李梓泳，馬憬希，趙明，陳龍，周紅軍，周新華

（仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，廣東省普通高校農(nóng)用綠色精細(xì)化學(xué)品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510225）

農(nóng)藥在使用過(guò)程中，噴霧漂移、葉面流失、蒸發(fā)、紫外線降解等都會(huì)造成農(nóng)藥的利用率低下；雨水的沖刷、氣凝膠的流動(dòng)等可能會(huì)使農(nóng)藥通過(guò)生物鏈給人類(lèi)的健康帶來(lái)不利的影響；因此提高農(nóng)藥利用率、減少農(nóng)藥流失已成為農(nóng)藥發(fā)展的主流方向。制備控釋農(nóng)藥是滿足上述條件的有效方法，而控釋農(nóng)藥種類(lèi)繁多，如微膠囊包裹、介孔吸附、凝膠負(fù)載等[1]。Zhang等[2]利用聚酯和聚乙二醇開(kāi)發(fā)了一種溫度響應(yīng)型混合膠束來(lái)控制除蟲(chóng)菊酯的釋放，提高了除蟲(chóng)菊酯的光穩(wěn)定性，增長(zhǎng)了活性成分的存活時(shí)間，比商業(yè)配方有更好的利用效率。Liang等[3]利用可降解淀粉修飾二硫鍵功能化介孔硅，制備了具有氧化還原響應(yīng)和酶響應(yīng)的納米粒子，有效防止阿維菌素的光降解，阻止其過(guò)早泄露。此外，納米粒子對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)具有良好的殺蟲(chóng)活性，實(shí)現(xiàn)了農(nóng)藥的靶向釋放。顏慧瓊[4]利用海藻酸鈉衍生物、膨潤(rùn)土和殼聚糖制備負(fù)載啶蟲(chóng)脒的凝膠，在水溶液中有好的穩(wěn)定性能和緩釋性能。

在提高農(nóng)藥效率的同時(shí)，也應(yīng)該重視控釋農(nóng)藥的載體性質(zhì)。天然高分子載體具有制備簡(jiǎn)單、來(lái)源廣泛、可降解、生物相容性好等優(yōu)勢(shì)。羧甲基纖維素（CMC）是一種天然的陰離子水溶性多糖，是纖維素的衍生物，具有黏著、增稠、流動(dòng)、乳化性，應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、日化等行業(yè)。其中，已經(jīng)有很多關(guān)于CMC在緩釋農(nóng)藥應(yīng)用方面的報(bào)道。Hao等[5]用疏水改性的CMC通過(guò)靜電作用包封磷酸化玉米醇溶蛋白，負(fù)載阿維菌素（AVM）后的平均粒徑為360nm，封裝效率提高了82.11%，對(duì)葉片的黏附性能也提高了約20%，在有效防止紫外光降解的同時(shí)還保持與原藥無(wú)明顯差異的毒力效果。Sarkar等[6]用CMC和檸檬酸與膨潤(rùn)土制備的pH響應(yīng)農(nóng)藥載體，讓觸發(fā)殺蟲(chóng)劑精準(zhǔn)地在堿性內(nèi)臟釋放。但親水性強(qiáng)的CMC單獨(dú)作為載體負(fù)載農(nóng)藥時(shí)負(fù)載率低。陳龍等[7]將甲基丙烯酸甲酯接枝到CMC上制備的微膠囊提高了AVM在葉片上的親和性。大豆分離蛋白（SP）是一種豐富的原料，在釋放系統(tǒng)中可促進(jìn)蛋白質(zhì)與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的相互作用[8]。Di Giorgio等[9]使用乳化法將魚(yú)油包封在SP中，包封率達(dá)88%，但該工藝需要使用大量的乳化劑，還需要昂貴的噴霧干燥機(jī)將所需產(chǎn)品分離。

