曾桃花, 李文茹, 謝小保, 施慶珊, 張建設(shè)

1.廣東省科學(xué)院微生物研究所，華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510070；2.浙江海洋大學(xué)，國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，浙江 舟山 316022

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa, PA)是一種革蘭氏陰性條件致病菌，極易引起院內(nèi)感染，PA已對多種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性，其防治難度逐漸增大[1]。群體感應(yīng)(quorum sensing, QS)系統(tǒng)是一種細(xì)菌細(xì)胞與細(xì)胞間的通訊系統(tǒng)，當(dāng)細(xì)菌種群密度達(dá)到一定閾值時，能夠向環(huán)境中釋放特定的信號分子，表現(xiàn)出單一細(xì)胞無法完成的一系列生理功能與行為，如毒素的分泌、生物發(fā)光、生物被膜的形成等[2]。PA的外毒素A、彈性蛋白酶、胞外蛋白酶、綠膿菌素、鼠李糖脂等眾多毒力因子的產(chǎn)生都受到其QS系統(tǒng)的調(diào)控作用，抑制PA的QS系統(tǒng)可下調(diào)其毒力基因的表達(dá)和毒力因子的產(chǎn)生，達(dá)到PA防治目的[3-4]。同時，研究發(fā)現(xiàn)，群體感應(yīng)抑制劑(quorum sensing inhibitors, QSI)輕微抑制或不抑制細(xì)菌的生長，不會給耐藥菌提供有利的選擇壓力，因此，QSI有望成為彌補(bǔ)傳統(tǒng)抗生素的一種新型抗菌藥物[5]。

QS最早發(fā)現(xiàn)于1965年，肺炎雙球菌(Pneumococcus)分泌的一種多肽分子(第一個被發(fā)現(xiàn)的QS信號分子)能促進(jìn)其對外源DNA的吸收[6]。隨后，于1970年發(fā)現(xiàn)海洋細(xì)菌費(fèi)氏弧菌(Vibriofischeri)的發(fā)光受QS的調(diào)控，而且生物發(fā)光量與細(xì)菌密度成正比[7]。同時，在研究費(fèi)氏弧菌發(fā)光機(jī)制時，研究人員提出了LuxI/LuxR QS系統(tǒng)，其中l(wèi)uxI負(fù)責(zé)編碼合成N-3-oxohexanoyl-L-homoserine lactone(3OC6-HSL)信號分子合成酶LuxI，3OC6-HSL是一種N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯分子(N-acyl homoserine lactone，簡稱AHL)，luxR負(fù)責(zé)編碼合成信號分子受體蛋白LuxR[8]。直到1994年，F(xiàn)uqua等[9]根據(jù)費(fèi)氏弧菌、哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)、PA等的密度依賴現(xiàn)象，正式提出了QS這一概念。之后的20多年，在多種微生物中也發(fā)現(xiàn)了QS現(xiàn)象，對QS系統(tǒng)和信號分子也展開了研究。QS作用效應(yīng)和作用機(jī)制以及QSI也被廣泛研究，但是QS在實(shí)際應(yīng)用方面的研究較少。

目前，對PA的QS系統(tǒng)的研究已經(jīng)比較透徹，也發(fā)現(xiàn)多種化合物對PA有QS抑制活性[10-11]。植物精油具有抗菌活性、抗病毒能力且安全低毒，是比較理想的天然QSI[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，大蒜(Alliumsativum)[4]、丁香(Syzygiumaromaticum)[14]、茶樹(Camelliasinensis)[15]等植物精油及其主要成分都能抑制PA的QS系統(tǒng)?；诖耍疚氖崂砹算~綠假單胞菌QS系統(tǒng)的組成及其級聯(lián)調(diào)控關(guān)系，簡要介紹了植物精油的QS抑制機(jī)制和抑制活性，并重點(diǎn)綜述了萜烯類化合物、芳香族化合物、脂肪族化合物、含硫含氮化合物4類精油化合物對銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)抑制作用的研究進(jìn)展，以期為天然QSI的篩選和QS抑制機(jī)制的研究提供參考。

1 銅綠假單胞菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)

