。因此, 建立有效的親子鑒定及系譜管理技術是開展蘭州鲇種質資源救護保存和良種新品種選育中避免近交衰退的急需關鍵技術手段。

隨著分子標記技術發(fā)展, 微衛(wèi)星(Microsatellites)以其廣泛分布于基因組中, 遵循孟德爾共顯性遺傳定律, 多態(tài)性高且易于PCR擴增等優(yōu)點[6]被廣泛應用于水產生物家系系譜關系管理等方面。多重PCR(Multiplex PCR)首次由Chamberlian等[7]提出,因其可大大降低因大量樣品重復處理帶來的人為誤差, 且較分批次單個PCR更加高效、便捷和經濟,目前被廣泛應用于人類醫(yī)學和動植物研究中, 尤其是為大樣本量水生生物親緣關系分析[8]、群體遺傳多樣性分析[9]、遺傳分離模式分析[10]和種質鑒定[11]等研究提供了有力的技術手段。基于此, 本研究開展蘭州鲇微衛(wèi)星多重PCR體系構建并建立可靠的親子鑒定技術, 以期為今后開展蘭州鲇家系良種選育、種質系譜管理及資源救護繁育等方面工作提供有力技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2019年6—8月在寧夏回族自治區(qū)水產研究所國家級黃河鯰原種場進行, 隨機選取2018年建立的3個家系, 編號為7-1、8-8和8-11, 每個家系隨機選取30尾子代, 候選親本樣本由6尾真正親本和14尾(雌、雄各7尾)非親本組成, 另從7-1中隨機選取18尾, 8-8和8-11中隨機各選取16尾共50尾子代用于雙盲實驗。此外, 隨機選取16尾蘭州鲇養(yǎng)殖群體用于構建蘭州鲇微衛(wèi)星多重PCR體系。所有樣本均采集尾鰭組織, 用75%乙醇固定后置于–80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

基因組DNA提取蘭州鲇樣本基因組DNA的提取參考楊忠禮等[12]改進的酚-氯仿法結合DNA產物純化試劑盒法, 超微量核酸分析儀檢測濃度及OD值, 3%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。將合格的DNA用ddH2O稀釋至50 ng/μL, ?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

微衛(wèi)星多重PCR引物篩選及優(yōu)化根據微衛(wèi)星位點的多態(tài)性、序列重復單位及擴增效果等,從已開發(fā)的蘭州鲇微衛(wèi)星[13,14]中篩選出18個位點。將每對引物信息通過Multiplex Manager1.0[15]軟件模擬檢測, 避免產生錯配、引物二聚體和發(fā)卡結構等, 先進行2個位點之間組合, 然后在擴增效果較好的2重PCR體系中添加另一對引物篩選3重PCR體系, 以此類推。以16個蘭州鲇個體DNA為模板構建多重PCR體系, 通過引物濃度、退火溫度和延伸時間等因素優(yōu)化篩選最佳擴增條件, 3%瓊脂糖凝膠電泳檢測多重PCR擴增效果。

PCR反應體系PCR反應總體積20 μL, 包括DNA 1 μL(約50 ng), Premix 2×Taq(諾維贊)10 μL,正反向引物各0.5 μL(10 pmol/μL, 武漢天一輝生物科技有限公司合成), 加ddH2O至總體積20 μL。PCR反應程序: 94℃預變性3min, 94℃變性1min,50—60℃退火45s, 72℃延伸1min, 34個循環(huán), 72℃延伸10min, 12℃保存。擴增產物經3%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送武漢天一輝遠生物科技有限公司進行STR測序分析(毛細管電泳檢測ABI3730XL全自動DNA測序儀), 最終將優(yōu)化好的微衛(wèi)星多重PCR組合用于蘭州鲇3個家系的親子鑒定。

