李 軍 梁永平 鄒勝章 周長(zhǎng)松 樊連杰,3 # 繆雄誼 謝 浩

(1.中國(guó)地質(zhì)科學(xué)院巖溶地質(zhì)研究所，自然資源部/廣西巖溶動(dòng)力學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林 541004；2.河北建筑工程學(xué)院，河北省水質(zhì)工程與水資源綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 張家口 075000；3.桂林理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，廣西 桂林 541006)

微生物修復(fù)是指利用天然存在的或可培養(yǎng)的功能微生物菌群[1]，在適宜環(huán)境條件下通過自身代謝作用，將污染物降解成無毒或低毒物質(zhì)的一種修復(fù)技術(shù)。目前，地下水的微生物修復(fù)研究主要包括自然衰減修復(fù)和生物刺激修復(fù)。自然衰減修復(fù)是指地下水中天然存在的微生物通過代謝作用在合理時(shí)間段內(nèi)實(shí)現(xiàn)污染物濃度和總量的減少[2]，當(dāng)自然衰減不足以應(yīng)對(duì)污染場(chǎng)地修復(fù)要求時(shí)，就需人為添加修復(fù)劑或功能菌群進(jìn)行環(huán)境調(diào)控，即生物刺激修復(fù)。生物刺激修復(fù)通過向污染地下水中添加修復(fù)劑，為功能菌群提供足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、能量和電子等以達(dá)到污染物快速降解的目的[3-6]。

本研究重點(diǎn)介紹微生物在地下水污染自然衰減修復(fù)和生物刺激修復(fù)中的關(guān)鍵問題和研究進(jìn)展，特別是針對(duì)地下水不同類型污染物特點(diǎn)的修復(fù)研究，以期為地下水污染修復(fù)的基礎(chǔ)研究和實(shí)際應(yīng)用提供新思路。

1 自然衰減修復(fù)

自然衰減修復(fù)的目的是在綠色修復(fù)理念基礎(chǔ)上將地下水中污染物的數(shù)量、可移動(dòng)性、毒性降低到可接受風(fēng)險(xiǎn)水平，該修復(fù)過程相對(duì)其他修復(fù)工程，除必要的污染地下水體控制、微生物和污染物監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)以外，無需實(shí)施人為工程。目前，監(jiān)測(cè)自然衰減(MNA)是國(guó)際上應(yīng)用比較廣泛的一種自然衰減修復(fù)技術(shù)研究方法，但由于早期分子生物學(xué)技術(shù)的限制，多數(shù)研究停留在對(duì)污染物質(zhì)量和環(huán)境地球化學(xué)信息方面的檢測(cè)上?，F(xiàn)代分子生物學(xué)和生物信息學(xué)快速發(fā)展，為揭示MNA的高級(jí)證據(jù)微生物提供支撐。利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)微生物菌群，揭示地下水中污染物自然衰減過程和功能菌群特征，以明確自然衰減機(jī)理，評(píng)估自然衰減能力。通常監(jiān)測(cè)自然衰減方法包括污染地下水的原位微生物檢測(cè)和室內(nèi)自然衰減模擬與定量檢測(cè)[14]1190。

1.1 原位微生物檢測(cè)