QS現(xiàn)象主要存在于細(xì)菌中[16]，在少數(shù)真菌[17]、病毒[18]中也有所發(fā)現(xiàn)。PA是革蘭氏陰性菌QS研究的模式菌株，對其QS系統(tǒng)、信號分子的研究都已較為透徹，但是對于該菌的QS調(diào)控機(jī)制的研究還不夠系統(tǒng)和完善[8]。PA環(huán)境適應(yīng)性很強(qiáng)，其中約10%的基因參與包括QS在內(nèi)的調(diào)控作用[3]。大多數(shù)毒力因子，如綠膿菌素、彈性蛋白酶、群集運(yùn)動(swarming motility)和生物被膜的形成都受其QS系統(tǒng)基因和相關(guān)毒力基因調(diào)控[4]。PA至少包括3種QS系統(tǒng)：las、rhl、pqs系統(tǒng)，并呈現(xiàn)出級聯(lián)調(diào)控的特點(diǎn)[10]。

1.1 las系統(tǒng)

隨著LuxI/LuxR QS系統(tǒng)的提出，科學(xué)家開始探索luxI和luxR的同源基因。幾乎在LuxI/LuxR QS系統(tǒng)提出的同時，就發(fā)現(xiàn)了PA的lasR與luxR具有同源性，lasR負(fù)責(zé)編碼產(chǎn)生信號分子受體蛋白LasR，LasR與LuxR的氨基酸序列相似性也高達(dá)27%[19]。后來又證明lasI是luxI的同源基因，負(fù)責(zé)編碼PA信號分子(Pseudomonasaeruginosaautoinducer，PAI)的合成[20]，并發(fā)現(xiàn)PAI為一種AHL分子，其化學(xué)名稱為N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone(3OC12-HSL)，當(dāng)3OC12-HSL積累到一定濃度時，LasR與3OC12-HSL結(jié)合形成調(diào)節(jié)子LasR/3OC12-HSL，促進(jìn)毒力因子的表達(dá)[21]。研究發(fā)現(xiàn)las系統(tǒng)能調(diào)控外毒素A、蛋白酶LasA、彈性蛋白酶LasB和堿性蛋白酶的產(chǎn)生，還能通過誘導(dǎo)上皮細(xì)胞的凋亡等途徑減弱免疫缺陷患者的免疫應(yīng)答[3]。

1.2 rhl系統(tǒng)

PA彈性蛋白酶LasB的表達(dá)需要LasR的激活[19]。同時向攜帶lasR質(zhì)粒的大腸桿菌和攜帶lasR質(zhì)粒的PA ΔlasR突變體添加外源PAI，都可以激活lasB表達(dá)，但激活PA的lasB表達(dá)所需的PAI濃度大約為大腸桿菌的200倍，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于正常濃度[21-22]。因此猜測PA中存在其他誘導(dǎo)因子，促進(jìn)lasB的表達(dá)。經(jīng)鑒定，PA中確實(shí)存在3OC12-HSL之外的PAI，其化學(xué)名稱為N-butyryl-L-homoserine lactone(C4-HSL)，和3OC12-HSL一樣為AHL分子，這也是在PA中發(fā)現(xiàn)的第2個AHL信號分子[22]。C4-HSL不能直接與LasR作用，而且lasI也不能誘導(dǎo)C4-HSL的產(chǎn)生，因此推測PA中還存在其他QS系統(tǒng)，與las系統(tǒng)共同調(diào)控彈性蛋白酶的表達(dá)[22]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，rhlABR基因簇編碼的RhlR是LuxR和LasR的同源蛋白，rhlI是luxI的另一個同源基因，而且rhlI參與了C4-HSL的合成[23-24]。并證明RhlR蛋白能與信號分子C4-HSL作用形成復(fù)合物RhlR/C4-HSL，該復(fù)合物能調(diào)控彈性蛋白酶、鼠李糖脂、綠膿菌素的合成[24]。因此，rhl系統(tǒng)被證明是PA的另一個QS系統(tǒng)，并且與las系統(tǒng)是相互聯(lián)系的。

1.3 pqs系統(tǒng)

