劉延波，唐艷彥，趙志軍，侯文靜，孫西玉,2，潘春梅

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院食品與生物工程學(xué)院(酒業(yè)學(xué)院)，河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院河南省白酒風(fēng)格工程技術(shù)研究中心，河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院鄭州市白酒釀造微生物技術(shù)重點實驗室，河南 鄭州 450046；2.張弓老酒酒業(yè)有限公司，河南 寧陵 476733)

中國白酒時代久遠，工藝精湛，口味醇厚，是中國特有的一種蒸餾酒[1-2]，濃香型白酒占全國的白酒產(chǎn)量的大多數(shù).酒曲在白酒釀造過程中發(fā)揮著重要的作用[3]，其具有糖化、酒化、發(fā)酵、生香的功能[4]，為白酒提供內(nèi)在動力，有“大曲是酒之骨”說法，即其品質(zhì)的優(yōu)劣往往對白酒的出酒率以及酒質(zhì)都有極大的影響[5-6].

大曲是以生料小麥為主要原料再經(jīng)固態(tài)法發(fā)酵制作的發(fā)酵劑[7-8].在制曲過程和發(fā)酵培菌管理中包羅了自然環(huán)境中的大量微生物，使酒曲成品中含有豐富的釀酒微生物菌系和酶系[9-10].目前已知的在濃香型白酒釀造環(huán)節(jié)中產(chǎn)酯化酶的菌株為霉菌、酵母菌和細菌，其中霉菌以紅曲霉、根霉和毛霉等為主，酵母菌主要是生香酵母為主，而在細菌中很少出現(xiàn)代表性菌株[11-13].這其中的一些微生物在特殊環(huán)境下進行生長繁殖及代謝，各種代謝物在酶的作用下發(fā)生酯化反應(yīng)而生成白酒的酯類和香氣物質(zhì)[14].

白酒中酯類物質(zhì)眾多并且在生香過程中起著重要的作用，酯化酶是一種將酸和醇催化成酯的酶類[15]，不同微生物產(chǎn)生酯化酶的酶學(xué)性質(zhì)、酶量的多少和酶活的高低都與白酒的優(yōu)質(zhì)品率密切相關(guān)[16].由于酯化酶本身結(jié)構(gòu)的復(fù)雜多樣，進而造成其研究遠遠不如淀粉酶、蛋白酶[17].前人對釀酒大曲中高產(chǎn)酯化酶菌株的篩選鑒定研究有較多報道，但大部分菌株以生香酵母、霉菌為主[15]，關(guān)于細菌中產(chǎn)酯化酶研究較少[18].因此本試驗通過從張弓老酒大曲分離鑒定高產(chǎn)酯化酶細菌并研究其生理生化和產(chǎn)酶條件，為后續(xù)提高大曲酯化力提供菌種，有效控制制曲工藝與酒曲質(zhì)量，以期對提升白酒大曲品質(zhì)和白酒的優(yōu)質(zhì)品率提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 濃香型大曲：由張弓老酒酒業(yè)有限公司提供.

1.1.2 主要試劑 三丁酸甘油酯：上海麥克林生化科技有限公司；聚乙烯醇：可樂麗株式會社；氯化鈉：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；牛肉膏、蛋白胨：北京澳博星生物技術(shù)有限公司；柱式細菌基因組 DNA抽提試劑盒：天根生化科技有限公司.

1.1.3 培養(yǎng)基 篩選培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨5，瓊脂25.乳化液：將3%的聚乙烯醇溶液和三丁酸甘油酯按體積比9∶1攪拌混合.將培養(yǎng)基與乳化液按體積比4∶1混合，自然pH.

種子液培養(yǎng)基細菌(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5，自然pH.

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5，自然pH.

1.2 儀器

振蕩培養(yǎng)箱：上海知楚儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療機械廠；恒溫水浴鍋：常州方科儀器有限公司；超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司等.

