王深壘，馬盼盼，江天珂，康文藝，郜曉峰*

1.河南大學(xué) 國家食用菌加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，河南 開封 475004

2.河南省藥食兩用資源功能研究國際聯(lián)合實驗室，河南 開封 475004

3.河南大學(xué) 藥學(xué)院，河南 開封 475004

微生物污染已成為影響食品安全和衛(wèi)生的重要因素，如大腸桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、沙門氏菌是食品污染中常見的3種致病菌，感染此類菌后，會導(dǎo)致中毒、腹瀉、胃腸炎、敗血癥等疾病[1-4]。大腸桿菌是重要的食源性致病菌之一，人類一旦感染它，就可能患上腸道疾病，并且會快速蔓延，造成重大食物性中毒事件發(fā)生[5-6]。單核細(xì)胞增生李斯特菌能在極端環(huán)境生存并且能忍受冷凍和干燥，人類食用受單核細(xì)胞增生李斯特菌感染的食物后可導(dǎo)致胃腸炎、腦膜炎等疾病[7-8]。在每年發(fā)生的細(xì)菌性食物中毒事件中，40%的細(xì)菌性食物中毒病由沙門氏菌引起[9]。沙門氏菌感染畜禽后，可通過各種途經(jīng)傳染給人，會引起食源性疾病[10-11]。然而國內(nèi)大部分食品安全研發(fā)多集中在農(nóng)獸藥殘留、非法添加物以及霉菌毒素等化學(xué)污染物的檢測，對于食源性病原微生物檢測尚未引起足夠重視[12]。

傳統(tǒng)的食品微生物檢驗包括菌落總數(shù)計數(shù)、大腸桿菌菌群計數(shù)、常見致病菌檢驗等流程，這些傳統(tǒng)方法技術(shù)成熟、準(zhǔn)確性高、所需設(shè)備簡單, 仍然是目前食品衛(wèi)生監(jiān)管機(jī)構(gòu)的主流檢測方法(GB 4789.2—2016)，然而實驗操作步驟煩瑣、耗時、靈敏度低，食品微生物的快速檢驗已成為控制食源性疾病的關(guān)鍵問題[13]。作者綜述了基于PCR技術(shù)的分子生物學(xué)檢測、分子分型方法、免疫學(xué)檢測方法等在食源性病原微生物檢測的應(yīng)用，為食品安全檢測提供參考。

1 傳統(tǒng)檢測方法

傳統(tǒng)的微生物學(xué)方法(培養(yǎng)基培養(yǎng)病原體)被認(rèn)為是病原菌檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法，實驗過程為增菌、培養(yǎng)、生化試驗、血清學(xué)凝集，最少要5 d時間才能檢測出結(jié)果[14]。然而食源性疾病暴發(fā)往往是快速、緊急的，傳統(tǒng)檢測方法需要操作者的主觀判斷，存在一定假陽性，因此，并不能滿足要求。用分子生物學(xué)檢測如PCR、實時熒光定量PCR等技術(shù)進(jìn)行快速檢測，從而對病原菌及時控制，減少其傳播，達(dá)到檢測目的。以敏感、特異、簡便、快速為特點的分子生物學(xué)技術(shù)引起了人們的廣泛關(guān)注，并逐步應(yīng)用于食源性病原微生物的檢測[15-17]。

2 分子生物學(xué)檢測

誕生于20世紀(jì)80年代的PCR技術(shù)，其微生物應(yīng)用已從最初的的定性分析(確定微生物種類)發(fā)展到現(xiàn)在的定量分析(確定微生物個數(shù))，常規(guī)PCR技術(shù)、定量PCR技術(shù)、基因芯片技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于微生物鑒定分子生物學(xué)檢測、分子分型等，檢測方法如表1所示。

表1 分子生物學(xué)檢測方法的比較

2.1 常規(guī)PCR技術(shù)