本文以CMC和SP為原料，制備負(fù)載AVM的緩釋體系。利用紅外光譜（FTIR）、掃描電鏡（SEM）和熱重（TGA）等對(duì)CMC-SP@AVM穩(wěn)定性和微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，并對(duì)其包封效率、抗紫外線性能和毒理性能進(jìn)行研究。此外，在不同pH和配比下，探究CMC-SP@AVM釋放AVM的機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基二碳亞胺鹽酸鹽（EDC），N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），以上材料均為上海阿拉丁生化科技股份有限公司的分析純級(jí)產(chǎn)品；羧甲基纖維素（CMC，300～800mPa·s），上海阿拉丁試劑公司提供；大豆分離蛋白（SP）由安陽(yáng)天力食品有限公司提供的大豆脫脂蛋白粉提取[10]；阿維菌素（AVM，工業(yè)級(jí)，純度為95%），河北威遠(yuǎn)生物化工有限公司提供；溴化鉀（分析純），廣州化學(xué)試劑廠；無(wú)水乙醇（分析純），天津大茂化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，T6型，北京新世紀(jì)有限公司；差示掃描量熱儀，Q200型，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；傅里葉變換紅外光譜儀，Spectrum100型，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；熱重分析儀，TGA2型，瑞士梅特勒-托利多公司；激光粒度儀，90Puls型，英國(guó)馬爾文儀器有限公司。

1.3 羧甲基纖維素-大豆分離蛋白（CMC-SP）的制備

稱取3.0g SP于100mL去離子水中，然后依次滴入0.5g APTES、2.5g EDC和5g NHS，在室溫下攪拌1h。將所得溶液在水中透析24h以除去小分子，得到A-SP。添加1.5g CMC于上述所得溶液，并在80℃下加熱反應(yīng)24h。冷凍干燥后得到CMCSP（mCMC∶mSP＝1∶2），并以此法制備1∶1和2∶1的CMC-SP。合成機(jī)理如圖1所示。

1.4 CMC-SP@AVM的制備

圖1 CMC-SP的合成

采用自組裝法制備了CMC-SP@AVM。首先加1.0g AVM于100mL無(wú)水乙醇中制備10mg/mL的AVM溶液，然后將0.1g CMC-SP粉末溶解在90mL去離子水中，加2mL AVM溶液，并定容至100mL，最后經(jīng)磁力攪拌30min，得到穩(wěn)定分散的CMCSP@AVM懸浮液。

1.5 結(jié)構(gòu)表征及性能測(cè)試

1.5.1 傅里葉紅外光譜（FTIR）

利用溴化鉀壓片法表征和比較CMC、SP、CMC-SP，掃描波長(zhǎng)為4000～450cm-1，分辨率為2cm-1。

1.5.2 熱重（TGA）

氮?dú)夥諊拢?0mL/min），升溫速率為10℃/min，升溫范圍為30～800℃，分析SP、CMC、CMC-SP的熱穩(wěn)定性。

1.5.3 掃描電鏡（SEM）

將一小滴樣品溶液置于干凈的表面，在室溫下蒸發(fā)溶劑，然后噴金，在加速電壓為15kV下獲得樣品的SEM形貌圖。

1.5.4 載藥性能測(cè)試

取4mL新鮮制備的CMC-SP@AVM懸浮液置于離心管，10000r/min離心10min。取1mL上清液于棕色容量瓶中，并用無(wú)水乙醇定容至25mL。用紫外分光光度計(jì)在245nm下測(cè)吸光度，根據(jù)式(1)計(jì)算阿維菌素的包封率（EE，%）。

式中，mtotalAVM為體系A(chǔ)VM總質(zhì)量，g；mfreeAVM為體系中未包封的阿維菌素質(zhì)量，g。

1.5.5 抗紫外性能實(shí)驗(yàn)

10mL新鮮制備的CMC-SP@AVM懸浮液分散于90mL水溶液中，在距離20cm的紫外光源（16W）的照射下，進(jìn)行抗紫外性能實(shí)驗(yàn)。然后每隔一段時(shí)間取出一部分溶液，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)量吸光度。由式(2)可計(jì)算得殘留率（Rv，%）。