pqs系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)也與彈性蛋白酶的研究有關(guān)。彈性蛋白酶LasB的表達(dá)是由las和rhl系統(tǒng)共同調(diào)控的，無論是lasI還是rhlI突變，lasB的表達(dá)量都會大幅降低。但在ΔlasR突變體中加入野生型銅綠假單胞菌PAO1的上清液，發(fā)現(xiàn)lasB表達(dá)顯著升高，而單獨(dú)加入3OC12-HSL、C4-HSL或者加入二者混合物都不能產(chǎn)生類似結(jié)果，這些現(xiàn)象表明PA中還存在第3種信號分子刺激彈性蛋白酶的產(chǎn)生[25]。經(jīng)分析鑒定該信號分子化學(xué)名稱為2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolone，屬于4-喹諾酮類化合物，Pesci等[25]把它定義為Pseudomonasquinolone signal(PQS)。隨著PQS信號分子的發(fā)現(xiàn)，PQS的合成酶和受體蛋白的相關(guān)研究逐漸展開。之后發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌PA14菌株的ΔmvfR(后來改名為pqsR)突變體對小鼠和擬南芥的毒力作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于野生型PA14，pqsR編碼的LysR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PqsR不僅能促進(jìn)信號分子(3OC12-HSL和PQS)、毒力因子(彈性蛋白酶和磷脂酶)的產(chǎn)生以及生物被膜的形成，還能通過參與phnAB操縱子的表達(dá)調(diào)節(jié)吩嗪的合成，證明PqsR調(diào)節(jié)蛋白參與PA的QS網(wǎng)絡(luò)調(diào)控[26]。研究發(fā)現(xiàn)phnAB區(qū)域的多個基因突變都能減少PQS的產(chǎn)量，基于該區(qū)域的一個五基因操縱子pqsABCDE，在pqsR不變的條件下，對phnAB區(qū)域突變體進(jìn)行基因回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明pqsABCD是合成PQS的必需基因，pqsE參與綠膿菌素的形成，但不是PQS合成的必需基因[27]。而且還證明lasR突變能大量減少pqsH的轉(zhuǎn)錄量，因此，pqsABCD、phnAB和pqsH都有編碼PQS合成的功能[27]。

1.4 iqs系統(tǒng)

在PA臨床分離菌株中，經(jīng)常檢測到ΔlasI和ΔlasR突變體，但這些突變體還能產(chǎn)生綠膿菌素等毒力因子，而且在磷酸鹽耗竭脅迫條件下rhl系統(tǒng)、pqs系統(tǒng)的表達(dá)都呈現(xiàn)出phoB依賴性[10]。根據(jù)這些現(xiàn)象，Dekimpe等[28]在2009年提出PA允許另一個QS系統(tǒng)接替克服其中一個系統(tǒng)的缺陷。2013年，Lee等[29]證實(shí)PA中確實(shí)存在一個集成型QS系統(tǒng)，能將環(huán)境壓力信號與QS網(wǎng)絡(luò)相連接來增強(qiáng)環(huán)境適應(yīng)能力，并綜述了此系統(tǒng)與PA的其他QS系統(tǒng)之間的關(guān)系[10]。該系統(tǒng)的QS信號分子是2-(2-hydroxyphenyl)-thiazole-4-carbaldehyde(C10H7O2NS)，命名為IQS，是由一個非核糖體肽合成酶基因簇ambBCDE參與合成的；干擾IQS能減少C4-HSL和PQS的產(chǎn)生，但對3OC12-HSL沒有影響，因而推測是由las系統(tǒng)和phoB依賴方式共同調(diào)控IQS的合成[29]。敲除ambB，136個PA基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)發(fā)生了改變，下調(diào)了lasA、lasB、phzM、hcnA、hcnB、pchABCDREFG、rhlA和rhlB等基因的表達(dá)，同時，彈性蛋白酶、綠膿菌素、氰化氫、銅綠假單胞菌螯鐵蛋白、鼠李糖脂的產(chǎn)量也出現(xiàn)下降現(xiàn)象，與基因表達(dá)下調(diào)呈現(xiàn)一致性[29]。然而，2019年，Ahator等[30]提出AmbBCDE酶負(fù)責(zé)抗代謝物(L-2-amino-4-methoxy-trans-3-butenoic acid)的合成，不負(fù)責(zé)合成IQS，且IQS可能是銅綠假單胞菌螯鐵蛋白的前體等想法，對iqs系統(tǒng)的存在提出異議。之后，Cornelis[31]明確提出IQS作為PA群體感應(yīng)信號分子的結(jié)論是錯誤的，IQS的結(jié)構(gòu)與銅綠醛(aeruginaldehyde)的結(jié)構(gòu)相同，是銅綠假單胞菌螯鐵蛋白生物合成或降解的一種副產(chǎn)物，ambABCDE也不參與IQS的合成。綜上所述，iqs系統(tǒng)還存在許多疑惑，例如IQS受體的結(jié)構(gòu)、AmbBCDE酶合成產(chǎn)物在IQS中的作用及其與其他系統(tǒng)的聯(lián)系等，都有待進(jìn)一步研究。

