何麗麗, 竇文芳, 呂海超, 薛欣欣, 張文, 江南

江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122

糖基供體通常是糖的活化形式。當(dāng)以天然產(chǎn)物為糖基受體時(shí)，將糖基供體的高能磷酸鍵通過(guò)能量轉(zhuǎn)移到糖基受體上，可以形成天然產(chǎn)物與糖的糖苷鍵[1]。常見的糖基供體有尿苷二磷酸(uridine diphosphate，UDP)-糖、胸苷二磷酸(thymidine diphosphate，TDP)-糖、鳥苷二磷酸(guanosine diphosphate，GDP)-糖等[2]。這些糖基供體在生物體內(nèi)可以通過(guò)不同代謝反應(yīng)實(shí)現(xiàn)相互轉(zhuǎn)化。生物體內(nèi)最常見的糖基供體為UDP-糖，其中，UDP-葡萄糖是形成其他UDP-單糖的基礎(chǔ)原料，而UDP-葡萄糖醛酸是UDP-糖由六碳糖變?yōu)槲逄继堑年P(guān)鍵底物[3-4]。UDP-葡萄糖醛酸是細(xì)胞內(nèi)重要的糖基供體，是結(jié)構(gòu)多糖、透明質(zhì)酸和細(xì)胞生長(zhǎng)代謝必不可少的前體物質(zhì)[5-7]。UDP-葡萄糖醛酸也可以作為單糖供體用來(lái)延長(zhǎng)糖胺聚糖的糖鏈長(zhǎng)度，對(duì)于研究不同分子大小的糖苷聚糖具有重要意義[8]。目前，因其合成難度大、價(jià)格昂貴，無(wú)法滿足生產(chǎn)需求，因此，探究如何高效合成UDP-葡萄糖醛酸的方法已成為研究熱點(diǎn)。

UDP-葡萄糖醛酸是生物體多糖合成的重要前提，與生物代謝有很大的聯(lián)系。研究表明，存在兩條合成UDP-葡萄糖醛酸的途徑：一種途徑為1-磷酸-葡萄糖醛酸通過(guò)UDP-葡萄糖焦磷酸化酶直接催化生成UDP-葡萄糖醛酸；另一條途徑在動(dòng)物和細(xì)菌中較為常見，以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)為輔因子、UDP-葡萄糖為底物，通過(guò)UDP-葡萄糖6-脫氫酶氧化UDP-葡萄糖合成UDP-葡萄糖醛酸[9-10]。這為本實(shí)驗(yàn)室研究酶法合成UDP-葡萄糖醛酸提供了有效的思路，本研究是以來(lái)源于化膿性鏈球菌Streptococcuspyogenes的尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶(UDP-glucose dehydrogenase，UGD)，催化UDP-葡萄糖氧化生成UDP-葡萄糖醛酸，偶聯(lián)豬源的乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)來(lái)減弱體系中反饋抑制作用(反應(yīng)路線見圖1)，并通過(guò)高效液相色譜、質(zhì)譜及核磁共振氫譜對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，以期為后續(xù)UDP-葡萄糖醛酸制備提供新思路。

圖1 UDP-葡萄糖醛酸酶法合成路線

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種的來(lái)源基因工程菌EscherichiacoliBL21/pET-28a(+)-UGD、EscherichiacoliBL21/pET-28a(+)-LDH均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、保存。

1.1.2試劑UDP-葡萄糖由本實(shí)驗(yàn)室合成；UDP-葡萄糖醛酸標(biāo)品購(gòu)買自上海源葉生物科技有限公司；丙酮酸鈉、β-巰基乙醇購(gòu)買自生工生物工程(上海)股份有限公司；其他實(shí)驗(yàn)試劑均購(gòu)買自上海國(guó)藥集團(tuán)。

1.1.3設(shè)備與儀器UV1800紫外分光光度計(jì)(皓堤儀器(上海)有限公司)；QT-58B紫外檢測(cè)器(上海琪特科技有限公司)；1260高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司)；MALDI SYNAPT MS超高相液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)沃特世公司)；Avance Ⅲ 400 MHz全數(shù)字化核磁共振波譜儀(德國(guó)布魯克公司)。