式中，A0為AVM在溶液中的初始濃度，mg/mL；Ai為不同光照時(shí)間后樣品中的AVM濃度，mg/mL。

1.5.6 AVM緩釋實(shí)驗(yàn)

將新鮮制備的CMC-SP@AVM懸浮液（5mL）放入到透析袋中，并置于錐形瓶中，然后在室溫下加入50%的乙醇水溶液（50mL）進(jìn)行透析，往乙醇溶液中加入HCl或NaOH來(lái)控制緩釋溶液的pH。在一定的時(shí)間間隔下，取1mL樣品于紫外分光光度計(jì)測(cè)量樣品溶液的AVM濃度，并及時(shí)加入1mL相應(yīng)的乙醇水溶液至錐形瓶。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線：A=0.03782C-0.04705(R2=0.999)計(jì)算AVM濃度。累積釋放率（Ri，%）按照式(3)計(jì)算。

式中，Ci為每個(gè)樣品在不同時(shí)間間隔時(shí)AVM的濃度，mg/mL；mAVM為錐形瓶中AVM的總質(zhì)量，g。

1.5.7 殺蟲(chóng)活性

將白菜葉子（大小為2cm×2cm）分別浸泡在濃 度 為200mg/L、100mg/L、50mg/L、25mg/L、12.5mg/L、6.25mg/L和3.125mg/L的CMC-SP@AVM溶液里，待其自然干燥后，與10條2齡的小菜蛾一同放入墊有濾紙的培養(yǎng)皿中，于恒溫室中培養(yǎng)48h后觀察其死亡率，刺激時(shí)不能移動(dòng)則視為死亡。用AVM乙醇溶液處理昆蟲(chóng)作為對(duì)照組，并計(jì)算死亡率和校正死亡率。

2 結(jié)果與分析

2.1 傅里葉紅外光譜分析

圖2 CMC、SP和CMC-SP的紅外光譜圖

如圖2所示，CMC曲線中，3500cm-1處出現(xiàn)的寬吸收峰是羥基、分子間和分子內(nèi)氫鍵的伸縮振動(dòng)峰[11]。2920cm-1左右出現(xiàn)—CH2—的伸縮振動(dòng)峰，在1595cm-1處出現(xiàn)—COO不對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，1416cm-1和1323cm-1處出現(xiàn)羧甲基的對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰[12]。在SP曲線中，3294cm-1左右出現(xiàn)的峰是由蛋白質(zhì)鏈和水分之間的氫鍵引起的，1654cm-1和1542cm-1處出現(xiàn)酰胺鍵的吸收峰，在1241cm-1處的吸收帶是由C—N伸縮振動(dòng)和N—H彎曲振動(dòng)引起的，1060cm-1處出現(xiàn)C—H平面外的振動(dòng)峰[13]。在CMC-SP曲線中，酰胺I的吸收峰出現(xiàn)在1645cm-1處，表明APTES的氨基與SP反應(yīng)生成新的酰胺鍵，導(dǎo)致吸收峰發(fā)生了紅移。1710cm-1處出現(xiàn)的吸收峰可能是APTES水解后產(chǎn)生的羥基與SP上的羧基反應(yīng)產(chǎn)生酯基[14]。另外，羧甲基對(duì)稱伸縮振動(dòng)在1416cm-1和1323cm-1處的峰也在CMC-SP中出現(xiàn)。CMC的C—O—C振動(dòng)具有強(qiáng)烈吸收帶，與在1150cm-1和1135cm-1處出現(xiàn)的Si—O—C和Si—O—Si的典型信號(hào)峰重疊[15]。