1.5 銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的級聯(lián)調(diào)控

研究發(fā)現(xiàn)，LasR和3OC12-HSL能激活rhlR的轉(zhuǎn)錄，3OC12-HSL能阻止C4-HSL與RhlR結(jié)合，證明las系統(tǒng)能夠從轉(zhuǎn)錄和翻譯后2個水平調(diào)控RhlR蛋白[32]。在ΔlasR突變體(ΔlasR突變體不產(chǎn)生PQS)中分別插入攜帶rhlI、lasI、rhlR、lasR基因的質(zhì)粒，然后加入等量PQS，發(fā)現(xiàn)含rhlI基因的重組質(zhì)粒表達(dá)顯著上調(diào)，含rhlR和lasR的重組質(zhì)粒表達(dá)量有所上升，而含lasI的重組質(zhì)粒表達(dá)僅輕微上調(diào)[33]。PQS大力上調(diào)rhl系統(tǒng)，而對las系統(tǒng)作用不大，說明pqs系統(tǒng)很可能起連接las系統(tǒng)和rhl系統(tǒng)的作用。由此推測，las系統(tǒng)位于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的頂層，正向調(diào)控rhl和pqs系統(tǒng)，pqs系統(tǒng)位于中間層級，起連接作用，正向調(diào)控rhl系統(tǒng)，并受rhl系統(tǒng)的反向調(diào)節(jié)[10]。

2 植物精油對細(xì)菌群體感應(yīng)的抑制效應(yīng)

2.1 植物精油的化學(xué)組分和生物學(xué)活性

QSI來源廣泛，可分為人工合成化合物和天然產(chǎn)物2大類，而天然QSI又可以分為植物源類、動物源類和微生物源類[11]。植物精油，又稱為精油或香精油(essential oil,植物學(xué)用途)、揮發(fā)油(volatile oil，化學(xué)和醫(yī)藥用途)、芳香油(aromatic oil，商業(yè)用途)，是從植物的花、芽、種子、葉、枝、皮、根、樹膠和果實(shí)中提取的芳香味油性液體[34]。植物精油的成分復(fù)雜，一種精油一般由幾十種到幾百種化合物組成，主要為萜烯類化合物、芳香族化合物、脂肪族化合物、含硫含氮化合物等小分子簡單化合物[34]。通常，每種精油只有2～3種相對高濃度的主要成分，占20%～95%，其他成分都是微量存在的[35]。植物精油具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒、抗寄生蟲、抗氧化、抗癌等生物學(xué)活性，而且這些特性通常都是由精油的主要成分決定的[36]。目前，已知的精油大約有3 000種，其中約300種具有商業(yè)用途，根據(jù)其特性，主要用在化妝品、食品添加劑、醫(yī)療、害蟲防治等方面[36]。

2.2 植物精油的群體感應(yīng)抑制機(jī)制

植物在與環(huán)境中細(xì)菌的長期互作過程中，進(jìn)化出了一些抑制細(xì)菌QS的機(jī)制，其產(chǎn)生的QSI可以用來控制病原細(xì)菌，為激活防御機(jī)制爭取時間，避免長時間暴露在病原細(xì)菌的侵染中[37]。根據(jù)QS系統(tǒng)的組成特點(diǎn)和作用機(jī)制，QSI可以在信號分子、信號分子合成酶、信號分子受體3個靶點(diǎn)作用以干擾致病菌的QS系統(tǒng)[38]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾種干擾機(jī)制(相關(guān)QSI化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1)：①Q(mào)SI為信號分子類似物，競爭性結(jié)合信號分子受體蛋白，阻止信號分子與受體蛋白結(jié)合，如丁香酚、6-姜酚和反式茴香醚[39-41]；②QSI通過降解信號分子或減少信號分子的產(chǎn)生抑制信號分子的活性，如丁香酚、d-檸檬烯和法尼醇[42-44]；③QSI降低信號分子合成酶或信號分子受體蛋白的活性，阻止QS通路，如芳樟醇和法尼醇[44-45]。由上可知植物精油可由多種機(jī)制共同干擾病原菌的QS系統(tǒng)。在對QS系統(tǒng)有了一定了解之后，QSI的篩選和合成成為了研究熱點(diǎn)。Rasmussen等[38]提出理想的QSI是一種穩(wěn)定的低分子量化合物，并對信號分子受體蛋白(LuxR同系物)表現(xiàn)出高度特異性；能顯著下調(diào)QS相關(guān)毒力基因的表達(dá)，但對宿主無毒副作用，且不會在宿主的新陳代謝作用下被分解；此外，理想的QSI不會干擾細(xì)菌的基本生命過程，如RNA和蛋白質(zhì)的合成等。根據(jù)植物精油分子量小、低毒以及高抗QS等特性可知，植物精油是一種天然理想的QSI。