1.2 UGD、LDH的表達(dá)與純化

1.2.1重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)分別挑取本實(shí)驗(yàn)室保存的重組菌pET-28a(+)/UGD、pET-28a(+)/LDH接種至50 mL的LB培養(yǎng)基中(卡那霉素終濃度為50 μg·mL-1)，37 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)過(guò)夜。再按2%的接種量接種至500 mL的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)，當(dāng)OD600達(dá)到0.7～0.8時(shí)，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)。UGD菌液中IPTG的終濃度為0.3 mmol·L-1，于25 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)過(guò)夜；LDH菌液中IPTG的終濃度為0.5 mmol·L-1，30 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)過(guò)夜。4 ℃、8 000 r·min-1離心15 min收集菌體，于-80 ℃保存。

1.2.2產(chǎn)物純化稱取6 g菌體，加入5倍體積的裂解液(20 mmol·L-1Tris，100 mmol·L-1NaCl，pH 8.0)，采用超聲破碎(破碎3 s停6 s，功率45%，時(shí)間35 min)，4 ℃、15 000 r·min-1離心20 min收集上清，目標(biāo)蛋白用His標(biāo)簽柱純化，純化得到的酶液加終濃度為15%甘油后置于-80 ℃冰箱保存。純化的目的蛋白用12%聚丙酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢驗(yàn)。

1.2.3酶濃度的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)(Bradford)法蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定[11]。取一定量的5 mg·mL-1牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，用1×PBS稀釋成終濃度為200 μg·mL-1，然后按一定的比例稀釋，以1×PBS為溶劑稀釋成終濃度分別為0、10、20、30、40、50 μg·mL-1備用。樣品也以1×PBS為溶劑稀釋成合適的濃度。各取不同濃度的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液及樣品100 μL，加入1 mL Bradford工作液，迅速混勻，室溫反應(yīng)5 min，以終濃度為0 μg·mL-1的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液為對(duì)照，在分光光度計(jì)依次測(cè)定各管的A595值。以濃度為橫坐標(biāo)、相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可算出稀釋后樣品的蛋白濃度，再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得到最終的樣品蛋白濃度。本研究中計(jì)算公式如下：

1.3 UDP-葡萄糖醛酸的酶法合成及體系探討

1.3.1HPLC檢測(cè)方法色譜條件為：YMC-Polyamine(PAMN)(4.6 mm×250 mm，5 μm)，緩沖液A為超純水，緩沖液B為1 mol·L-1KH2PO4；運(yùn)行程序?yàn)椋? min 20% B到40 min 60% B，流速為0.5 mL·min-1，進(jìn)樣量為5 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm，溫度25 ℃。

1.3.2UDP-葡萄糖醛酸標(biāo)品的定量精密稱取UDP-葡萄糖醛酸標(biāo)品10 mg，以純水為溶劑，配制成終濃度為5 mg·mL-1，再根據(jù)不同的稀釋倍數(shù)配成不同的濃度(0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg·mL-1)。根據(jù)1.3.1 HPLC檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3單酶催化UDP-葡萄糖反應(yīng)單酶催化反應(yīng)體系為：2 mL 10 mmol·L-1UDP-葡萄糖、2.5 mL 10 mmol·L-1NAD+、100 μL 1 mol·L-1Tris、20 μL 1 mol·L-1MgCl2、10 μL β-巰基乙醇溶液，調(diào)節(jié)pH至8.0，混合后，加入2.3 mL 0.9 mg·mL-1UGD，補(bǔ)足純水至10 mL。相同體系下，不加UGD酶為對(duì)照組。20 ℃水浴條件下反應(yīng)過(guò)夜，HPLC檢測(cè)產(chǎn)物的生成情況。并依次對(duì)5 mmol·L-1NAD+，5 mmol·L-1UDP-葡萄糖、0.5 mg·mL-1NADH、0.5 mg·mL-1UDP-葡萄糖醛酸的標(biāo)品進(jìn)行相同方法的HPLC檢測(cè)，以判斷各底物及各產(chǎn)物的出峰位置，方便對(duì)酶催化反應(yīng)的圖譜結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。