1.3 方法

1.3.1 菌種初篩 從大曲不同層次取樣并研細成粉，稱取25 g于225 mL裝有玻璃珠的無菌水中，浸泡30 min然后取上清液用無菌水配制成菌懸液，后進行梯度稀釋.選取合適的梯度均勻涂布于平板篩選培養(yǎng)基上，每個稀釋度做3個平行樣.將接種好的平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 ～4 d觀察在菌落周圍出現(xiàn)的透明圈[19]，并測量透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)之比.選擇其比值大的菌落進行純化，于篩選平板上劃線分離至純種，將篩選得到的菌株編號并保藏于20%的甘油管中，置于-20 ℃冰箱中保存[23].

1.3.2 菌種復(fù)篩 將初篩獲得的D/d比值較大的菌株在篩選平板上活化后，接種于10 mL液體種子培養(yǎng)基中，于37℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)48 h.所得發(fā)酵液在4℃、10 000 r/min條件下離心10 min，去沉淀，取上清液即為粗酶液，4℃保存[20].進行酯化酶活力測定：取4 mL乳化液(取90 mL聚乙烯醇溶液加入10 mL三丁酸甘油酯，充分搖勻配成100 mL的乳化液)和5 mL的磷酸緩沖液(0.025 mol/L，pH 7.5)于錐形瓶中，放入40 ℃水浴鍋中，預(yù)熱5～10 min，加入1 mL粗酶液，同時計時；反應(yīng)15 min，加入15 mL 95%乙醇，滴2～3滴酚酞指示劑，并用0.05 mol/L NaOH溶液滴定.不加酶液的為對照[21-22].

酶活力計算公式：

式中：V1為消耗的NaOH溶液體積；V2為空白對照；n為稀釋倍數(shù)；t為反應(yīng)時間.

1.3.3 形態(tài)鑒定 用顯微鏡觀察菌落的生長、顏色、表面形態(tài)、質(zhì)地、邊緣形狀等；對其進行革蘭氏染色，個體形態(tài)特征.

1.3.4 16S rDNA分子測定 將復(fù)篩獲得酶活性最高的菌株于液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，利用柱式細菌基因組 DNA抽提試劑盒提取復(fù)篩得到的高產(chǎn)菌株的基因組DNA，并以獲得的DNA為模板，用細菌16 S rDNA通用引物27F(5＇-AGAGTTTGATAGAGTTTGATC-3＇)/1492R(5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇)為上/下游引物進行 PCR擴增.PCR擴增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃下保存.PCR擴增反應(yīng)體系(50 μL)：Mix25 μL，DNA樣品1 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，蒸餾水20 μL.

應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結(jié)果，然后送上海生工生物工程有限公司測序.序列結(jié)果用NCBI在線工具Blast在GeneBank內(nèi)與標準菌株比對，找出與克隆子序列同源性最高的序列，根據(jù)其同源性構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并明確其分類地位.DNAMAN軟件對齊序列，利用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[23-25].

1.3.5 生理生化鑒定 將目標菌株進行生理生化試驗并與細菌手冊對比[26-27].

1.3.6 單因素試驗對產(chǎn)酯酶活的影響

1)最適碳源及最適添加量的確定 分別以1 g/mL的淀粉、葡萄糖、蔗糖、玉米粉和酒糟粉為碳源(各做3個平行)，代替發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源，其余成分不變，每100 mL搖瓶裝10 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基，接種菌液1.5 mL，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后測定酶活力，優(yōu)選出最適碳源.然后再以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g的最適碳源與普通液體培養(yǎng)基產(chǎn)酶酶活進行對比試驗，以確定最佳碳源的最適添加量[28].

2)最適氮源及最適添加量的確定 分別以0.3 g/mL硫酸銨、牛肉膏、蛋白胨、豆粕粉、酵母膏為氮源(各做3個平行)，代替發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源，其余成分不變，每100 mL搖瓶裝 10 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基，接種菌液1.5 mL，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后測定酶活力，優(yōu)選出最適氮源.然后以0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g的最適氮源與普通液體培養(yǎng)基產(chǎn)酶酶活進行對比試驗，確定最佳氮源的最適添加量[28].