A：信號分子3OC12-HSL及其類似物丁香酚、6-姜酚和反式茴香醚的化學(xué)結(jié)構(gòu)；B：d-檸檬烯和法尼醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)；C：芳樟醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)

2.3 植物精油的群體感應(yīng)抑制活性

已有研究表明，多種植物精油及其成分具有細(xì)菌QS抑制活性。芳樟醇(3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇)是一種萜烯醇，全球超過200種植物精油含有芳樟醇，大量存在于芳樟(Cinnamomumcamphora)葉油、芫荽(Coriandrumsativum)油、薰衣草(Lavandulaangustifolia)油等約20種植物精油中[46]。研究表明，不同來源的芳樟醇均具有抗QS活性：從芫荽中提取的芳樟醇能抑制鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)生物被膜的形成，而且可以分散已形成的生物被膜[47]；苦香樹(CascarillaCrotonniveous)皮油和蠟菊(Helichrysum)精油及它們的成分芳樟醇在不影響白色念珠菌(Candidaalbicans)浮游細(xì)胞生長的情況下，能抑制其菌絲轉(zhuǎn)化，減少生物被膜的形成，并且能降低白色念珠菌對秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)的毒力[48]；芳樟葉油的芳樟醇含量高達(dá)51.57%，芳樟醇對紫色色桿菌(Chromobacteriumviolaceum)紫色桿菌素產(chǎn)量的最大抑制率為63%，對其生物被膜的最大抑制率為77.64%，并且能下調(diào)AHL合成基因cviI、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因cviR的表達(dá)[45]；研究人員也會直接從市場上購買精油化合物來研究其QS作用，研究發(fā)現(xiàn)亞抑菌濃度(sub-minimal inhibitory concentration，sub-MIC)的芳樟醇能破壞哈維氏弧菌60%～70%的成熟生物被膜，也能減弱其運(yùn)動能力[49]。芳樟醇不僅能抑制細(xì)菌的QS系統(tǒng)，還具有殺菌作用，芳樟醇可以破環(huán)PA的生物被膜，導(dǎo)致核酸外泄，殺滅細(xì)菌[50]。植物精油及其化合物也用來與抗生素聯(lián)合使用，協(xié)同抑菌，芫荽精油及其主要成分芳樟醇與抗生素聯(lián)合使用，對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)和革蘭氏陰性菌PA、大腸桿菌的抑菌效果都顯著增加，而且能極大降低抗生素的MIC和病原菌對抗生素的耐藥性[51]。

茶樹精油是從互葉白千層(MelaleucaalternifoliaCheel)中提取的一種精油，常用來殺菌消炎，在醫(yī)藥、化妝品、香料等行業(yè)都得到廣泛應(yīng)用[15]。茶樹精油約由100種不同活性成分組成，4-萜烯醇[4-甲基-1-(1-甲基乙基)-3-環(huán)己烯-1-醇]是其主要成分之一，低濃度的茶樹精油及4-萜烯醇都能抑制紫色色桿菌的紫色桿菌素產(chǎn)生，并抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的形成和PAO1的群集運(yùn)動[15]。薄荷(Menthapiperita)精油能干擾嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、PA和紫色色桿菌的AHL依賴的毒力因子產(chǎn)生，其主要成分薄荷醇(2-異丙基-5-甲基環(huán)己醇)發(fā)揮重要作用[52]。薄荷醇是一種環(huán)類單萜，主要用于生產(chǎn)固體香料、清涼劑和止痛劑，香茅醛(3,7-二甲基-6-辛烯醛)或百里酚(5-甲基-2-異丙基苯酚)都可以合成薄荷醇[53]。此外，大蒜[4]、丁香[39]、牛至(Origanumvulgare)[54]、檸檬草(Cymbopogoncitratus)[55]、百里香(Thymusmongolicus)[56]等精油的化合物都可作為QSI，可在一定程度上抑制病原菌的毒力。