1.3.4雙酶偶聯(lián)催化UDP-葡萄糖反應(yīng)雙酶偶聯(lián)催化反應(yīng)體系為：2.4 mL 10 mmol·L-1UDP-葡萄糖、1.5 mL 10 mmol·L-1NAD+、100 μL 1mol·L-1Tris、20 μL 1 mol·L-1MgCl2、10 μL β-巰基乙醇溶液、1 mL 100 mmol·L-1丙酮酸鈉，調(diào)節(jié)pH至8.0，混合后，加入2.3 mL 0.9 mg·mL-1UGD、500 μL 1.6 mg·mL-1LDH，補(bǔ)足純水至10 mL。相同體系下，不加LDH酶為對(duì)照組。20 ℃水浴條件下反應(yīng)過(guò)夜。HPLC檢測(cè)產(chǎn)物的生成情況。

1.3.5雙酶催化反應(yīng)條件的優(yōu)化基本反應(yīng)體系(10 mL)為：2.8 mL 10 mmol·L-1UDP-葡萄糖、2.0 mL 10 mmol·L-1NAD+、100 μL 1mol·L-1Tris、20 μL 1 mol·L-1MgCl2、10 μL β-巰基乙醇溶液、1 mL 100 mmol·L-1丙酮酸鈉，混合后，調(diào)節(jié)pH，加入2.3 mL 0.9 mg·mL-1UGD、500 μL 1.6 mg·mL-1LDH，補(bǔ)足純水至10 mL。以此為基礎(chǔ)，探究不同因素對(duì)雙酶催化反應(yīng)的影響。

①pH對(duì)酶活的影響。pH的測(cè)試范圍為7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，25 ℃水浴條件下反應(yīng)過(guò)夜。產(chǎn)物經(jīng)HPLC檢測(cè)，根據(jù)產(chǎn)物生成率最高的對(duì)應(yīng)pH為參照，計(jì)算各pH下酶的相對(duì)活力。

②溫度對(duì)酶活的影響。pH調(diào)節(jié)至8.0，溫度的測(cè)試范圍為15、20、25、30、35 ℃，產(chǎn)物經(jīng)HPLC檢測(cè)，根據(jù)產(chǎn)物生成率最高的對(duì)應(yīng)溫度為參照，計(jì)算各溫度下酶的相對(duì)活力。

③底物濃度UDP-葡萄糖對(duì)反應(yīng)的影響。保持NAD+濃度不變，UDP-葡萄糖濃度的測(cè)試范圍為1.6、2.0、2.4、2.8、3.2 mmol·L-1，pH調(diào)節(jié)至8.0，20 ℃水浴條件下反應(yīng)過(guò)夜。產(chǎn)物經(jīng)HPLC檢測(cè)，根據(jù)產(chǎn)物的生成量及產(chǎn)率擇優(yōu)選擇合適的底物濃度。

④底物濃度NAD+對(duì)反應(yīng)的影響。選擇最優(yōu)的UDP-葡萄糖濃度，保持UDP-葡萄糖濃度不變，NAD+濃度的測(cè)試范圍為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol·L-1，pH調(diào)節(jié)至8.0，20 ℃水浴條件下反應(yīng)過(guò)夜。產(chǎn)物經(jīng)HPLC檢測(cè)，根據(jù)產(chǎn)物的生成量及產(chǎn)率擇優(yōu)選擇合適的底物濃度。

1.4 UDP-葡萄糖醛酸的分離鑒定

1.4.1UDP-葡萄糖醛酸的分離純化根據(jù)1.3.5獲得的最優(yōu)體系搭建雙酶偶聯(lián)催化UDP-葡萄糖反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液稀釋30倍，調(diào)節(jié)pH至8.0，過(guò)0.22 μm濾膜，上樣至平衡好的Q Sepharose層析柱[12]，以20 mmol·L-1Tris(pH 8.0)→1 mol·L-1NaCl進(jìn)行梯度洗脫，紫外檢測(cè)器進(jìn)行監(jiān)測(cè)，HPLC檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm。

