楊曉娜 陳自宏 陳宏艷 謝雯穎

（保山學院資源環(huán)境學院，云南 保山 678000）

類黃酮?3′5′? 羥基化酶(F3′5′H)是花色素苷代謝途徑中一個關鍵性酶。F3′5′H催化花色素B環(huán)3端、5端羥基化，是花色呈現(xiàn)藍色及紫羅蘭色的前提條件之一，是合成藍色的花翠素?3?葡萄糖苷的關鍵酶，能使花趨于藍色[1]。某些花卉的藍色色素是通過導入F3′5′H來實現(xiàn)的。所以，F(xiàn)3′5′H被稱為藍色基因[2]。

通過NCBI查詢，F(xiàn)3′5′H的cDNA全長已從多種植物中獲得，大約在1 000 bp?2 000 bp之間。2005年，馬鈴薯(S.tuberosum)F3′5′H的cDNA被克隆，全長1 714 bp，編碼區(qū)1 530 bp，編碼509個氨基酸[3]。2006年，毛果楊（P.trichocarpa）F3′5′HcDNA被克隆，全長1 602 bp，編碼區(qū)1 530 bp，編碼509個氨基酸[4]。2007年，大花三色堇（V.×wittrockiana）花瓣中克隆到F3′5′HcDNA全長為1 781 bp，編碼區(qū)為1 521 bp，編碼506個氨基酸[5]。2008年，錦繡杜鵑（R.×pulchrum）F3′5′H的cDNA被克隆，全長1 871 bp，編碼區(qū)1 551 bp，編碼 516個氨基酸[6]。2010年，從仙客來（C.persi?cum）的花瓣中克隆得到的cDNA全長為1 719 bp，編碼區(qū)為1 527 bp，編碼508個氨基酸[7]。2004年，孟麗和戴思蘭分析了F3′5′H與藍色花的形成，文中提到F3′5′H的結構[8]，但目前對F3′5′H進行系統(tǒng)的生物信息學分析鮮有報道。

本研究運用生物信息學軟件（ProtParam、BLAST、TargetP 1.1 Server、SignalP 3.0 Server、ProtScale、TMHMM、ProtScale、PSORT II Prediction、DNA?MAN、SOPMA、GOR4、Pfam 22.0、CDD）對F3′5′H氨基酸序列的相關信息，如：理化性質、相似性、信號肽、導肽、疏水性/親水性、跨膜結構域、分子系統(tǒng)進化、二級結構、結構域、三級結構特征進行預測，為藍色花卉的分子育種和其他植物F3′5′H的克隆提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料來源

從美國國家生物技術信息中心GenBank中檢索到已注冊、正式發(fā)表、物種來源明確的23種高等植物F3′5′H的cDNA序列及其編碼的氨基酸序列(表1)。

表1 23種高等植物F3′5′H cDNA序列及其編碼的氨基酸序列

1.2 研究方法

1.2.1F3′5H′的基本性質

1.2.1.1F3′5′H基因cDNA及其編碼氨基酸序列的理化性質分析

蛋白質的基本性質包括蛋白質相對分子質量、氨基酸組成、等電點、消光系數(shù)[9]。ProtParam①http://www.expasy.ch/tools/protparam.html在線分析軟件[10]是蛋白質理化學性質的分析工具。將F3′5′H基因的氨基酸序列粘貼到Prot?Param軟件的對話框中，單擊“Compute parameters”按鈕，得到蛋白質性質的相關分析數(shù)據(jù)。

1.2.1.2F3′5′H的同源性分析

DNAman是美國LynnonBiosoft公司開發(fā)的高度集成化的分子生物學應用軟件。用DNAman軟件進行F3′5′H基因核酸和蛋白質序列的同源性分析，包括多重序列對齊、PCR引物設計、限制性酶切分析、蛋白質分析、質粒繪圖等。本研究用此軟件是進行了同源性分析及系統(tǒng)進化樹的構建。

1.2.1.3F3′5′H的疏水性/親水性分析

蛋白質疏水性分析可以為其二級結構預測提供參考，還可以為結構域以及功能域的劃分提供依據(jù)[9]。用ProtScale②http://www.expasy.ch/tools/protscale.html軟件[11]在線分析疏水性/親水性，將氨基酸序列粘貼進文本框內，點擊“Submit”按鈕，得到序列疏水性/親水性分析圖。

1.2.1.4F3′5′H的跨膜結構域及跨膜趨勢預測分析

跨膜區(qū)域是一個非常典型的結構，具有連續(xù)性強，預測容易，準確性高的特點，從圖中很容易區(qū)分胞外和胞內區(qū)域[9]。

用TMHMM①http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM在線分析跨膜結構[12]，將氨基酸序列粘貼進文本框內，點擊“Submit”按鈕，得到序列跨膜結構區(qū)域的圖以及該序列的膜外、膜內結構域以及跨膜結構域的位點。

用ProtScale②http://www.expasy.ch/tools/protscale.html軟件預測跨膜趨勢。選擇Transmembrane tendency，將氨基酸序列粘貼進文本框內，點擊“Submit”按鈕，得到預測圖。

1.2.1.5F3′5′H的結構域分析

蛋白質結構域是其執(zhí)行功能的結構基礎[13]，結構域不完整則不可能實現(xiàn)功能[14]。用英國Sanger中心Pfam 20.0③http://pfam.jouy.inra.fr/、美國NCBI數(shù)據(jù)庫(CDD)④http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi在線工具分析其功能結構域[15]，將氨基酸序列粘貼進文本框內，點擊“Submit”按鈕，得到相應結果。