3 植物精油活性成分對銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制作用研究進(jìn)展

3.1 萜烯類化合物

分子中含有雙鍵的萜類化合物稱為萜烯類化合物，萜烯類化合物廣泛存在于植物體內(nèi)。葡萄柚(Citrusparadisi)精油賦予食物風(fēng)味與芳香，可作為食品的抗菌添加劑，Luciardi等[43]采用冷壓法和水蒸氣蒸餾法得到了2種葡萄柚精油，主要成分都為d-檸檬烯[1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)環(huán)己烯]。隨后，以2株P(guān)A菌株為受試菌株(一株為銅綠假單胞菌ATCC 27853，另一株從食物中毒患者體內(nèi)分離而來)，比較葡萄柚精油及其主要成分d-檸檬烯對PA的QS抑制效果，研究發(fā)現(xiàn)葡萄柚精油和d-檸檬烯都可以抑制PA生物被膜的形成，減弱彈性蛋白酶的活性，并減少AHL的產(chǎn)量，而且d-檸檬烯的抑制作用僅略低于葡萄柚精油，說明主要成分起主導(dǎo)作用，次要成分起協(xié)同作用[43]。此結(jié)論與前人的研究結(jié)果一致，Noumi等[15]發(fā)現(xiàn)茶樹精油對PAO1群集運(yùn)動的抑制率為33.33%，而其主要成分4-萜烯醇的抑制率為25%，接近于茶樹精油，證明精油主要成分的QS抑制作用很強(qiáng)。薄荷精油及其主要成分薄荷醇也可以干擾PAO1的las和pqs系統(tǒng)，達(dá)到QS抑制目的[52]。

本課題組還發(fā)現(xiàn)了另一種萜烯類活性化合物，法尼醇(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二烷三烯-1-醇)，對PAO1具有QS抑制活性。法尼醇能夠抑制pqs系統(tǒng)中PQS信號分子合成酶基因pqsABCDE和pqsH的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，但是不影響PQS受體編碼基因pqsR的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，也不影響las和rhl系統(tǒng)中關(guān)鍵基因的表達(dá)。而且法尼醇不會抑制PA的生長，但卻抑制了該菌PQS信號分子的合成，同時抑制了該菌綠膿菌素的產(chǎn)生[44]。此外，本課題組目前正在開展香茅(Cymbopogonnardus)活性化合物對PA的QS抑制效應(yīng)與機(jī)制研究，前期分析了香茅精油的主要成分，并研究了其抗菌作用，發(fā)現(xiàn)香茅精油具有一定的抗真菌和抗細(xì)菌作用[57]。香茅精油主要為亞香茅植物的提取物，包括香茅醛、香葉醇(3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇)和香茅醇(3,7-二甲基-6-辛烯-1-醇)3種主要成分，均為萜烯類化合物，具有抗菌、抗氧化、驅(qū)蚊蟲和傷口愈合等功效，因高效、低毒、高客戶滿意度被美國國家環(huán)境保護(hù)局注冊為殺蟲劑[58]。有研究報道亞香茅等多種哥倫比亞植物均具有QS抑制活性[59]。目前，香茅精油在QS方面的研究比較少，而且?guī)缀醵际荙S抑制效應(yīng)方面的研究，如香茅精油能抑制大腸桿菌[60]、金黃色葡萄球菌[61]、白色念珠菌[62]生物被膜的形成，但其抑制機(jī)理尚不明確，暫無關(guān)于PA的QS方面的研究。本課題組的研究表明了香茅醛、香葉醇、香茅醇3種香茅化合物對PA均有QS抑制活性，并且初步研究了它們的QS抑制機(jī)理。

3.2 芳香族化合物

芳香族化合物是一類具有芳環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物，是植物精油中的第二大類化合物，僅次于蒎烯類。丁香精油香氣濃郁持久、安全性高、有抗菌作用，其主要成分丁香酚(1-烯丙基-3-甲氧基-4-羥基苯)已被中國、美國、歐盟等國家認(rèn)定為食品防腐劑[63]。起初，研究人員發(fā)現(xiàn)丁香精油能抑制PA胞外蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、綠膿菌素、胞外多糖等毒力因子產(chǎn)生以及減弱其泳動(swimming motility)能力和生物被膜的形成，并做了些簡單的表型研究[14,64-65]。接著，開始嘗試探索丁香精油的QS抑制機(jī)制，發(fā)現(xiàn)丁香精油能從以下幾個方面抑制PA的QS系統(tǒng)。①阻止信號分子與受體結(jié)合。丁香酚通過疏水作用與LasR的關(guān)鍵氨基酸殘基Arg61和Tyr41的氫鍵結(jié)合，阻止3OC12-HSL和受體LasR相互作用[39]。②下調(diào)QS系統(tǒng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。丁香精油能抑制pqsA的轉(zhuǎn)錄，并通過豬皮膚體外研究實(shí)驗(yàn)證實(shí)了丁香精油能抑制生物被膜形成，促進(jìn)已形成的生物被膜解聚[39]。③抑制信號分子的數(shù)量。之后又發(fā)現(xiàn)丁香精油能減少參與PA QS的AHL信號分子的數(shù)量，并且用PAO1菌株感染秀麗隱桿線蟲，建立了動物發(fā)病模型，發(fā)現(xiàn)丁香精油能夠減弱PAO1對秀麗隱桿線蟲的毒力，降低其死亡率[42]，以上丁香精油QS抑制作用研究所用PA菌株，除從臨床分離得到的50株外[14]，其他都為實(shí)驗(yàn)室保藏的PAO1菌株。