1.4.2UDP-葡萄糖醛酸的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)檢測(cè)分析為確定酶促反應(yīng)中新生成物質(zhì)的分子量，對(duì)純化后的液體進(jìn)行LC-MS分析。樣品濃度范圍為0.1～1.0 mg·mL-1，無(wú)需過(guò)濾膜，離心取上清即可，保證溶液澄清透明，置于裝有內(nèi)襯管的棕色小瓶中待檢測(cè)。質(zhì)譜條件：采用負(fù)離子化方式，毛細(xì)管電壓為3.0 kV，錐孔電壓：20 V，離子源溫度100 ℃，脫溶劑氣溫度400 ℃。液相色譜條件：BEH C18(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)，緩沖液A為0.1%甲酸，緩沖液B為乙腈；運(yùn)行程序：0 min 0% B到40 min 30% B，40 min 30% B到45 min 80% B，45 min 80% B到50 min 100% B，50 min 100% B到55 min 0% B，流速為0.3 mL·min-1，進(jìn)樣量為5 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為200～400 nm，溫度45 ℃。檢測(cè)UDP-葡萄糖醛酸的分子量。

1.4.3UDP-葡萄糖醛酸的核磁氫譜(NMR)檢測(cè)分析為確定酶促反應(yīng)中新生成物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，對(duì)透析凍干的產(chǎn)物進(jìn)行NMR分析。純化凍干的產(chǎn)物稱取10 mg，純度>95%，溶于0.5 mL氘代重水中，保證溶液澄清透明，裝入干凈的核磁管中待測(cè)，需注意的是重水溶液常帶有氣泡，溶解后必須將氣泡趕走。采用Bruker Avance Ⅲ 400 MHz核磁共振儀測(cè)定(TMS為內(nèi)標(biāo))。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均進(jìn)行3次以上的重復(fù)實(shí)驗(yàn)。使用Microsoft Office Excel 2016 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，GraphPad Prism 8.0制圖，Origin 8.0 處理液相圖譜數(shù)據(jù)，MassLynx 4.1 處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)，MestReNova 9.0 處理核磁數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 UGD、LDH純化及濃度測(cè)定結(jié)果

UGD、LDH誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)His標(biāo)簽柱純化，純化獲得的目的蛋白通過(guò)SDS-PAGE分析，目的蛋白的大小分別為43.9、36.6 kDa。結(jié)果如圖2所示，2種純化蛋白條帶大小與預(yù)期一致[13-14]。經(jīng)測(cè)定，UGD酶濃度為0.82 mg·mL-1，LDH的酶濃度為1.56 mg·mL-1。

注:1—UGD蛋白；2—LDH蛋白。

2.2 UDP-葡萄糖醛酸標(biāo)品的定量

分別取100 μL UDP-葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)液過(guò)0.22 μm水系濾膜，重復(fù)3次，檢測(cè)UDP-葡萄糖醛酸的峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)峰面積的平均值為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線。由圖3可知，在0.4～1.2 mg·mL-1范圍內(nèi)，UDP-葡萄糖醛酸的濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

圖3 UDP-葡萄糖醛酸含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 單酶催化UDP-葡萄糖氧化反應(yīng)

為研究UGD酶是否催化UDP-葡萄糖氧化反應(yīng)，將反應(yīng)體系中各底物分別進(jìn)行液相檢測(cè)，以判斷各底物的保留時(shí)間，在相同體系下，以不加UGD酶為對(duì)照，通過(guò)對(duì)比以判斷是否有新的物質(zhì)生成，結(jié)果如圖4所示。HPLC檢測(cè)結(jié)果顯示，由圖4可以看出，當(dāng)UGD氧化UDP-葡萄糖時(shí)，水浴過(guò)夜后，HPLC圖譜顯示在8.6 min左右為NAD+、11.8 min左右為UDP-葡萄糖，14.6和27.7 min左右出現(xiàn)新的吸收峰，表明酶促反應(yīng)生成了新的物質(zhì)。由4 C可知，14.6 min左右為NADH，另通過(guò)對(duì)比UDP-葡萄糖醛酸的對(duì)照品(圖4D)，兩者在260 nm處吸收峰的保留時(shí)間分別為27.72和27.76 min，可以初步判斷反應(yīng)生成的產(chǎn)物為UDP-葡萄糖醛酸。表明經(jīng)UGD酶的催化可氧化UDP-葡萄糖生成一種新的物質(zhì)，初步判斷為UDP-葡萄糖醛酸，經(jīng)計(jì)算得出產(chǎn)物的生成量約為0.46 mg·mL-1。