多重PCR檢測食源性致病菌分子就是選擇兩對或兩對以上的引物，加入同一個PCR反應(yīng)體系，可以同時擴(kuò)增出多個核酸片段，可以利用多重PCR在食品或環(huán)境中檢測多種致病菌[18]。張德福等[19]建立了一種以16S RNA基因為擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)對照、inlA基因為靶基因的單增李斯特菌PCR檢測方法，靈敏度實驗表明，基因組DNA和純培養(yǎng)物的最低檢出限分別為1.80×102fg/μL和1.21×102CFU/mL。Sangdee等[20]設(shè)計的特征引物ERIC 1和ERIC 2可以將大腸桿菌與其他菌株區(qū)分開，基因組DNA和純培養(yǎng)物最低檢測限為50 pg和100 CFU/mL。Son等[21]開發(fā)了以志賀毒素大腸桿菌的毒力基因stx1、stx2、 eaeA、hlyA為研究對象的多重PCR檢測方法，該法耗時75 min，可高效、靈敏地區(qū)分潛在的有害O157∶ H7和非O157志賀毒素產(chǎn)生的大腸桿菌。

2.2 定量PCR技術(shù)

定量PCR技術(shù)可以分為實時熒光定量PCR法和數(shù)字PCR法。實時熒光定量PCR法是設(shè)計特異性引物，并且?guī)в袩晒饣蛘叻派湫阅芘cPCR產(chǎn)物結(jié)合，每循環(huán)一次熒光量實時定量增加一次，從而達(dá)到對其實時定量監(jiān)測。數(shù)字PCR法是先將樣品稀釋成單分子，然后在微小反應(yīng)器中進(jìn)單分子模板PCR擴(kuò)增，檢測陽性反應(yīng)單元數(shù)目，再根據(jù)泊松分布計算出樣本中的DNA分子數(shù)[22]。針對常見的食源性病原體，如單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、大腸桿菌O157∶ H7、沙門氏菌等均已開發(fā)數(shù)字PCR方法[23-24]。馮育芳等[25]建立了一種對沙門氏菌多重?zé)晒舛康腜CR檢測方法，靈敏度為1×103ng/μL; 特異性檢測未從其他參考菌株中檢出陽性，該方法設(shè)計探針及對其毒力基因的分析更加準(zhǔn)確，可以實現(xiàn)定量檢測。Victoria等[26]針對產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌毒力基因Stx1和Stx2設(shè)計特異性引物、探針，用實時熒光定量PCR檢測35份牛肉樣品，分離到11株志賀產(chǎn)毒大腸桿菌。邱亞群等[27]用改良的熒光定量PCR技術(shù)檢測沙門菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、大腸桿菌O157∶ H74，DNA和細(xì)菌純培養(yǎng)的最低檢測限達(dá)到1～100 fg/PCR和1～6.25 CFU/PCR，特異性均達(dá)98%以上，實驗數(shù)據(jù)更可靠、準(zhǔn)確。另外,用實時熒光定量PCR方法對單增李斯特菌[28]進(jìn)行檢測也成為主要研究方法。

2.3 基因芯片技術(shù)

基因芯片又叫生物芯片，其原理在一塊基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探針，待測溶液中帶有熒光標(biāo)記的核酸序列可以與基因芯片上對應(yīng)位置的核酸探針產(chǎn)生互補(bǔ)匹配，據(jù)此可重組出靶核酸的序列，從而判斷樣品是否有致病菌，也可以得出樣品中致病菌的個數(shù)?；蛐酒夹g(shù)可以同時檢測多個不同的靶基因，具有通量高、靈敏度高、特異性好等特點。李慧芳[29]建立了以invA 基因為靶標(biāo)的快速檢測雞肉中沙門氏菌的方法，最低檢測限為64.7 CFU/mL，總檢測時間不超過9 h。袁慕云等[30]設(shè)計了腸道沙門氏菌ace A基因和腸炎沙門氏菌基因SEP的引物和探針，并在ace A探針5′端標(biāo)記FAM(熒光基團(tuán))，SEP探針的5′端標(biāo)記VIC(熒光基團(tuán))，該方法最低檢測濃度分別達(dá)到280 CFU/mL和260 CFU/mL。王小強(qiáng)等[31]將聚合酶鏈?zhǔn)郊夹g(shù)與基因芯片雜交技術(shù)結(jié)合鑒定不同的食源性致病菌，其中完成了對沙門氏菌特異性高、靈敏度達(dá)110 CFU/mL的檢測。崔明全[32]用基因芯片雜交技術(shù)與PCR擴(kuò)增技術(shù)的結(jié)合，利用該鑒定系統(tǒng)對食源性致病菌鑒定，從而達(dá)到檢測目的。