1.3 數據統(tǒng)計及分析

采用GeneMarker軟件[16]讀取等位基因值; 采用χ2檢驗家系中各位點分離模式是否滿足孟德爾遺傳定律(1∶1、1∶2∶1 和 1∶1∶1∶1), 顯著性水平設置為P＞0.01; 用Cervus v.3.0軟件[17]進行親子鑒定分析,具體參數包括等位基因數(Number of allele,Na)、有效等位基因數(Number of effective allele,Ne)、觀測雜合度(Observed heterozygosity,Ho)、期望雜合度(Expected heterozygosity,He)、香農信息指數(Shannon Wiener index,I)、無效等位基因頻率[Null allele frequency,F(Null)]及多態(tài)信息含量(Polymorphism information content,PIC), 計算各位點的平均排除概率(Exclusion probability,EP)、累積排除概率(Combined exclusion probability,CEP)、模擬鑒定率及實際鑒定率(置信區(qū)間為95%); 利用軟件GenAlex 6[18]計算110尾個體和50尾雙盲子代遺傳距離, 采用MEGA 7.0[19]軟件構建系統(tǒng)進化樹。

2 結果

2.1 微衛(wèi)星多重PCR建立

本研究從已篩選出多態(tài)性高、擴增效率較好的18對微衛(wèi)星標記中, 通過不同組合擴增, 最終選取14個微衛(wèi)星位點科學設計優(yōu)化確定了2組三重PCR和2組四重PCR, 所建立的各組多重PCR退火溫度、引物濃度以及片段大小見表 1。圖 1為部分蘭州鲇個體四組多重PCR片段測序掃描圖, 由圖 1可見4組多重PCR體系各位點擴增效率均較好, 易于識別各位點等位基因大小。

2.2 群體遺傳多樣性分析

4組微衛(wèi)星多重PCR在90尾子代和20尾親本中遺傳參數如表 2所示。等位基因數(Na)為4—19, 平均等位基因數為8.214; 有效等位基因數(Ne)為2.117—7.704, 平均有效等位基因數為3.652; 觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)分別為0.527—0.964和0.528—0.870; 平均觀測雜合度為0.750, 平均期望雜合度為0.667; 香農信息指數(I)為0.958—2.268,平均香農信息指數為1.393; 14個位點中有6個位點(SLsis118、SLsis165、SLsis173、SLsis83、SLsis14和SLsis76)的無效等位基因頻率(F(Null))大于10%;多態(tài)信息含量(PIC)為0.500—0.858, 平均多態(tài)信息含量為0.624, 各位點均表現為高度多態(tài)性(PIC＞0.5)。

2.3 微衛(wèi)星在子代分離模式

由表 3可知, 在獲得的42個基因型分離比(14位點×3家系)中, 有2個為同一雜合狀態(tài)基因型(親本等位基因不同且為純合), 對剩余40個分離模式進一步分析發(fā)現, 排除無效等位基因和無法分析的情況,仍有3個基因型分離比偏離孟德爾分離定律(P＜0.01), 在3個家系共168個等位基因中(14個位點×6個親本× 2), 無效等位基因頻率為2.4%。

表 1 四組蘭州鲇微衛(wèi)星多重PCR篩選結果Tab. 1 The results of 4 multiplex PCR screening in S. lanzhouensis

圖 1 部分蘭州鲇個體4組多重PCR的基因掃描圖Fig. 1 Part of gene scan results of four sets multiplex PCR in S. lanzhouensis

表 2 14個微衛(wèi)星位點在蘭州鲇3個家系中的遺傳參數Tab. 2 Genetic parameters in 3 families of S. lanzhouensis by using 14 microsatellite makers

表 3 多重PCR在蘭州鲇3個家系中的微衛(wèi)星基因型分離比Tab. 3 Segregation analysis of microsatellite alleles in 3 families of S. lanzhouensis

續(xù)表 3

2.4 親權分析

利用4組微衛(wèi)星多重PCR對蘭州鲇3個家系進行親子鑒定排除概率分析, 由表 4可知, 當雙親基因型均未知時, 單個微衛(wèi)星位點排除概率(E-1P)為0.097—0.591, 累積排除概率(CE-1P)為0.99753092;當單親基因型已知時, 單個微衛(wèi)星位點排除概率(E-2P)為0.172—0.745, 累積排除概率(CE-2P)為0.99983971; 當雙親基因型均已知時, 單個微衛(wèi)星位點排除概率(E-PP)為0.262—0.904, 累積排除概率(CE-PP)為0.99999964。由圖 2可知, 根據單個多重PCR組合的鑒定率由高到低依次添加組合, 4組多重PCR模擬累積鑒定率為100%, 實際累積鑒定率為83%。

