韋建辰，徐振彪，賈文飛，魏曉瓊，李金英，王 穎，吳 林

(1吉林農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，吉林 長春 130118；2吉林省藍莓研究中心，吉林 長春 130021；3山東理工大學 生命科學學院，山東 淄博 255049；4淄博普藍農(nóng)業(yè)科技有限公司，山東 淄博 256300)

1 材料與方法

1.1 材 料

剪取越橘品種‘奧尼爾’、‘雷戈西’、‘密斯梯’春季新生半木質(zhì)化嫩莖，以其為外植體經(jīng)過誘導并多次繼代培養(yǎng)的組培苗[17]為試驗材料。組培室培養(yǎng)條件為：溫度(25±1) ℃，光周期16 h光照+8 h黑暗。

1.2 方 法

無菌環(huán)境下，3個越橘品種分別選取長勢相近、健康無污染的同代組培苗,剪切為長度2 cm的莖段[18]，每個莖段至少帶1片葉[19]，接種至NaCl濃度分別為0(CK)，15，30，45，60，75，90，105和120 mmol/L的改良WPM培養(yǎng)基中[20]，每瓶接種12個莖段，3瓶為1個重復，每個處理重復3次。25 d后記錄及測量組培苗的生長狀況及Na+和K+含量。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 越橘組培苗生長指標的測定 每個處理隨機選取15株組培苗，去除培養(yǎng)基后使用電子天平稱其鮮質(zhì)量并取平均值；每個處理選取1株組培苗，水平放置，白熾燈光源下垂直拍照記錄組培苗生長狀態(tài)；使用游標卡尺測量15株組培苗長度不小于0.1 cm的新生芽長度并計算均值；記錄新生芽個數(shù)和已死亡組培苗的株數(shù)，按下式計算芽增殖率及存活率。

芽增殖率=新生芽數(shù)/成活植株數(shù)×100%[21]；

存活率=1-(死亡植株數(shù)/測試植株數(shù))×100%[22]。

1.3.2 越橘組培苗Na+和K+含量的測定 準確稱取烘干并粉碎的各處理組培苗樣品0.5 g，放入馬福爐(550 ℃)中灰化4 h，然后用濃硝酸溶解，用原子吸收光度計測定Na+和K+含量[14]，并計算K+/Na+的比值。

1.4 3個越橘品種的耐鹽性評價方法

1.4.1 單項指標耐鹽系數(shù)[23]的計算 公式如下：

單項指標耐鹽系數(shù)=不同NaCl濃度處理下的平均值÷對照(CK)測定值。

(1)

1.4.2 隸屬函數(shù)值的計算 用隸屬函數(shù)法[24]計算3個越橘品種的隸屬函數(shù)值，若耐鹽指標與耐鹽性正相關(guān)，則計算公式為：

U(xi)=(xi-xi min)/(xi max-xi min),i=1,2,3,…,n；

(2)

若耐鹽指標與耐鹽性負相關(guān)，其計算公式為：

U(xi)=1-(xi-xi min)/(xi max-xi min),i=1,2,3,…,n。

(3)

式中：U為隸屬函數(shù)值，xi為某項指標的測定值，xi min、xi max為所有試材中該指標的最小值和最大值。

1.4.3 耐鹽性權(quán)重系數(shù)的計算 公式如下：

Wi=pi/∑pi,i=1,2,3,…,n。

(4)

式中：Wi表示第i個綜合指標在所有綜合指標中的重要程度，即權(quán)重；pi表示第i個綜合指標的貢獻率。

1.4.4 耐鹽性綜合指數(shù)的計算 公式[25]如下：

D=∑[U(xi)×Wi],i=1,2,3,…,n。

(5)

式中:D代表供試材料耐鹽性綜合指數(shù)。D越大表示其耐鹽性越強，反之則越弱。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2019對試驗數(shù)據(jù)進行錄入整理及圖表制作，使用SPSS 21對數(shù)據(jù)進行主成分分析和數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，平均值間的比較采用單因素方差分析法(One-way ANOVA)，多重比較采用鄧肯氏多重范圍檢驗(Duncan’s multiple range test)，顯著性檢驗水平均設(shè)置為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度NaCl處理對越橘組培苗生長指標的影響

2.1.1 鮮質(zhì)量與存活率 表1顯示，3個越橘品種組培苗的單株鮮質(zhì)量與存活率均隨NaCl濃度的升高而呈降低趨勢，當NaCl濃度大于60 mmol/L時，各越橘品種的鮮質(zhì)量均較CK顯著(P<0.05)降低。其中‘奧尼爾’的鮮質(zhì)量對NaCl最為敏感，當NaCl濃度大于30 mmol/L時，鮮質(zhì)量即較對照明顯降低。NaCl濃度為120 mmol/L時，‘奧尼爾’、‘雷戈西’、‘密斯梯’的鮮質(zhì)量分別較各自CK降低54.7%，51.0%和35.4%，其中‘密斯梯’鮮質(zhì)量降幅最小，但其CK鮮質(zhì)量也明顯低于其他2個品種。