3 分子分型方法

新的分子生物學(xué)技術(shù)方法不斷應(yīng)用于食品微生物的檢測，為微生物的致病性、流行性、變異性以及耐藥性分析等方面提供重要的信息。目前常用分子分型方法有脈沖場凝膠電泳、多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)基因分型等技術(shù)，其應(yīng)用特點如表2所示。

3.1 脈沖場凝膠電泳

脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)常用來分離大小從10 kb到10 Mb的大分子量DNA分子，廣泛應(yīng)用在微生物分子分型、細(xì)胞凋亡和轉(zhuǎn)基因技術(shù)等研究[33]。阮韋偉等[34]應(yīng)用PFGE技術(shù)成功對2016年莆田市某區(qū)一起細(xì)菌性食物中毒事件進(jìn)行致病菌分離鑒定和溯源分析，結(jié)果表明：該起食物中毒事件是由攜帶腸炎沙門菌的廚師進(jìn)行冷盤制作和水果拼盤過程中污染食物所引起。童銳等[35]分析了2015—2017年閔行區(qū)腹瀉病監(jiān)測點鼠傷寒沙門菌的病原學(xué)及PFGE特征，結(jié)果表明：鼠傷寒沙門菌擴(kuò)散的主要來源是經(jīng)過多種抗生素共同作用篩選得到的菌株。

3.2 多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析

多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(multiple locus variable-number tandem repeat analysis, MLVA)是利用基因組上多個可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列位點(VNTR)來設(shè)計引物，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增重復(fù)序列，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小和VNTR拷貝數(shù)對菌株進(jìn)行聚類分析，最終達(dá)到菌株分型的目的[36]。王磊等[37]用篩選的可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列位點，對DEC菌株進(jìn)行MLVA分型。MLVA具有快速、簡便、通量高的特點,在疾病監(jiān)測、疾病暴發(fā)調(diào)查中將會發(fā)揮重要的應(yīng)用價值。

表2 分子分型方法的比較

3.3 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)基因分型

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)基因分型(random amplified polymorphic DNA，RAPD)以基因組DNA為模板，選擇合適退火溫度，在熱穩(wěn)定的聚合酶作用下，選擇隨機(jī)引物在非特異性識別細(xì)菌DNA上相應(yīng)的結(jié)合位點進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳后獲得基因組指紋圖譜，可反映基因組多態(tài)性[38]。仝慧嫻等[39]采用PFGE和RAPD方法來解析上述菌株的親緣關(guān)系，結(jié)果顯示我國不同地域豬養(yǎng)殖場中的mcr-1宿主菌主要為大腸桿菌，并且其分子分型呈現(xiàn)多樣性特征。

3.4 擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分子分型

擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分子分型(amplified restriction fragment polymorphism，AFLP)是對提取基因組DNA酶切，得到不同的DNA片段，用它作為模板，在PCR反應(yīng)體系選擇特異性引物，擴(kuò)增得到不同長度目的片段，從而反映檢測的多態(tài)性，達(dá)到分子分型的目的[40]。Spindola等[41]通過AFLP顯示大腸桿菌 sfa+血清群O6之間的克隆關(guān)系，發(fā)現(xiàn)來自同一片段的菌株在不同AFLP中不只是一種基因型。理論上講，AFLP不但可以為菌種間鑒定提供依據(jù)，還可以對溯源提供一定的參考，但該分型方法對操作人員的操作及樣品DNA質(zhì)量要求較高[42]。