A：5 mmol·L-1 NAD+ HPLC檢測(cè)圖譜；B：5 mmol·L-1UDP-葡萄糖 HPLC檢測(cè)圖譜；C：0.5 mg·mL-1 NADH HPLC檢測(cè)圖譜；D：0.5 mg·mL-1 UDP-葡萄糖醛酸標(biāo)品HPLC檢測(cè)圖譜；E：無(wú)UGD催化UDP-葡萄糖過(guò)夜反應(yīng)圖譜；F：UGD催化UDP-葡萄糖過(guò)夜反應(yīng)圖譜

2.4 雙酶偶聯(lián)催化UDP-葡萄糖反應(yīng)

為研究LDH酶對(duì)催化UDP-葡萄糖氧化反應(yīng)的影響，在相同體系下，以不加LDH酶為對(duì)照，比較生成的目標(biāo)產(chǎn)物UDP-葡萄糖醛酸的峰面積情況，結(jié)果如圖5所示。用HPLC分別對(duì)各個(gè)反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，HPLC檢測(cè)結(jié)果顯示，以圖5A作為對(duì)照，由圖5 B、C可以看出，27.7 min左右出現(xiàn)新的吸收峰，表明酶促反應(yīng)生成了新的物質(zhì)，加入LDH酶后，NADH的生成量明顯減少，因此可以判定UGD、LDH有正確活性，能夠催化UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)化成UDP-葡萄糖醛酸。根據(jù)目標(biāo)物質(zhì)的峰面積帶入U(xiǎn)DP-葡萄糖醛酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出目標(biāo)產(chǎn)物的濃度。經(jīng)計(jì)算，在相同體系下，當(dāng)加入LDH酶后(圖5 C)，產(chǎn)物的生成量約為0.93 mg·mL-1，無(wú)LDH時(shí)(圖5 B)，產(chǎn)物的生成量約為0.49 mg·mL-1，所以加入LDH酶后產(chǎn)量提高了約0.9倍。

A：無(wú)UGD催化UDP-葡萄糖過(guò)夜反應(yīng)圖譜；B：UGD催化UDP-葡萄糖過(guò)夜反應(yīng)圖譜；C：雙酶偶聯(lián)催化UDP-葡萄糖過(guò)夜反應(yīng)圖譜

2.5 酶催化反應(yīng)條件的探究

2.5.1pH對(duì)酶活的影響在25 ℃,pH 7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的條件下，實(shí)驗(yàn)以UDP-葡萄糖和 NAD+為反應(yīng)底物，研究pH對(duì)催化UDP-葡萄糖氧化反應(yīng)的影響。由圖6可知，這2種酶在pH 7.0～8.0時(shí)略有上升，在pH 8.0時(shí)酶活性最高，酶活性在9.0～11.0時(shí)迅速下降，說(shuō)明雙酶偶聯(lián)的最適酶促反應(yīng)的pH為8.0。

圖6 pH對(duì)酶活力的影響

2.5.2溫度對(duì)酶活的影響在pH 8.0，15、20、25、30、35 ℃的條件下，實(shí)驗(yàn)以UDP-葡萄糖和 NAD+為反應(yīng)底物，研究溫度對(duì)催化UDP-葡萄糖氧化反應(yīng)的影響。由圖7所示，20 ℃時(shí)酶活性最高，當(dāng)溫度上升至35 ℃時(shí)，酶活性急劇下降，但是在15 ℃及25 ℃時(shí)仍保留著較高的酶活力，說(shuō)明這2種酶都帶有低溫酶的特征。所以雙酶偶聯(lián)選擇的最適溫度為20 ℃。