生姜(Zingiberofficinale)可食用，也可入藥，具有驅(qū)寒、止吐、解毒、抗炎、抗氧化、抗癌、殺菌等功效，應(yīng)用廣泛[66]。6-姜酚[(S)-5-羥基-1-(4-羥基-3-甲氧苯基)-3-癸酮]是姜根莖油的主要活性成分之一，具有抗炎、強(qiáng)心、鎮(zhèn)痛等作用[66]。研究表明6-姜酚也能抗QS，在低濃度下能抑制銅綠假單胞菌PA14生物被膜的形成，對其胞外蛋白酶、綠膿菌素、鼠李糖脂等毒力因子的抑制率分別達(dá)到19%～53%、21%～43%、36%～60%，6-姜酚也能減弱PA14對小鼠的毒害作用，使小鼠的存活率增加50%～70%[40]。研究發(fā)現(xiàn)6-姜酚的結(jié)構(gòu)與信號分子3OC12-HSL類似，能和3OC12-HSL競爭性與LasR結(jié)合，減少3OC12-HSL的結(jié)合位點(diǎn)，用計(jì)算機(jī)進(jìn)行分子對接分析，證實(shí)了6-姜酚能與LasR通過氫鍵和疏水相互作用發(fā)生分子結(jié)合[40]。6-姜酚類似物能通過破壞PA14的QS系統(tǒng)來緩解反滲透過程中的生物污染，但不會破壞反滲透膜的形態(tài)和化學(xué)結(jié)構(gòu)[67]。

同丁香酚、6-姜酚一樣，反式茴香醚[(E)-1-甲氧基-4-(1-丙烯基)苯][41]、反式肉桂醛[(E)-3-苯基-2-丙烯醛][1]和香芹酚(5-異丙基-2-甲基苯酚)[68]都是大量存在于植物精油中的芳香族化合物，而且都對PA表現(xiàn)出一定的QS抑制作用。反式茴香醚是茴芹(Pimpinellaanisum)精油的主要成分，常用來調(diào)味，經(jīng)分子對接分析和蛋白質(zhì)-配體相互作用研究，發(fā)現(xiàn)反式茴香醚與LasR的氫鍵作用方式類似于3OC12-HSL與LasR，反式茴香醚通過阻止信號分子與LasR的結(jié)合，阻斷PAO1的QS系統(tǒng)[41]。反式肉桂醛是肉桂(Cinnamomumcassia)精油的主要活性化合物之一，低濃度的反式肉桂醛使PAO1的lasI和lasR表達(dá)水平分別下調(diào)了13和7倍，使胞外蛋白酶、彈性蛋白酶和綠膿菌素的產(chǎn)量分別下降了65%、22%和32%[1]。肉桂精油及其主要成分肉桂醛都具有抗菌作用，可作牙膏用香精，低濃度的肉桂精油也能減少PAO1毒力因子的產(chǎn)生，但是高濃度的肉桂精油對PAO1具有殺菌作用[69]。香芹酚存在于牛至等精油中，能減少銅綠假單胞菌ATCC 10154生物被膜的形成和綠膿菌素的產(chǎn)生[68]。