3)最適pH值的確定 分別以不同發(fā)酵初始pH值(3、4、5、6、7、8)，每100 mL搖瓶裝10 mL液體篩選培養(yǎng)基，接種菌液1.5 mL ，37 ℃、150 r/min水浴振蕩培養(yǎng)48 h后測定酶活力與普通液體培養(yǎng)基產(chǎn)酶酶活進行對比試驗，確定最適pH值[29].

1.3.7 響應(yīng)面試驗 通過Design-Expert 8.0.6軟件進行Box-Benhnken響應(yīng)面設(shè)計，選擇對酶活影響較大的三因素三水平，進行響應(yīng)面試驗以此得到產(chǎn)酶的最適條件[30].

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用Excel 2013進行作圖，Design-Expert 8.0.6進行顯著性差異分析與回歸方程擬合.

2 結(jié)果與分析

2.1 酯化酶菌株初篩

將大曲不同區(qū)域內(nèi)取樣進行稀釋涂布后，37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48 h，得到200株具有水解圈的菌株，后進行透明圈直徑(D)和菌株直徑(d)測量，并進行D/d值進行比較，得出比值較大的15株.初篩結(jié)果見表1.從表1可得菌株T-15的D/d值最大為3.75，菌株T-76、T-87的D/d值較大，T-92的D/d值最小為1.77，進而對D/d值較大的前10株菌株進行復(fù)篩.

表1 產(chǎn)酯化酶菌株的初篩

2.2 酯化酶菌株復(fù)篩

通過酸堿滴定法對這些D/d比值較大的菌株進行產(chǎn)酶條件測試，酶活測定結(jié)果見表2.

從表2里可以看出T-15菌株產(chǎn)酯化酶酶活最高，達到41.67 U/mL明顯優(yōu)于其它菌株，選擇T-15菌株進行后續(xù)試驗.

2.3 菌落形態(tài)

通過顯微鏡觀察，其菌落顏色呈白色，邊緣整齊，粘稠光滑，菌體為圓球狀，鑒定結(jié)果為革蘭氏陽性菌.其菌落圖片見圖1.

表2 產(chǎn)酯化酶菌株的復(fù)篩

2.4 菌株T-15的分子生物學(xué)鑒定

將提取的菌株T-15的基因組DNA進行PCR擴增，PCR擴增結(jié)果如圖2所示.由圖可知所擴增得到的片段的電泳條帶亮度大，無拖尾，分子量大小在1 500 bp左右，與目的片段大小一致.進而將PCR擴增產(chǎn)物進行測序，將測得的菌株T-15的16S rDNA基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫內(nèi)其他菌株的16S rDNA基因序列應(yīng)用Blast軟件進行對比，發(fā)現(xiàn)該菌株與與公布的EIV-7(登錄號：FJ613565.1)同源性達到97%，因此初步鑒定為葡萄球菌屬.應(yīng)用MEGA 6.0軟件構(gòu)建NJ(Neighbor -joining)系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株T-15的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3.

圖1 T-15菌株的菌落形態(tài)Figure 1 Colony morphology of T-15

圖2 PCR凝膠電泳結(jié)果Figure 2 Results of gel electrophoresis PCR

2.5 生理鑒定

通過試驗確定此菌株能分解葡萄糖、麥芽糖和蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)生氣以及產(chǎn)生色素為白色.并且與細菌手冊對比后鑒定為.結(jié)合生理生化試驗結(jié)果和16S rDNA分子鑒定，可確定菌株T-15為表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis).

2.6 產(chǎn)酶條件單因素優(yōu)化

2.6.1 pH對產(chǎn)酯化酶活力的影響 將菌液接入不同的pH的液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，測定酶活力.不同pH液體培養(yǎng)基對產(chǎn)酯化酶的影響如圖4所示.由圖4結(jié)果可知T-15菌株在pH為3到4范圍內(nèi)的酶活力呈上升趨勢，直到pH為4，酶活力達到最大，為33.73 U/mL，隨后酶活力隨著pH的增長而呈下降趨勢.

圖3 菌株T-15系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 3 Strain T-15 phylogenetic tree

圖4 不同pH值對菌株產(chǎn)酯化酶能力的影響Figure 4 The effect of different pH values on the strain's ability to produce esterase

2.6.2 碳源的選擇及所選碳源最適添加量的確定 將菌液接入不同的碳源的液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，測定酶活力，結(jié)果如圖5所示.將菌液接入最優(yōu)碳源不同添加量的液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，測定酶活力，其結(jié)果如圖6所示.