地下水污染物無害化自然降解過程中，必須要有能夠降解目標(biāo)污染物的微生物菌群[15]，因此原位微生物檢測(cè)是證明自然衰減能力的重要方法。多數(shù)情況下，原位微生物檢測(cè)并不是在污染場(chǎng)地直接進(jìn)行微生物定量檢測(cè)分析，通常需采集樣品及時(shí)送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)分析，該過程很大程度上依賴現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)分析水平。微生物多樣性與組成方面，通過對(duì)16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序，揭示降解污染物的功能菌群的存在及其豐度，可直接說明微生物具有降解污染物的潛力[16]137。同時(shí)，污染區(qū)微生物菌群多樣性差異也能反映出污染物對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響[17]，已有研究表明，污染物的存在會(huì)強(qiáng)化部分菌群[18]，導(dǎo)致污染區(qū)微生物群落多樣性通常較非污染區(qū)偏低[19]；功能基因方面，利用宏基因組測(cè)序不僅可揭示與污染物轉(zhuǎn)化相關(guān)功能基因信息[20]，而且可預(yù)測(cè)菌群相關(guān)代謝潛力[21]。此外，功能基因芯片也可直接揭示污染地下水中功能基因組成與結(jié)構(gòu)以及代謝潛力[22]，但該技術(shù)并不能發(fā)現(xiàn)未知的功能基因；關(guān)鍵菌群和功能基因的存在只能說明微生物具有降解污染物的潛力，并不能說明基因表達(dá)情況，從環(huán)境微生物mRNA入手進(jìn)行宏轉(zhuǎn)錄組研究，可揭示污染地下水體中功能基因的表達(dá)情況和表達(dá)差異，從轉(zhuǎn)錄水平為自然衰減提供微生物代謝活動(dòng)和驅(qū)動(dòng)生物地球化學(xué)循環(huán)的證據(jù)。

此外，由于地下水樣品運(yùn)輸、保存等過程并不能實(shí)現(xiàn)真正意義上的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，CHANDLER等[23]將DNA擴(kuò)增、標(biāo)記、雜交步驟整合為一體，設(shè)計(jì)出一款單步的微流體裝置，即放大的便攜式生物芯片，可用于污染地下水的微生物原位檢測(cè)，但該技術(shù)相對(duì)室內(nèi)檢測(cè)通量較低，也不能檢測(cè)出未知的微生物信息。

1.2 室內(nèi)自然衰減模擬與定量檢測(cè)

室內(nèi)模擬相對(duì)天然地下水系統(tǒng)，水文地質(zhì)條件更易控制，地下水污染狀態(tài)更易調(diào)節(jié)，污染物自然衰減、微生物菌群變化更易監(jiān)測(cè)和定量分析，這有利于地下水污染物自然衰減的跟蹤研究和定量化評(píng)估。目前，室內(nèi)模擬地下水污染自然衰減常用的裝置包括砂箱和砂柱2種，砂箱模擬一般多用于污染物持續(xù)性的自然衰減監(jiān)測(cè)，實(shí)驗(yàn)周期通常較長(zhǎng)[24]；而砂柱模擬常用于揭示單一變量對(duì)自然衰減的影響，在控制變量條件下，往往需要利用多組砂柱來設(shè)置變量的梯度差異[25]。室內(nèi)自然衰減模擬裝置中降解污染物的功能菌群可來源于原始污染的地下水，即土著微生物，也可采集其他菌群物質(zhì)或投放專門經(jīng)培養(yǎng)馴化的外源功能菌群。

檢測(cè)進(jìn)出水污染物濃度變化是判斷模擬裝置自然衰減能力和衰減持續(xù)時(shí)間最直接的手段，而揭示污染物自然衰減機(jī)制需要從微生物菌群的角度出發(fā)。除原位微生物檢測(cè)常用的分子生物學(xué)技術(shù)外，對(duì)微生物特定物質(zhì)(如核酸序列、多肽、蛋白質(zhì)等)進(jìn)行標(biāo)記，能較好地跟蹤污染物自身降解過程和與污染物降解過程的相關(guān)微生物活動(dòng)；應(yīng)用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)技術(shù)可識(shí)別與污染物轉(zhuǎn)化相關(guān)的功能基因的存在與數(shù)量，該技術(shù)受引物數(shù)量限制，并不能一次檢測(cè)多個(gè)基因，但定量檢測(cè)特定的基因較為實(shí)用；此外，今后有可能通過基因工程技術(shù)構(gòu)建降解能力和適應(yīng)能力更強(qiáng)的工程菌，可進(jìn)一步在地下水污染模型中進(jìn)行菌群降解能力的評(píng)價(jià)[26]，有利于更好地發(fā)揮微生物在修復(fù)地下水污染中的作用。