圖7 溫度對(duì)酶活力的影響

2.5.3不同UDP-葡萄糖濃度對(duì)反應(yīng)的影響在pH 8.0、20℃條件下，探究不同UDP-葡萄糖濃度對(duì)反應(yīng)的影響。由圖8可知，隨著UDP-葡萄糖濃度的不斷增加，目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量也隨之增加，當(dāng)達(dá)到一定程度時(shí)，產(chǎn)量也隨之減少。而從產(chǎn)率角度而言，當(dāng)UDP-葡萄糖濃度在2.0～2.4 mmol·L-1時(shí)，產(chǎn)率有所增加，隨著UDP-葡萄糖濃度繼續(xù)增加時(shí)，產(chǎn)率隨之減少。綜合考慮，選擇UDP-葡萄糖濃度2.4 mmol·L-1時(shí)為最優(yōu)底物濃度。

圖8 UDP-葡萄糖濃度對(duì)反應(yīng)的影響

2.5.4不同NAD+濃度對(duì)反應(yīng)的影響在pH 8.0、20 ℃條件下，探究不同NAD+濃度對(duì)反應(yīng)的影響。由圖9可知，隨著NAD+濃度的增大，產(chǎn)量和產(chǎn)率的趨勢(shì)都保持一致，綜上，最適NAD+濃度為1.5 mmol·L-1。

圖9 NAD+濃度對(duì)反應(yīng)的影響

2.6 UDP-葡萄糖醛酸分離純化結(jié)果

在一定pH條件下，利用不同物質(zhì)所帶電荷不同的性質(zhì)，采用強(qiáng)堿性陰離子吸附柱Q Sepharose實(shí)現(xiàn)不同物質(zhì)分離的效果[15]。樣品凍融后稀釋30倍，減少反應(yīng)液中鹽離子對(duì)目標(biāo)物質(zhì)吸附效果的影響，再經(jīng)Q Sepharose 強(qiáng)堿性陰離子吸附柱交換純化得到目標(biāo)物質(zhì)，采用NaCl作為洗脫鹽，借助AKTA進(jìn)行分離純化。鹽溶液開始洗脫時(shí)，在260 nm出現(xiàn)洗脫峰時(shí)開始收集，經(jīng)HPLC結(jié)果顯示(圖10)，在150 mmol·L-1NaCl處洗脫出目標(biāo)物質(zhì)UDP-葡萄糖醛酸，純度為90%以上。

圖10 UDP-葡萄糖醛酸純化HPLC檢測(cè)圖譜

2.7 UDP-葡萄糖醛酸質(zhì)譜分析

為確定反應(yīng)體系中新生成物質(zhì)的分子量，將反應(yīng)液進(jìn)行純化后，分別對(duì)UDP-葡萄糖醛酸標(biāo)品和UDP-葡萄糖醛酸樣品做液相-質(zhì)譜分析(LC-MS)，由圖11可知，純化后的UDP-葡萄糖醛酸樣品(圖11 B)在質(zhì)譜條件下荷質(zhì)比為579.0，與標(biāo)準(zhǔn)品UDP-葡萄糖醛酸(圖11 A)測(cè)得的荷質(zhì)比吻合，本實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)使用的是負(fù)離子源，所以顯示的分子量是579.0。結(jié)果表明，經(jīng)LC-MS檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品UDP-葡萄糖醛酸與純化的樣品荷質(zhì)比一致，其分子量都為580.0。

A：UDP-葡萄糖醛酸標(biāo)品質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果；B：UDP-葡萄糖與NAD+反應(yīng)生成產(chǎn)物的質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果

2.8 產(chǎn)物結(jié)構(gòu)分析

為確定反應(yīng)體系中新生成物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，將反應(yīng)產(chǎn)物透析凍干后做相應(yīng)的核磁共振氫譜檢測(cè)，結(jié)果如圖12所示。參考相關(guān)文獻(xiàn)[16]，采用氘代重水溶解，試樣中加入TMS作為內(nèi)標(biāo)，該結(jié)構(gòu)共有19個(gè)氫，其中有6個(gè)活潑氫會(huì)被氘取代，所以共有13個(gè)氫能通過(guò)共振吸收電磁波能量檢測(cè)到相關(guān)信號(hào)。借助Chemdraw模擬的氫譜結(jié)果進(jìn)行比較，并參考相關(guān)文獻(xiàn)[17]，證實(shí)雙酶偶聯(lián)催化生成的產(chǎn)物為UDP-葡萄糖醛酸，產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及檢測(cè)結(jié)果如圖12所示。