4 免疫學(xué)檢測

免疫學(xué)檢測技術(shù)是利用抗體或抗原特異性結(jié)合，檢測相應(yīng)的標(biāo)記信號，從而對食源性病原微生物進(jìn)行檢測，可應(yīng)用于疾病的診斷、治療，其特點是方便、快速，常用免疫學(xué)技術(shù)比較如表3所示。

表3 免疫學(xué)檢測方法的比較

4.1 酶聯(lián)免疫法

酶聯(lián)免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)的原理是抗原或抗體吸附在固相載體表面并在其表面發(fā)生反應(yīng)。伍燕華等[43]以抗沙門氏菌多克隆抗體作為捕獲抗體, 以抗沙門氏菌單克隆抗體C1359作為檢測抗體，建立了快速檢測沙門氏菌雙抗夾心ELISA方法，此法對沙門氏菌純培養(yǎng)液的最低檢測量為1×104CFU/mL, 與其他雜菌不存在交叉反應(yīng), 具有較好的靈敏性和特異性。

4.2 免疫磁性分離法

免疫磁性分離法其實是將抗原、抗體和磁珠免疫復(fù)合，從而利用磁珠的磁場引力作用將目標(biāo)微生物分離、培養(yǎng)鑒定[44]。杜強(qiáng)等[45]通過免疫磁珠分選系統(tǒng)和GB 4789.4—2010《食品微生物學(xué)檢驗沙門菌檢驗》進(jìn)行沙門氏菌對比檢測，結(jié)果表明陽性檢出率二者無顯著性差異，磁珠法取消了二次增菌的步驟，檢測時間比國標(biāo)法節(jié)省24 h，且平板上的單個菌落生長率和菌株特異性也更好。

4.3 免疫磁珠結(jié)合PCR技術(shù)

免疫磁珠結(jié)合PCR技術(shù)是利用免疫磁珠將致病菌富集，再與PCR 技術(shù)定性或定量的優(yōu)點相結(jié)合，從而可以快速高效、特異、準(zhǔn)確地對食源性致病菌進(jìn)行檢測[46]。胡霏[47]通過磁珠XMag-COOH，經(jīng)EDC和NHSS 活化，得抗鼠傷寒沙門氏菌免疫磁珠，熒光免疫層析檢測結(jié)果表明靈敏度達(dá)105CFU/mL，回收率在38%以上，極大地提高了檢測效率。韓笑[48]使用李斯特菌屬特異性引物和單增李斯特菌特異性引物，以免疫磁珠捕獲的菌體為模板，建立了免疫磁珠與雙重PCR聯(lián)用的單增李斯特菌檢測方法，對純培養(yǎng)的單增李斯特菌靈敏度可達(dá)106CFU/mL。

5 展望

食品安全已成為我國公共衛(wèi)生問題，食源性致病菌的監(jiān)測及預(yù)防控制食源性疾病的發(fā)生已經(jīng)成為人們關(guān)注的熱點，傳統(tǒng)檢測食源性細(xì)菌方法因耗時長，不能滿足快速檢測需求，因此，開發(fā)高效、靈敏、安全、可靠的微生物檢測技術(shù)已經(jīng)成為人們研究目標(biāo)。快速、靈敏的分子生物學(xué)技術(shù)已在醫(yī)學(xué)、環(huán)境檢測等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，然而在食品微生物的快速檢驗應(yīng)用還是有限，研究者應(yīng)積極開發(fā)可在食品微生物污染檢測應(yīng)用的分子生物學(xué)技術(shù)，為食品安全生產(chǎn)提供更多的檢測技術(shù)手段。