表1 不同濃度NaCl處理對3個越橘品種組培苗鮮質(zhì)量與存活率的影響Table 1 Effects of different NaCl concentrations on fresh mass and survival rate of tissue cultured seedlings of 3 blueberry cultivars

3個越橘品種組培苗的存活率隨著NaCl濃度的增加而持續(xù)下降，當NaCl濃度在15～30 mmol/L 時，3個越橘品種組培苗的存活率均與CK無顯著差異；NaCl濃度大于45 mmol/L時，‘奧尼爾’和‘密斯梯’組培苗的存活率與對照差異顯著(P<0.05)，‘雷戈西’在NaCl濃度大于60 mmol/L時組培苗存活率較CK顯著(P<0.05)降低；‘奧尼爾’、‘雷戈西’、‘密斯梯’的最低存活率均出現(xiàn)在NaCl濃度為120 mmol/L 時，存活率分別較各自CK降低了20%，33%和40%，以‘密斯梯’的存活率降幅最大。

2.1.2 芽增殖率與新生芽長 分析表2得出，越橘組培苗的芽增殖率隨NaCl濃度的升高呈下降趨勢；‘雷戈西’在NaCl濃度為45～90 mmol/L時芽增殖率變化平穩(wěn)，無顯著差異(P>0.05)，在不同NaCl濃度下，其芽增殖率始終高于其他2個越橘品種；‘密斯梯’的芽增殖率較CK下降最多；NaCl濃度為120 mmol/L時，‘奧尼爾’、‘雷戈西’、‘密斯梯’的芽增殖率分別較各自CK降低83.3%，75.1%和96.1%。

表2 不同濃度NaCl處理對3個越橘品種組培苗芽增殖率與新生芽長的影響Table 2 Effects of different NaCl concentrations on bud proliferation rate and new shoots length of tissue cultured seedlings of 3 blueberry cultivars

NaCl處理對越橘新生芽長度影響較大，隨著NaCl濃度的升高，所有越橘品種的新生芽長均呈現(xiàn)下降趨勢，其中對‘密斯梯’影響最大，當NaCl濃度增加至90 mmol/L以上時，該品種越橘組培苗的新生芽長均小于0.1 cm，導致其新生芽長數(shù)據(jù)缺失，說明此時NaCl濃度已經(jīng)超過‘密斯梯’新生芽生長的耐受范圍，生長受到了嚴重抑制。NaCl處理對其他2個越橘品種的影響也十分明顯，當NaCl濃度分別大于30和15 mmol/L時，‘奧尼爾’和‘雷戈西’的新生芽長與CK差異顯著(P<0.05)；NaCl濃度為120 mmol/L時，‘奧尼爾’和‘雷戈西’的新生芽長分別較各自CK降低84.1%和86.7%；不同NaCl濃度下，‘雷戈西’的新生芽長均高于其他2個越橘品種。

2.1.3 生長狀態(tài) 由圖1可知，組培苗莖段的新增高度主要由新生芽長度及其分生位置決定。隨著NaCl濃度升高，‘奧尼爾’和‘雷戈西’植株葉片逐漸由綠變黃，老葉脫落現(xiàn)象逐漸加重，‘密斯梯’植株葉片顏色逐漸由綠色變?yōu)樯詈稚?/p>

圖1 不同濃度NaCl處理對3個越橘品種組培苗生長狀態(tài)的影響Fig.1 Effects of different NaCl concentrations on growth state of tissue cultured seedlings of 3 blueberry cultivars

2.2 不同濃度NaCl處理對越橘組培苗Na+、K+含量及其比值的影響

2.2.1 Na+含量 由圖2可知，隨著NaCl濃度的升高，‘奧尼爾’、‘雷戈西’、‘密斯梯’3個越橘品種組培苗植株中Na+含量均出現(xiàn)不同程度的增加，Na+含量分別在NaCl濃度為30，30，45 mmol/L時較CK出現(xiàn)顯著增加(P<0.05)。NaCl濃度為120 mmol/L時，3種越橘的Na+含量均達到最高值，分別為各自CK的4.1，3.6和4.1倍，其中‘雷戈西’的增幅最小，且各個NaCl濃度下Na+含量均小于‘奧尼爾’和‘密斯梯’。