3.3 脂肪族化合物

脂肪族化合物是幾乎存在于所有精油中的小分子化合物，但含量較少，并非精油的主要成分[34]。肉豆蔻酸(十四酸)是一種以甘油酯形式存在于豆蔻(AlpiniakatsumadaiHayata)油、棕櫚(ElaeisguineensisJacq.)油、椰子(CocosnuciferaL.)油等植物油脂中的脂肪族化合物，研究發(fā)現(xiàn)肉豆蔻酸能抑制PA的QS活性[70]。用PA感染洋蔥鱗莖傷口組織，發(fā)現(xiàn)相對于未被感染的組織，被感染的洋蔥組織中缺少泛酸內(nèi)酯、4,5-二氫-4,5-二甲基呋喃-2(3H)-1、肉豆蔻酸和亞油酸4種化合物[70]。并證明了肉豆蔻酸和泛酸內(nèi)酯在不影響PA生長的情況下，能抑制毒力因子綠膿菌素、胞外蛋白酶、脂肪酶、果膠酶的活性[70]。

3.4 含硫含氮化合物

含硫含氮化合物存在于具有辛辣刺激的植物精油中。大蒜素(allicin)，是從大蒜中提取的一種含硫化合物，該化合物不穩(wěn)定。大蒜素通過氣質(zhì)聯(lián)用檢測，主要成分包括二烯丙基三硫醚和二烯丙基二硫醚(diallyl disulfide, DADS)等，具有抗癌、抗炎、抗菌、抗氧化等多種生物活性[71]。研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素通過抑制PAO1的rhl和pqs系統(tǒng)，減少其彈性蛋白酶、綠膿菌素、銅綠假單胞菌鐵載體和鼠李糖脂等QS相關(guān)毒力因子的產(chǎn)生[71]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，大蒜活性化合物DADS能夠抑制PAO1 QS系統(tǒng)中關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，包括las系統(tǒng)中的lasI和lasR，rhl系統(tǒng)中的rhlI和rhlR，以及pqs系統(tǒng)中的pqsABCDE、pqsH和pqsR[4,72]。而且，低濃度的DADS不會影響PAO1的生長，但能夠抑制該菌QS系統(tǒng)調(diào)控的毒力因子的產(chǎn)生，如抑制該菌彈性蛋白酶和綠膿菌素的產(chǎn)量，抑制生物被膜的形成，抑制該菌的群集運(yùn)動等，而且DADS對這些毒力因子的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系[4]。

綜上所述，萜烯類化合物、芳香族化合物、脂肪族化合物、含硫含氮化合物4類化合物抑制PA QS系統(tǒng)的靶點(diǎn)和作用機(jī)制不盡相同，表1綜合了這4種化合物對PA QS系統(tǒng)的抑制作用。

4 展望

細(xì)菌的QS研究，從前期探索到概念提出，從信號分子發(fā)現(xiàn)到系統(tǒng)組成結(jié)構(gòu)研究，從毒力調(diào)控機(jī)制探索到QSI應(yīng)用，到如今已將近半個世紀(jì)。PA是QS研究的模式菌株之一，公認(rèn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了las、rhl、和pqs3種PA的QS系統(tǒng)。las、rhl、pqs的發(fā)現(xiàn)和研究都發(fā)生在20世紀(jì)90年代末到21世紀(jì)初，對其QS系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和組成、各系統(tǒng)的層級關(guān)系、以及相關(guān)毒力調(diào)控基因的研究都已經(jīng)比較透徹。iqs系統(tǒng)于2013年才正式提出，相關(guān)研究較少，還存在許多疑惑和質(zhì)疑，有待進(jìn)一步深入研究。PA的眾多毒力因子，如綠膿菌素、彈性蛋白酶、鼠李糖脂等的產(chǎn)生以及生物被膜的形成和群集運(yùn)動都受到其QS系統(tǒng)調(diào)控。由于抗生素的大量使用，PA對多種抗生素產(chǎn)生了耐藥性。QSI減弱致病菌毒力的同時幾乎不抑制細(xì)菌生長，極大減少了耐藥性問題，對致病菌的防御和治療有極大意義。

研究發(fā)現(xiàn)多種化合物都可以抑制細(xì)菌QS，但是天然的理想QSI比較稀少。根據(jù)植物活性化合物分子量小、低毒等特性，植物精油QSI的研究受到廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)大蒜精油、丁香精油等幾十種精油及其提取物都能抑制PA的毒性。植物精油具有成為理想群體感應(yīng)抑制劑的潛力，多種精油都有不錯的QS抑制活性，但是QS抑制機(jī)制尚不清晰。找出植物精油的群體感應(yīng)作用機(jī)制，大批量篩選具有QS抑制活性的植物活性化合物是亟待解決的問題，對解決PA等致病菌感染問題意義深遠(yuǎn)。