由圖5可知T-15菌株培養(yǎng)基最佳碳源為玉米粉，其酶活最大為58.47 U/mL；淀粉為碳源時測得酶活最低為33.12 U/mL.由圖6可得玉米粉添加量從0.5到2.0 g范圍內(nèi)的酶活力呈上升趨勢達到酶活力達到最大，為26.12 U/mL，隨后酶活力下降.

2.6.3 氮源的選擇所選氮源最適添加量的確定 將菌液接入不同的氮源的液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，測定酶活力，結(jié)果如圖7所示.將菌液接入最優(yōu)氮源不同添加量的液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，測定酶活力，其結(jié)果如圖8所示.

圖5 不同碳源對菌株產(chǎn)酯化酶能力的影響Figure 5 The effect of different carbon sources on the strain's ability to produce esterase

圖6 碳源最適添加量的確定Figure 6 Determination of the optimal amount of carbon source

圖7 不同氮源對菌株產(chǎn)酯化酶能力的影響Figure 7 Effect of different nitrogen sources on the ability of strains to produce esterase

由圖7可知，T-15菌株培養(yǎng)基最佳氮源為酵母粉，其酶活最大為86.84 U/mL，其次為牛肉膏81.56 U/mL，豆粕粉作為氮源時酶活最低.在圖8中可得在酵母粉添加量從0.2到0.5范圍內(nèi)的酶活力呈上升趨勢達到酶活力達到最大，為35.56 U/mL，隨后酶活力下降.

圖8 氮源最適添加量的確定Figure 8 Determination of the optimal amount of nitrogen source

2.7 T-15菌株的發(fā)酵條件的響應(yīng)面優(yōu)化

2.7.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果 根據(jù)單因素試驗對菌株T-15的影響，選取各因素中最適水平及左右水平，采用三因素三水平法A- pH、B-玉米粉、C-酵母粉，利用Design-Expert 8.0.6軟件進行Box-Benhnken響應(yīng)面設(shè)計.響應(yīng)面試驗的設(shè)計與結(jié)果，如表3所示.

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

2.7.2 回歸模型的建立及其顯著性檢驗 通過Design-Expert 8.0.6軟件對表3的結(jié)果進行二次多元回歸擬合，建立二次響應(yīng)面回歸模型為：酶活=79.27-2.61×A-0.34×B-6.54×C-1.42×A×B+6.64×A×C+6.83×B×C-27.45×A2-23.86×B2-21.49×C2回歸系數(shù)顯著性分析和模型的方差分析，如表4所示.由表4可知，該模型P<0.001，失擬項P=2.14>0.05可知該模型回歸顯著，失擬項不顯著，不需要引入更高次項系數(shù).模型的校正復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.991 7，說明各個因素對響應(yīng)值的線性關(guān)系是顯著的，擬合良好，所以該模型能模擬該試驗的理論預(yù)測.校正復(fù)項關(guān)系數(shù)AdjR2=0.981，Adeq Precision=23.404，說明該模型在設(shè)計區(qū)間內(nèi)誤差小，可信度較高.

表4 回歸系數(shù)顯著性分析和模型的方差分析

2.7.3 各因素交互作用的響應(yīng)面圖 響應(yīng)面曲面可較直觀地反映各因素及兩兩因素的交互作用對響應(yīng)值的影響.酶活的等高線圖與響應(yīng)面三維圖譜見圖9～11.酵母粉對酶活的影響最大，其次是pH，玉米粉對酶活的影響最小.酵母粉與pH的交互影響較大，其次是酵母粉和玉米粉的交互作用，pH與玉米粉的交互影響最不明顯.