2.5 聚類分析

進一步利用110尾已知系譜親本及子代個體遺傳信息進行聚類分析驗證, 結果表明在遺傳距離大于0.4時, 3個家系能夠分別聚類, 鑒定準確率為95.46%(圖 3)。50尾雙盲子代聚類分析驗證結果表明, 除2號、15號和48號個體未能確定其親本外, 其余47尾個體能夠確定其親本, 聚類分析鑒定準確率為94.00%(圖 4)。

3 討論

3.1 微衛(wèi)星多重PCR建立

據相關文獻報道, 影響多重PCR擴增效率的主要因素包括反應體系(引物、Mg2+、dNTPs、緩沖液、DNA模板和DNA聚合酶等)和反應條件(退火溫度、延伸時間和循環(huán)數等)[20—22]。本研究在構建蘭州鲇微衛(wèi)星多重PCR體系時發(fā)現, 引物組合及其濃度、退火溫度和延伸時間是影響多重PCR體系構建成敗的主要因素。在引物組合設計方面, 要確保同一位點上下游引物及不同引物間不能形成錯配、二聚體及發(fā)卡結構。在引物濃度比例設計方面, 需進行不同引物濃度優(yōu)化篩選, 以避免出現非特異性產物或擴增效率高的引物抑制其他引物導致擴增失敗。在延伸時間方面, 以優(yōu)化引物組合、引物濃度配比等因素為前提, 尚需進行延伸時間條件篩選, 避免因擴增時間太久導致酶和dNTPs等物質缺乏造成無法同時擴增多個位點[23]。在退火溫度方面, Kong等[24]認為多重PCR體系中各引物間退火溫度相差不宜超過5℃。本研究先對每對引物進行單位點擴增以確定每對引物退火溫度, 再將退火溫度相差不超過5℃的引物組合進行溫度梯度PCR篩選, 最終確定了4組多重PCR最佳退火溫度。

表 4 蘭州鲇親子鑒定的排除概率和累積排除概率Tab. 4 Exclusion probability and cumulative exclusion probability for parentage assignment in S. lanzhouensis

圖 2 已知蘭州鲇雙親基因型時實際累積鑒定率和模擬累積鑒定率Fig. 2 The real cumulative assignment rate and simulation cumulative assignment rate with known parental genotypes in S.lanzhouensis

3.2 群體遺傳多樣性分析

生物群體遺傳多樣性常用于評測生物種質資源狀況[25], 等位基因數(Na)、雜合度(Ho/He)及多態(tài)信息含量(PIC)則為群體遺傳多樣性的重要評估指標, 多態(tài)性越高, 遺傳多樣性水平越高, 則家系親子鑒定的成功率和準確率就越高[26]。根據Bostein等[27]所提出的多態(tài)信息含量指標范圍:PIC≥0.5時為高度多態(tài), 0.25≤PIC＜0.5為中度多態(tài),PIC＜0.25為低度多態(tài)。本研究中14個微衛(wèi)星位點的平均期望雜合度(He)為0.667, 平均觀測雜合度(Ho)為0.750,PIC平均值為0.624, 表現為高度多態(tài)。這一結果與吳旭東等[28]利用蘭州鲇19對微衛(wèi)星引物對野生和人工繁育2個群體遺傳多樣性分析結果(He0.773,Ho0.887,PIC0.705)相近。以上數據表明, 本研究選用的微衛(wèi)星標記具有較高的遺傳多樣性, 可用于后續(xù)家系親權分析。