2.2.2 K+含量 從圖3可以看出，3個越橘品種組培苗植株中K+含量隨NaCl濃度的增加均呈下降趨勢，‘奧尼爾’、‘雷戈西’、‘密斯梯’植株中K+含量分別在NaCl濃度為30，60，30 mmol/L時較各自CK出現(xiàn)顯著下降(P<0.05)。NaCl濃度為60 mmol/L時，3個越橘品種組培苗K+含量分別較CK下降10%，9%和15%；NaCl濃度為120 mmol/L時，K+含量均達到最低值，分別較各自CK下降20%，19%和27%，其中‘密斯梯’組培苗植株中K+含量下降最多。

柱上標不同小寫字母表示同一品種不同處理間差異顯著(P<0.05)，下同Different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05) among treatments for same cultivars.The same below圖2 不同濃度NaCl處理下3個越橘品種組培苗Na+含量的變化Fig.2 Changes of Na+ content in tissue culture seedlings of 3 blueberry cultivars treated with different NaCl concentrations

圖3 不同濃度NaCl處理下3個越橘品種組培苗K+含量的變化Fig.3 Changes of K+ content in tissue culture seedlings of 3 blueberry cultivars treated with different NaCl concentrations

2.2.3 K+/Na+比 由圖4可以看出，3個越橘品種組培苗中K+/Na+比值均隨NaCl濃度的增加而下降，‘奧尼爾’、‘密斯梯’在各濃度NaCl處理下K+/Na+比值均顯著低于各自CK(P<0.05)，‘雷戈西’在NaCl濃度大于30 mmol/L時K+/Na+比值較CK出現(xiàn)顯著下降(P<0.05)。NaCl濃度為120 mmol/L時，‘奧尼爾’、‘雷戈西’、‘密斯梯’的K+/Na+比值分別較各自CK下降了80%，77%和83%。各濃度NaCl處理下，K+/Na+比由高到低均依次為‘雷戈西’、‘奧尼爾’、‘密斯梯’。

圖4 不同濃度NaCl處理下3個越橘品種組培苗K+/Na+比值的變化Fig.4 Changes of K+/Na+ ratio in tissue culture seedlings of 3 blueberry cultivars treated with different NaCl concentrations

2.3 3個越橘品種耐鹽性綜合評價

根據(jù)所測得的各項指標數(shù)據(jù)，使用NaCl處理組和對照組各性狀的平均值，用公式(1)計算出3個越橘品種組培苗各項指標的耐鹽系數(shù)[26](表3)。植物的耐鹽性由不同指標綜合反映，而各單項指標所反映的側(cè)重點不盡相同，所以為了全面評價植物耐鹽性，應該對各單項指標進行綜合分析評價[25]。

表3 不同越橘品種相關(guān)指標的耐鹽系數(shù)Table 3 Salt tolerance coefficient of relative indexes of different blueberry cultivars

對3個越橘品種7個指標的耐鹽系數(shù)進行主成分分析，共得到1個特征值大于1的主成分(表4)。由表4可知，第1主成分貢獻率達到了86.73%，意味著主成分1能夠反映原試驗中7種不同指標的信息量，可初步作為一個新的綜合指標對越橘組培苗的耐鹽性進行評價[23]。

表4 越橘耐鹽指標的主成分分析結(jié)果Table 4 Principal component analysis results of salt resistance index of blueberry

用公式(2)和(3)計算3種越橘各項指標的隸屬函數(shù)值，根據(jù)主成分分析結(jié)果使用公式(4)和(5)計算出3個越橘品種的耐鹽性綜合指數(shù)(D)并進行排名(表5)。由表5可知，‘奧尼爾’、‘雷戈西’、‘密斯梯’的耐鹽性綜合指數(shù)分別為0.46，0.66和0.24，說明試驗中3個越橘品種的耐鹽能力由大至小依次為‘雷戈西’、‘奧尼爾’、‘密斯梯’。

表5 3個越橘品種耐鹽指標隸屬函數(shù)值與耐鹽性綜合排名Table 5 Comprehensive ranking of membership function value and salt tolerance of 3 blueberry cultivars