2 生物刺激修復(fù)

生物刺激修復(fù)通常從兩方面入手，一方面向污染地下水中添加修復(fù)劑，通過環(huán)境調(diào)控來提高土著微生物降解污染物的能力；另一方面向污染地下水中添加經(jīng)實(shí)驗(yàn)室馴化的功能菌群來降解污染物。相對(duì)土壤而言，向地下水中添加功能菌群的應(yīng)用明顯較少。地下水環(huán)境具有無光、低溫、低氧等特點(diǎn)，是一個(gè)近似極端的環(huán)境[27]3，外源菌群在污染地下水中的存活難度、降解污染物的效率和時(shí)效性等不易保證。而土著微生物在污染地下水中本身已具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，相對(duì)而言，溫度、pH等多數(shù)環(huán)境因子并不需要過多人工調(diào)控，因此，多數(shù)研究集中在盡可能不改變地下水環(huán)境下如何刺激土著微生物降解污染物方面。

2.1 添加劑選取

添加劑一般為微生物代謝必需的營(yíng)養(yǎng)、能量和代謝過程所需的電子受供體等物質(zhì)，通過強(qiáng)化微生物代謝能力和菌群豐度，以加速污染物的降解、轉(zhuǎn)化作用。添加劑選取需符合一定要求：不應(yīng)對(duì)生命體和環(huán)境產(chǎn)生毒害作用；對(duì)地下水環(huán)境的改變盡可能??；能夠?yàn)槲⑸锕δ芫禾峁┹^多營(yíng)養(yǎng)、能量和電子等。目前常用的添加劑信息詳見表1。多數(shù)添加劑相對(duì)環(huán)保，為對(duì)生命體無毒害作用的有機(jī)物，同時(shí)在地下水中具有良好的遷移性。但針對(duì)高錳酸鈉這類具有強(qiáng)氧化性的添加劑，其本身具有一定的殺菌作用，使用時(shí)應(yīng)結(jié)合地下水污染的具體情況綜合考慮。

表1 生物刺激修復(fù)中常用的添加劑

2.2 溶解氧(DO)調(diào)節(jié)

地下水DO與氣壓、水溫、水質(zhì)關(guān)系密切，同時(shí)還受水體中微生物數(shù)量、有機(jī)物濃度等綜合影響，通常地下水DO不超過純水(9 mg/L)。微生物可分為好氧微生物、兼性厭氧微生物和厭氧微生物，其代謝過程和代謝速率存在較大差異。適量、充足的氧氣是原位好氧微生物修復(fù)污染水體的關(guān)鍵所在，通?？赏ㄟ^人工曝氣和添加釋氧劑增加地下水含氧量。人工曝氣方法在地下水污染修復(fù)中應(yīng)用較早，但其施工量較大。部分研究嘗試用H2O2作為地下水釋氧劑，而H2O2釋放氧氣過程僅能持續(xù)幾分鐘到幾小時(shí)，同時(shí)，其強(qiáng)氧化性容易導(dǎo)致土著微生物失活而降低污染修復(fù)效果。目前使用較多的是固相氧氣緩慢釋放劑(ORC)，常用的ORC有CaO2、MgO2和Na2CO3，其中，CaO2在地下水中生物刺激修復(fù)中應(yīng)用較多，因?yàn)镃aO2釋放氧氣時(shí)間較長(zhǎng)，持續(xù)釋放時(shí)間一般介于6個(gè)月至1年以上[38]，可為地下水好氧微生物降解作用持續(xù)供氧。CaO2投放到地下水中發(fā)生如下反應(yīng)[39]：

CaO2+2H2O → H2O2+Ca(OH)2

(1)

2H2O2→2H2O+O2

(2)

H2O2+e-→ OH+OH-

(3)

地下水常用增氧方法見表2。

表2 地下水常用增氧方法

3 微生物在地下水污染修復(fù)中的應(yīng)用

地下水中常見污染物通?？蓜澐譃闊o機(jī)氮、有機(jī)物和金屬元素3大類，微生物對(duì)不同類型污染物的修復(fù)過程不同，其修復(fù)方法的選擇存在一定差異。