3.3 微衛(wèi)星在子代分離模式

微衛(wèi)星位點分型時常存在無效等位基因的情況, 通過子代基因分離比可反應研究中無效等位基因的存在情況。通過本研究14個位點在子代中的分離模式發(fā)現, 排除無效等位基因和無法分析的情況, 仍有3個基因型分離比偏離孟德爾分離定律。同樣, 陳辰等[29]和聶鴻濤等[11]分別應用10對和12對微衛(wèi)星位點對毛蚶(Scapharca kagoshimensis)和皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)進行子代基因分離模式研究, 在考慮無效等位基因存在的情況下, 發(fā)現分別有2個和8個位點基因型分離比偏離孟德爾分離定律。由此結合相關研究推測, 在基因轉換、減數分裂過程中, 因染色體非隨機分離或同致死主效基因連鎖等原因, 可造成此類現象發(fā)生[30]。

圖 3 110個體聚類分析圖Fig. 3 The cluster analysis diagram in 110 S. lanzhouensis

3.4 親權分析

近些年來, 親權關系分析被廣泛應用于種質資源保護、系譜信息完善、遺傳參數分析及良種新品種選育等方面[31]。在親子鑒定中, 基于排除概率的遺傳排除法是進行系譜關系鑒定最為簡單有效的方法[32]。王敏[33]研究表明, 若CEP≥99.73% 時,則可認定存在親子關系; 若95%＜CEP≤99%時, 則有可能存在親子關系; 若CEP＜80%時, 則不能確定存在親子關系。陳亮等[34]利用長鰭吻鮈(Rhinogo-bio ventralis)15個微衛(wèi)星位點構建了5組三重PCR體系, 僅使用其中3個組合, 在單親基因型已知情況下,其累積排除率可達到99.99%以上。本研究利用蘭州鲇14個微衛(wèi)星位點構建了2組四重PCR和2組三重PCR體系, 以排除法分析蘭州鲇家系間親子關系,無論親本基因型是否已知, 其累積排除概率均大于99.73%, 因此4組微衛(wèi)星多重PCR可用于鑒定蘭州鲇家系間親權關系。

圖 4 50個雙盲個體聚類分析結果Fig. 4 Cluster analysis of 50 double-blind individuals

本研究中14個微衛(wèi)星位點模擬鑒定率可達100%,而實際鑒定率為83%, 這與有關翹嘴鱖(Siniperca chuatsi)[35]和黃喉擬水龜(Mauremys mutica)[21]的研究結果相似。據相關研究報道, 家系親本選擇、無效等位基因存在及基因型統(tǒng)計誤差等因素均可造成實際鑒定率小于模擬鑒定率的現象。本研究選用家系親本來自多個池塘經群體選育后進一步選擇優(yōu)秀個體進行同池塘混合培育的優(yōu)良個體, 選育中仍存在因三代繁育、人工選擇及人為誤差等造成其親緣關系較近的可能, Jones等[32]認為親本親緣關系過近會降低親子鑒定的準確性。其次, 本研究中有6個位點的無效等位基因頻率大于10%, 無效等位基因會導致樣本雜合子缺失和低質量DNA, 從而影響鑒定準確度[36]。此外, 本研究中熒光標記PCR產物經DNA測序儀ABI 3730xl進行熒光電泳檢測, 其擴增效果差異、DNA模板質量以及檢測軟件讀取等因素亦可影響鑒定結果的準確度。

3.5 聚類分析

基于可靠分子標記的聚類分析常用于物種鑒定分類、起源進化等方面[37,38]。為進一步驗證親子鑒定準確性, 本研究通過110尾已知系譜親本及子代個體和50尾雙盲子代聚類分析發(fā)現, 鑒定準確率可分別達到95.46%和94.00%。50尾雙盲個體聚類分析中出現3尾樣本聚類錯誤, 可能因某些位點擴增效率過低和目標片段差異過小引起基因型統(tǒng)計誤差, 及在PCR擴增中引物滑動等原因造成[39]?；谶z傳排除法和聚類分析的結果表明, 本研究建立的4組多重PCR體系具有較好的穩(wěn)定性和可靠性。

4 結論

本研究在蘭州鲇單個PCR的基礎上首次建立多重PCR體系, 更加經濟和高效地應用于不同種質混養(yǎng)保存、種質選配擴繁、選育系譜管理和親子鑒定等研究, 為蘭州鲇這一大型瀕危物種的種質資源救護和良種選育提供了重要技術支持。