2.2 熱重分析

圖3(a)是CMC、SP和CMC-SP在40～600℃的TGA曲線。各樣品在100℃左右的質(zhì)量損失是由于樣品中少量殘留水分的蒸發(fā)。CMC在260℃開(kāi)始分解，并且質(zhì)量損失較大，因?yàn)镃MC中的羧基在這個(gè)溫度范圍分解成二氧化碳[16]，最后的質(zhì)量損失率為60%。SP在204～300℃之間開(kāi)始劇烈分解，質(zhì)量損失峰明顯，這是由大豆分離蛋白的主鏈多肽分解引起的[17]。在400～600℃之間的分解曲線趨于平緩，這一階段主要為殘余物質(zhì)的繼續(xù)緩慢分解，最終的總質(zhì)量損失率為83%。CMC-SP最后的質(zhì)量損失率為70%，為了進(jìn)一步了解質(zhì)量損失情況，對(duì)SP、CMC、CMC-SP的導(dǎo)數(shù)熱重（DTG）圖進(jìn)行了研究。如圖3(b)所示，CMC的分解溫度質(zhì)量損失峰為290℃，而SP有兩個(gè)質(zhì)量損失峰分別在241℃和285℃。在此段降解過(guò)程中，分子間和分子內(nèi)氫鍵、靜電作用以及疏水作用被破壞。CMC-SP的質(zhì)量損失峰在248℃和313℃，因?yàn)镃MC與SP反應(yīng)后，分子鏈中的共價(jià)鍵數(shù)量增多，CMC-SP有更好的熱穩(wěn)定性[18]，說(shuō)明CMC成功接枝到SP上。

圖3 CMC、SP和CMC-SP的TGA曲線和DTG曲線

2.3 SEM分析

圖4為CMC-SP、CMC-SP@AVM和加熱后的CMC-SP@AVM的SEM圖。經(jīng)Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)量，CMC-SP的平均尺寸為195nm，呈棱柱或棱錐狀，因?yàn)镾P的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)決定了顆粒的形狀和大小[19]。負(fù)載AVM后，粒子的棱角減少，呈現(xiàn)橢圓或圓形，平均粒徑減小到104nm。CMC-SP的疏水基團(tuán)在疏水作用下形成一個(gè)空腔，當(dāng)AVM進(jìn)入該疏水腔時(shí)，形成了新的疏水平衡，重新形成的疏水腔對(duì)CMC-SP的吸引力更大，因此轉(zhuǎn)變成橢圓形[20]。負(fù)載AVM的粒子加熱后，棱角變得更少，平均粒徑增加到110nm。這是由于SP發(fā)生了蛋白質(zhì)變性，暴露了疏水性基團(tuán)，相鄰粒子間發(fā)生團(tuán)聚[21]，增加了顆粒尺寸。

2.4 粒徑、zeta電位和載藥性能分析

如表1所示，隨著CMC-SP中SP比例的上升，其電荷值由-(15.02±0.93)mV下降到-(22.91±0.04)mV，因?yàn)镾P帶負(fù)電荷。隨CMC-SP電位的下降，對(duì)AVM的靜電排斥力增強(qiáng)使包封率從41.9%降低到33.1%。粒子的平均粒徑變化很大，可能是由于熱變性后的蛋白質(zhì)不規(guī)則聚集所致[22]。測(cè)得的平均粒徑與SEM圖差別較大，這可能是因?yàn)镃MC-SP的親水性質(zhì)導(dǎo)致CMC-SP@AVM在水中膨脹[23]。