地下水無機(jī)氮污染范圍通常較大而不適合實(shí)施工程，當(dāng)前研究多處在自然衰減模擬階段，但針對(duì)污染嚴(yán)重的點(diǎn)源可酌情利用微生物進(jìn)行刺激修復(fù)。多數(shù)有機(jī)物本身可作為微生物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而被降解，最早利用微生物進(jìn)行地下水污染物自然衰減的便是有機(jī)物，而當(dāng)?shù)孜锊蛔銜r(shí)，則需人工調(diào)節(jié)以促進(jìn)有機(jī)物的快速降解。針對(duì)地下水中金屬元素，其不可被微生物利用性和自然衰減速率遠(yuǎn)小于遷移速率，基本無法單獨(dú)實(shí)現(xiàn)自然衰減修復(fù)，利用微生物進(jìn)行刺激修復(fù)成為降低水體金屬濃度研究的重點(diǎn)。

3.1 無機(jī)氮污染的微生物修復(fù)

3.2 有機(jī)物污染的微生物修復(fù)

部分有機(jī)物本身即是微生物必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，這為地下水有機(jī)污染的微生物修復(fù)提供可能。早在20世紀(jì)50年代，美國(guó)科學(xué)家ZOBELL[48]發(fā)現(xiàn)微生物對(duì)環(huán)烴、苯系物、脂肪烴、芳香烴等有機(jī)物具有一定降解作用。此后，歐美國(guó)家開始利用多種手段監(jiān)測(cè)微生物降解地下水中有機(jī)物。ANNESER等[16]140研究顯示，高度專一的降解菌不僅可自然降解地下水中的BTEX(苯系物)，同時(shí)能調(diào)控低濃度有機(jī)污染暈的邊界范圍。從定性識(shí)別到定量評(píng)估，是地下水有機(jī)物污染自然衰減修復(fù)研究的重要?dú)v程。CHOI等[49]針對(duì)韓國(guó)某軍械廠地下水BTEX和苯污染，利用電子受體貢獻(xiàn)率判別出不同的微生物作用降解污染物貢獻(xiàn)率，并實(shí)現(xiàn)定量計(jì)算BTEX和苯自然衰減速率及修復(fù)所需時(shí)間。而當(dāng)微生物自然降解有機(jī)物所需時(shí)長(zhǎng)不能達(dá)到修復(fù)要求時(shí)，便需要采取相應(yīng)的修復(fù)措施刺激土著微生物。微生物降解污染物受限往往是因?yàn)榈孜锊蛔銓?dǎo)致，LIEN等[50]研究發(fā)現(xiàn)燃油泄漏位置的地下水中石油發(fā)生微生物自然衰減同時(shí)，TCE的生物修復(fù)作用也被強(qiáng)化，原因是石油可作為微生物主要底物增強(qiáng)其代謝能力，從而加速了TCE的脫氯作用。因此，該場(chǎng)地可通過添加石油替代性底物以獲得地下水TCE持續(xù)脫氯效果。此外，隨著國(guó)內(nèi)外對(duì)地下水微污染研究的關(guān)注，越來越多的學(xué)者致力于綠色生態(tài)的修復(fù)方法來去除微污染，而自然衰減修復(fù)成為首要考慮的環(huán)保方法。ALDAS VARGAS等[27]2針對(duì)農(nóng)藥引起的地下水微污染，調(diào)查并提供了與地球化學(xué)參數(shù)相關(guān)的微生物菌群組成和分布信息，這些信息有助于認(rèn)識(shí)微生物對(duì)微污染自然衰減的過程和能力。

3.3 金屬污染的微生物修復(fù)