3 結(jié)論與討論

鹽脅迫對植物形態(tài)發(fā)育方面的影響最為顯著，最直觀且普遍的就是抑制植株組織和器官的生長[27]。鮮質(zhì)量的對比能夠比較直觀地反映各濃度鹽脅迫下植株相應的生長狀態(tài)，生物量也是植物耐鹽性的重要判定指標之一[28]。本試驗中，‘奧尼爾’在NaCl濃度為30 mmol/L時，鮮質(zhì)量即較CK顯著下降，NaCl濃度最高時鮮質(zhì)量較CK降低了54.7%，是3個品種中降幅最大的；NaCl濃度為45～60 mmol/L時，3個越橘品種組培苗的存活率也較CK出現(xiàn)了顯著下降。3個越橘品種的鮮質(zhì)量和存活率隨著NaCl濃度的升高呈下降趨勢，說明NaCl濃度一旦超出越橘的耐受范圍，組培苗的鮮質(zhì)量和存活率就會受到明顯影響，這與前人對越橘的研究結(jié)果一致[13,29]。

擴繁試驗中，芽增殖率是最重要的評價指標之一[30]，新生芽長同樣影響到擴繁質(zhì)量的優(yōu)劣。本試驗中，越橘組培苗的芽增殖率和新生芽長對NaCl十分敏感，均隨著NaCl濃度的增加而降低，當NaCl濃度為120 mmol/L時，3個越橘品種的芽增殖率和新生芽長均較CK大幅下降，其中‘密斯梯’在NaCl濃度為90 mmol/L時新生芽長便不足0.1 cm，說明鹽脅迫會顯著降低越橘組培苗的增殖能力，減緩新生芽的生長速度，不利于越橘的增殖擴繁。

鹽脅迫還可以引起植物體內(nèi)離子分布和水分流動失衡，造成滲透脅迫及離子毒害[31]，從而導致植物生長受阻，甚至死亡[32]。Na+是鹽脅迫下主要的毒害離子，植物通常通過各部位對Na+的合理轉(zhuǎn)運來減少鹽害影響[33-34]。如果植物細胞胞質(zhì)內(nèi)Na+含量過多，會對植物體內(nèi)的酶活性、新陳代謝和光合作用造成負面影響[35-36]。K+在植物細胞內(nèi)的離子平衡中起重要作用，參與植物體內(nèi)50多種酶的激活和蛋白質(zhì)合成，如果植物體內(nèi)Na+過多，會與K+競爭酶的結(jié)合位點，使酶失活，還會引起多種蛋白合成及酶促反應的阻斷[37]。還有研究表明，Na+和K+的水合半徑較為接近，植物對其吸收具有拮抗作用[38]，在鹽脅迫下如果植物細胞中Na+大量積累則會抑制K+的吸收，使植物體內(nèi)K+/Na+比下降，細胞為了維持K+/Na+比平衡，會有一定保留K+的能力[39]，因此K+/Na+比的高低也是衡量植物耐鹽性的重要指標之一[40-41]。本試驗中，與CK相比，隨著NaCl濃度的升高，3個越橘組培苗中Na+含量逐漸增加，K+含量及K+/Na+比值呈不斷下降的趨勢，這與烏鳳章等[10,14]對越橘幼苗進行鹽脅迫得出的結(jié)果相同。其他學者在獼猴桃(Actinidiachinensis)[42]和甘蔗(GlycyrrhizaglabraL.)[32]等植物的鹽脅迫研究中，也得到了同樣的結(jié)果。

結(jié)合生長指標分析，Eerahim[43]研究表明，野生大麥(Hordeumvulgaressp.)的植株存活率與Na+濃度呈負相關(guān)，與葉片K+/Na+比呈正相關(guān)，這與本次試驗結(jié)果一致。本試驗中‘雷戈西’在各處理中Na+含量最低，K+含量隨鹽濃度增加的降幅最小，K+/Na+比高于‘奧尼爾’和‘密斯梯’，‘雷戈西’的鮮質(zhì)量在NaCl濃度為15～75 mmol/L時也均大于其他2個品種，芽增殖率和新生芽長則始終高于另2個品種。

評價植物抗逆性的指標種類較多，且各指標間存在一定的相關(guān)性和重疊性，所以將各指標結(jié)合起來綜合分析植物耐鹽性更為合理[25]。本研究使用主成分分析法將不同NaCl濃度處理下越橘植株的7個生長和生理指標轉(zhuǎn)換成1個綜合指標，結(jié)合隸屬函數(shù)法綜合分析了3個越橘品種的耐鹽性，在一定程度上避免了單一指標難以準確判斷植物耐鹽性強弱的問題[26]。

綜上所述，NaCl脅迫對越橘組培苗的生長和增殖有抑制作用，能顯著降低越橘組培苗的鮮質(zhì)量和存活率，降低芽增殖率并減緩新生芽的生長速度；隨著NaCl濃度的升高，越橘組培苗植株內(nèi)Na+含量逐漸增加，K+含量及K+/Na+比不斷下降；3個越橘品種組培苗的耐鹽能力從強到弱依次為‘雷戈西’、‘奧尼爾’、‘密斯梯’。