2.7.4 最佳發(fā)酵條件的確定 根據(jù)分析所得結(jié)果即為最大酶活力時菌株T-15所需最佳發(fā)酵條件，A=3.93、B=1.99、C=0.48在此條件下理論預(yù)測最大酶活為79.911 6 U/mL，結(jié)合試驗操作過程和便捷性，因此，最佳發(fā)酵條件為：pH=4、玉米粉2 g、酵母粉0.5 g.驗證試驗結(jié)果：酶活為83.33 U/mL，相對誤差為4.10%.

圖9 pH(A)和玉米粉(B)對酯化酶酶活力影響的等高線圖Figure 9 Contour map of the effect of pH (A) and corn flour (B) on esterase activity

圖10 pH(A)和酵母粉(C)對酯化酶酶活力影響的等高線圖Figure 10 Contour map of the effect of pH (A) and yeast powder (C) on esterase activity

圖11 玉米粉(B)和酵母(C)對酯化酶酶活力影響的等高線圖Figure 11 Contour map of the effects of corn flour (B) and yeast (C) on esterase activity

3 討論

根據(jù)黃丹等[28]報道，從濃香型大曲中分離得到 1株產(chǎn)酯化酶細菌,為血紅鞘氨醇單胞菌，對該菌株產(chǎn)酯化酶的培養(yǎng)條件進行研究酶活可達18.26 U/mL；劉新宇等[31]從汾酒生產(chǎn)環(huán)境分離到2株紅曲霉，并在固態(tài)發(fā)酵條件下測得較高酯化酶酶活2.46 U；張秀紅等[32]從汾酒大曲中篩選出1株產(chǎn)酯化酶較高的菌株結(jié)果為葡萄球菌，酶活力可達33.33 U/mL；劉歡歡等[33]從實驗室菌種保藏中心篩選獲得1株高產(chǎn)酯化酶菌株X1，并被鑒定為血紅紅曲霉(Monascussanguineus)，在最適產(chǎn)酶條件下，酯化酶活力為315.19 U/mL.與前人相比，本研究從張弓老酒大曲分離鑒定的酯化酶菌株產(chǎn)酶能力處于中上水平，可將其應(yīng)用到制造高酯化大曲，高酯化大曲的添加能減少用曲量，提高濃香型白酒原酒產(chǎn)量和質(zhì)量[34].

此外關(guān)于表皮葡萄球菌也在其它香型大曲中廣泛報道如：劉效毅等[35]從醬香型高溫大曲分離出的菌株中存在表皮葡萄球菌；周森等[36]應(yīng)用高通量測序技術(shù)解析清香型大曲微生物多樣性，其中葡萄球菌較為豐富，可見此菌株在白酒釀造過程中發(fā)揮重要作用.此外響應(yīng)面優(yōu)化法通過對回歸方程的擬合度以及響應(yīng)面工藝回歸模型的建立，可方便地求出相應(yīng)于各因素水平的響應(yīng)值[37-38]，經(jīng)過響應(yīng)面優(yōu)化的酶活遠大于初始酶活，表明應(yīng)用響應(yīng)面法可以對微生物產(chǎn)酶條件進行顯著優(yōu)化.

4 結(jié)論

通過涂布稀釋和平板劃線的方法從張弓老酒大曲中篩選出200株產(chǎn)酯化酶的菌株，采用酯化酶透明圈法初篩和滴定法測酶活的方法，篩選出1株高產(chǎn)酯化酶菌株T-15，測其酶活力為41.67 U/mL.對此菌株進行形態(tài)學(xué)，16S rDNA分子生物學(xué)和生理生化試驗，確定該菌為表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidisstrain).進而對菌株T-15進行液體培養(yǎng)基條件優(yōu)化，氮源、碳源和pH這3個單因素試驗，結(jié)果為氮源最優(yōu)為酵母粉并且最適量是0.5 g，碳源最優(yōu)為玉米粉并且最適量為2 g，pH為4.根據(jù)單因素的菌株的影響，采用響應(yīng)面試驗設(shè)計法，以氮源、碳源最適量和pH為自變量，以酯化酶活力為響應(yīng)值，對其進行響應(yīng)面的優(yōu)化.確定最佳發(fā)酵條件為：pH=4、玉米粉2 g、酵母粉0.5 g，優(yōu)化后，其酶活力高達83.33 U/mL，比之前高50.24%.