圖4 CMC-SP、CMC-SP@AVM和加熱CMC-SP@AVM的掃描電鏡圖及其粒徑分布

表1 不同配比的CMC-SP@AVM的粒徑、電位和包封率

2.5 抗紫外分析

由圖5可知，未包封的AVM在紫外光照射下迅速降解，照射0.5h后殘留率為79.19%。連續(xù)輻射7.5h后，殘留率為43.63%。24h內(nèi)殘留率僅有31.00%，且未封裝的AVM的半衰期只有3.75h。CMC-SP@AVM中AVM的殘留率比未包封的AVM高117%，這是因?yàn)镃MC-SP作為物理屏障阻隔了紫外線的輻射，SP中的芳香氨基酸可以吸收紫外光并使蛋白質(zhì)形成共價(jià)交聯(lián)[24]。此外，CMC中的羧基和羥基作為發(fā)色基團(tuán)會(huì)吸收部分紫外光，從而減弱紫外光的強(qiáng)度。不同配比的CMC-SP的抗紫外效果也不同，其中mCMC∶mSP=2∶1的CMC-SP的抗紫外性能最好。因?yàn)镃MC增加了CMC-SP@AVM的厚度，另外，增加的發(fā)色基團(tuán)減弱了紫外光的強(qiáng)度[5]。

圖5 不同配比的CMC-SP@AVM的抗紫外圖

2.6 緩釋分析

圖6 不同配比下CMC-SP@AVM的緩釋曲線

圖6為CMC-SP@AVM在 不 同CMC和SP質(zhì)量比下的緩釋曲線。在初始階段的14h，大量游離的AVM或在次級(jí)鍵作用下黏附于載體表面的AVM在滲透壓作用下被迅速釋放導(dǎo)致了緩釋初期的快速釋放，可達(dá)到75%以上[25]，說(shuō)明緩釋粒子可在較短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到初期防治所需的較高濃度。而后期內(nèi)外滲透壓降低，且AVM在蛋白疏水片段強(qiáng)吸引力的作用下，釋放速率較為緩慢。在實(shí)際應(yīng)用中，CMC-SP@AVM緩釋顆粒中，大豆分離蛋白可在昆蟲(chóng)腸道或環(huán)境中大量存在的蛋白酶中分解，從而促進(jìn)AVM的快速釋放，起到增效的作用。

累積釋放時(shí)間到達(dá)96h后，CMC-SP@AVM（mCMC∶mSP=2∶1）、CMC-SP@AVM（mCMC∶mSP=1∶1）和CMC-SP@AVM（mCMC∶mSP=1∶2）的累積釋放率分別為68.0%，83.7%和89.2%。CMC-SP@AVM（mCMC∶mSP=1∶2）的粒徑最大，AVM在釋放的過(guò)程中需跨越較長(zhǎng)的距離，故其釋放率最小，而CMC-SP@AVM（mCMC∶mSP=1∶1）與CMCSP@AVM（mCMC∶mSP=2∶1）的粒徑相差不大，但前者的電負(fù)性較大，對(duì)帶負(fù)電的AVM排斥力大，故釋放率偏大。

圖7 不同pH的CMC-SP@AVM的緩釋曲線

圖7是CMC-SP@AVM（mCMC∶mSP=1∶2）在不同pH下的緩釋曲線。最終累積釋放率的變化趨勢(shì)為pH 9＞pH 7＞pH 5＞pH 3，即pH越高，釋放速率越快。當(dāng)累積釋放時(shí)間為40h、pH為3時(shí)的累積釋放率為59.6%，相對(duì)緩慢。大豆分離蛋白的谷氨酸和天冬氨酸含量較高，大豆分離蛋白的等電點(diǎn)在4.5左右[26]。緩釋體系的pH小于等電點(diǎn)時(shí)，氨基質(zhì)子化，CMC-SP@AVM的空間結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，減緩了AVM的釋放速率。當(dāng)pH為5時(shí)的累積釋放速率為62.38%，釋放速率相對(duì)提高。pH為7和9時(shí)的累積釋放速率在140h處都大于68%。因?yàn)楫?dāng)溶液的pH大于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，羧基陰離子群之間的電荷斥力占主導(dǎo)地位，導(dǎo)致靜電相互排斥，進(jìn)一步加速了AVM的釋放[23]。