注：1H NMR(400 MHz, Deuterium Oxide)δ 7.97(d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.00(s, 1H), 5.63(dd, J = 7.6, 3.5 Hz, 1H), 4.38(t, J = 4.2 Hz, 2H), 4.30(p, J = 2.7 Hz, 1H), 4.23(dd, J = 4.5, 2.4 Hz, 1H), 4.20(dd, J = 5.5, 2.8 Hz, 1H), 4.15(d, J = 10.2 Hz, 1H), 3.79(t, J = 9.5 Hz, 1H), 3.74(s, 1H), 3.58(dt, J = 9.8, 3.1 Hz, 1H), 3.54-3.47(m, 1H)。

3 討論

目前有關(guān)UDP-葡萄糖醛酸的研究并不多，大部分的研究都是以UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶為主。UDP-葡萄糖醛酸生產(chǎn)成本高，價(jià)格昂貴。合成UDP-葡萄糖醛酸主要有2種方法，分別是化學(xué)合成和生物合成。因其結(jié)構(gòu)復(fù)雜,化學(xué)合成相對(duì)困難且產(chǎn)量較低，同時(shí)給環(huán)境造成極大的污染[16]；相比化學(xué)法，酶法合成是種有效的替代策略，具有很高的立體和區(qū)域選擇性、安全性高等優(yōu)點(diǎn)[17]，可廣泛用于研究。

齊晨[18]對(duì)大腸桿菌源的UGD進(jìn)行重組表達(dá)及優(yōu)化，以UDP-葡萄糖為底物催化合成UDP-葡萄糖醛酸，發(fā)現(xiàn)底物轉(zhuǎn)化率并不理想。在UGD的催化下，UDP-葡萄糖氧化生成UDP-葡萄糖醛酸，將葡萄糖的C6從羥基氧化成羰基，且不釋放中間體[19]，產(chǎn)物之一的NADH會(huì)反饋抑制反應(yīng)的進(jìn)行，導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)量不高、效率較低且煙酰胺類輔酶成本高昂、穩(wěn)定性較差，生產(chǎn)成本隨之增高。紀(jì)小虎[14]以新鮮牛肝臟為原料，采用分步鹽析-熱變性法制備UGD粗品，加入市售的兔肌LDH，一鍋酶法合成UDP-葡萄糖醛酸。基于已有研究成果，本研究以UDP-葡萄糖為底物、NAD+為輔因子，采用UGD和LDH雙酶偶聯(lián)催化，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜及核磁共振氫譜檢測(cè)，判定產(chǎn)物為UDP-葡萄糖醛酸。

該酶促反應(yīng)中的2種關(guān)鍵酶UGD和LDH分別來(lái)源于化膿性鏈球菌和豬體內(nèi)。本研究引入LDH減弱反應(yīng)中的高能副產(chǎn)物對(duì)底物的反饋抑制作用，實(shí)現(xiàn)NAD+的循環(huán)再生，減少昂貴的外源NAD+的添加，從而降低成本；并有利于反應(yīng)向正方向進(jìn)行，產(chǎn)率提高了0.9倍，產(chǎn)量約為0.93 mg·mL-1。該反應(yīng)在體外進(jìn)行，相對(duì)胞內(nèi)反應(yīng)，反應(yīng)更具可控性，更利于反應(yīng)的進(jìn)行[20]。由于這2種酶都帶有His標(biāo)簽，可將其進(jìn)行固定，省去純化等繁瑣步驟，實(shí)現(xiàn)酶的重復(fù)利用，這樣可以使用固定化酶多次重復(fù)反應(yīng)，具有更好的經(jīng)濟(jì)性，也可以尋求更具高活性的NAD+依賴型氧化還原性酶，來(lái)實(shí)現(xiàn)更高的UDP-葡萄糖醛酸合成效率。