金屬元素并不像有機(jī)物一樣可被微生物直接利用，微生物通常通過氧化還原、甲基化去甲基化、生物礦化、分泌物絡(luò)合等方式降低地下水中有毒金屬毒性或固定有毒金屬[7]5。由于地下水中金屬元素濃度相對(duì)低的多，地下水中微生物對(duì)金屬污染的自然衰減能力往往較弱，而不適合利用微生物實(shí)施自然衰減修復(fù)。如何提高微生物活性來降低地下水中金屬元素的毒性成為當(dāng)前研究的重點(diǎn)。針對(duì)地下水較多出現(xiàn)的Cr(Ⅵ)污染，采用的原位生物修復(fù)技術(shù)通常包括生物還原法、生物吸附法和生物累計(jì)法，耐Cr微生物的大量發(fā)現(xiàn)使得生物還原法成為當(dāng)前研究的重點(diǎn)。陳國(guó)才[51]利用專門馴化的實(shí)驗(yàn)菌群進(jìn)行地下水Cr污染去除模擬，通過零價(jià)鐵和微生物協(xié)同作用達(dá)到去除目的，一方面零價(jià)鐵的強(qiáng)還原性能有效將Cr(Ⅵ)還原為Cr(Ⅲ)，同時(shí)零價(jià)鐵厭氧環(huán)境與H2O反應(yīng)產(chǎn)生的H2可刺激嗜氫微生物，進(jìn)一步還原Cr(Ⅵ)。FAYBISHENKO等[31]在美國(guó)華盛頓漢福德基地進(jìn)行了為期約3.5年的Cr污染地下水生物刺激修復(fù)工程，通過添加釋氫化合物(HRC)提高生物通量來影響電子受供體，最終顯著降低了地下水中溶解態(tài)的Cr(Ⅵ)。此后，ZHANG等[52]針對(duì)該污染場(chǎng)地，鑒定了在HRC刺激下與Cr(Ⅵ)還原相關(guān)的功能微生物和基因，這為設(shè)計(jì)Cr(Ⅵ)污染地下水的持續(xù)性生物刺激修復(fù)方案提供依據(jù)。

4 展 望

微生物修復(fù)是一種基于微生物自身代謝功能降解污染物的技術(shù)，通過利用和刺激土著微生物菌群，實(shí)現(xiàn)其對(duì)地下水中多種污染物的降解作用，達(dá)到地下水污染修復(fù)目的。針對(duì)地下水中無機(jī)氮、有機(jī)物和金屬元素3大類污染修復(fù)，往往需要考慮污染物種類、污染地下水體分布情況、污染程度、修復(fù)要求等因素，綜合判定微生物修復(fù)是否適用。同時(shí)，應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，從微生物群落多樣性、組成、功能基因、轉(zhuǎn)錄表達(dá)等方面揭示功能微生物菌群降解污染物過程，為制定地下水污染長(zhǎng)期的微生物修復(fù)方案提供依據(jù)。

微生物在地下水污染修復(fù)應(yīng)用研究中仍存在一些急需解決的關(guān)鍵問題：(1)充足的底物供應(yīng)是微生物降解的必要條件，如何保證在地下水弱電導(dǎo)環(huán)境中功能菌群具有足夠的底物和電子供體；(2)如何盡可能保證修復(fù)后地下水中不產(chǎn)生新的污染物，特別是添加劑、微生物通量和降解過程產(chǎn)生的二次產(chǎn)物；(3)目前我國(guó)多數(shù)研究處于室內(nèi)模擬，如何將微生物修復(fù)技術(shù)從實(shí)驗(yàn)階段大量轉(zhuǎn)化為實(shí)地修復(fù)，仍會(huì)面臨諸多問題；(4)由于地下水環(huán)境的復(fù)雜性，分子生物學(xué)技術(shù)在地下水污染修復(fù)中應(yīng)用并不多，這對(duì)揭示微生物群落結(jié)構(gòu)與功能對(duì)污染響應(yīng)關(guān)系和污染物降解機(jī)理不利，未來應(yīng)加強(qiáng)對(duì)此領(lǐng)域的深入研究。