據(jù)報(bào)道，具有pH響應(yīng)特性的農(nóng)藥緩釋劑在實(shí)際應(yīng)用中可起到比商業(yè)殺蟲(chóng)劑更好的效果[27]。緩釋作用有效延長(zhǎng)了農(nóng)藥的作用周期，pH響應(yīng)賦予了緩釋劑在特定時(shí)間、特定環(huán)境下有效控制害蟲(chóng)的特性。具體而言，根據(jù)pH響應(yīng)特性，CMC-SP@AVM用于防治具有堿性中腸的植食性鱗翅目害蟲(chóng)可起到較好的效果，平臺(tái)期后的緩慢釋放可以防止顆粒內(nèi)的藥物被紫外光分解，并保證顆粒內(nèi)存在足夠多的有效成分，在施藥后一段時(shí)間仍然能達(dá)到殺蟲(chóng)效果[28]。

2.7 緩釋動(dòng)力學(xué)分析

為了進(jìn)一步研究其釋放機(jī)制，選取pH為3、5、7、9時(shí)的曲線進(jìn)行Zero-order[29]、First-order[30]、Elovich[31]等模型擬合。模型擬合圖及擬合結(jié)果分別如表2和圖8所示。由表2可知，緩釋動(dòng)力學(xué)曲線更符合回歸系數(shù)R2相對(duì)較高的Elovich模型。當(dāng)pH為3、5、7、9時(shí)，Elovich模型與Gwak等[32]報(bào)道的一樣，累積釋放系統(tǒng)表現(xiàn)出a0值大、a1值小的現(xiàn)象，說(shuō)明該粒子具有較好的緩釋性能。不同pH下的釋放動(dòng)力學(xué)的差異，與材料在不同氫離子濃度下的內(nèi)部結(jié)構(gòu)有關(guān)。

2.8 殺蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)分析

毒力分析結(jié)果如表3所示，其中AVM和CMC-SP@AVM的毒力回歸方程分別為Y=2.8998+1.1426X和Y=2.6025+1.1895X。盡管回歸方程中的常數(shù)比AVM中的小，但是其斜率大于AVM，說(shuō)明在增加濃度時(shí)，CMC-SP@AVM的毒力效果逐漸接近AVM。此外，AVM的95%置信限為45.12～105.16，這意味著完全超出這個(gè)區(qū)間的概率為5%。CMCSP的包封使CMC-SP@AVM的半數(shù)致死量（103.66mg/L）高于AVM（68.88mg/L）。此外，有95%置信度說(shuō)明兩種毒力效應(yīng)無(wú)顯著差異。因此，CMC-SP@AVM包埋AVM可以改善AVM的各項(xiàng)性能，并對(duì)AVM的毒力作用無(wú)顯著影響[33]。

表2 pH模型擬合參數(shù)

圖8 不同pH下的緩釋擬合模型

表3 毒力測(cè)定計(jì)算結(jié)果

3 結(jié)論

本文合成了具有pH響應(yīng)的載藥顆粒，提高了農(nóng)藥的利用效率。該載藥顆粒通過(guò)對(duì)SP進(jìn)行CMC的接枝改性，并利用疏水作用將AVM包裹。通過(guò)FTIR、DSC及TGA-DTG分析，表明CMC已經(jīng)接枝到SP上。CMC-SP@AVM具有近似于橢圓形的結(jié)構(gòu)，SEM分析顯示粒徑在104～195nm之間。接枝改性后的SP能夠持久有效地包裹AVM，包封率達(dá)41.9%。CMC-SP@AVM在乙醇溶液中溶脹釋放AVM具有pH響應(yīng)性，并符合Elovich模型?？棺贤鈱?shí)驗(yàn)表明，CMC-SP可以顯著提高AVM的抗紫外性能，有效延長(zhǎng)AVM的半衰期。總的來(lái)說(shuō)，CMCSP@AVM可以減緩農(nóng)藥的光降解速率，根據(jù)環(huán)境pH特性相應(yīng)釋放，有望提高農(nóng)藥的有效利用率，降低農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的危害。