1.2.1.6F3′5′H的信號肽、導肽分析

信號肽屬于導肽靠近N端的一段氨基酸序列，導肽功能的發(fā)揮需要信號肽的存在[16,17]。在TargetP 1.1 Server⑤http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/[18]在線分析系統(tǒng)中，將氨基酸序列粘貼進文本框內，點擊“Submit”按鈕，得到序列的葉綠體轉運肽、線粒體目標肽及分泌途徑信號肽（Secretory pathway signal peptide）。

用SignalP 3.0 Server⑥http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP在線預測信號肽，有兩種預測模型：隱馬爾可夫模型（HMM）和神經(jīng)網(wǎng)絡算法（NN）[19]。方法同TargetP 1.1 Server在線分析系統(tǒng)。

1.2.1.7F3′5′H亞細胞定位分析

用PSORTII Prediction⑦http://psort.hgc.jp/form2.html軟件[20]，將氨基酸序列粘貼進文本框內，點擊“Submit”按鈕，在線分析亞細胞定位。

1.2.2 F3′5H′蛋白質二級結構預測分析

用SOPMA⑧http://npsa?pbil.ibcp.fr/cgi?bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html和GOR4⑨http://npsa?pbil.ibcp.fr/cgi?bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html軟件[21]，將氨基酸序列粘貼進文本框內，點擊“Submit”按鈕，預測氨基酸序列的二級結構圖及各成分的百分比。

1.2.3F3′5H′核苷酸及氨基酸序列的分子系統(tǒng)進化分析

用DNAman軟件，點擊界面上方序列中的多重比對，選擇分析序列進行序列的比對，得到氨基酸和核苷酸序列在進化上或者遺傳學上的親緣關系。

2 結果與分析

2.1 F3′5H′的基本性質分析

2.1.1F3′5′HcDNA及其編碼氨基酸序列的理化性質

23種高等植物F3′5′H基因的cDNA序列起始密碼子均為ATG，終止密碼子均為TAA、TAG或TGA（表2）；ORF長度、氨基酸殘基數(shù)及分子量均基本一致；氨基酸序列中含量最高的氨基酸均為Leu和Ala。F3′5′HcDNA序列編碼的氨基酸序列的理論等電點、酸性和堿性氨基酸的比例、半衰期、摩爾消光系數(shù)、帶電氨基酸比例均基本一致。蛋白質不穩(wěn)定性指數(shù)表明F3′5′HcDNA序列編碼的氨基酸序列均屬于穩(wěn)定蛋白。

表2 代表性高等植物F3′5′H基因cDNA及氨基酸序列的結構和理化性質

2.1.2F3′5′H的同源性特征

23種植物的F3′5′H氨基酸序列比對表明：在近N?端和C?端的序列區(qū)域保守，可能是重要的功能域，分別有3個保守序列：起始于45位的“PPGP”序列（圖1），是細胞色素P450的基序，連接膜的錨定位點和酶蛋白的球體部分[22]，在不同的物種中是高度保守區(qū)。起始于335位的“AGTDT”序列，被認為是形成氧分子的結合域[23]（圖1），序列號為DQ148458和AB234910在序列比對中與其他植物存在差異，這也許是是物種間的基因差異。有起始于473位的“FGAGRRICAG”（圖1）是C端血紅素的結合區(qū)，在不同的物種中也是高度保守的，血紅素結合區(qū)是CYP酶類必需序列，這段序列受半胱氨酸的調節(jié)，以其為中心，左右各氨基酸圍繞半胱氨酸形成特定結構[24]，其中，有幾種植物在比對種存在差異，這也許是物種親緣關系造成的。

圖1 23種植物F3′5′H的多序列比對

2.1.3F3′5′H的疏水性/親水性特征

用ProtScale在線分析疏水性/親水性，最大值為3.078，最小值為?2.622。在整個肽鏈中親水性氨基酸均勻分布，且數(shù)量多于疏水性氨基酸（圖2）。因此，整個多肽鏈表現(xiàn)為親水性，屬親水性蛋白。對其余的23種植物的F3′5′H氨基酸序列的疏水性于親水性進行分析與預測，其預測結果與矮牽牛相似，可以推測F3′5′H蛋白是親水性的。

圖2 矮牽牛F3′5′H疏水性／親水性預測

2.1.4F3′5′H的跨膜結構域及跨膜趨勢預測特征

用TMHMM在線分析，結果表明F3′5′H整條肽鏈橫跨膜內外，A1?A6和A59?A169位于膜內，A7?A26、A36?A58 和 A170?A189屬跨膜結構域，膜外結構域為A27?A35 和 A190?A506（圖 3）。

圖3 矮牽牛F3′5′H跨膜結構域預測

用ProtScale在線分析跨膜趨勢，預測結果顯示F3′5′H整條肽鏈的跨膜結構的可能性為1.399（圖4）。顯然存在跨膜結構域。對其他23種植物的F3′5′H跨膜結構域及跨膜趨勢預測都得到相似的結果，故所有F3′5′H存在跨膜區(qū)域。

圖4 矮牽牛F3′5′H跨膜趨勢的預測

2.1.5F3′5′H的結構域特征

用Pfam20.0在線預測出矮牽牛F3′5′H只具有一個結構域，即氨基酸序列中374?492區(qū)段，與細胞色素P450功能區(qū)段相匹配，因而此區(qū)段是F3′5′H的功能域。CDD在線預測證實F3′5′H屬細胞色素P450超基因家族。對其他23種植物的F3′5′H均包含上述功能域。

2.1.6F3′5′H的信號肽、導肽特征

用TargetP 1.1 Server在線分析矮牽牛F3′5′H的序列，其含潛在葉綠體轉運肽、線粒體目標肽及分泌途徑信號肽，可靠性分別為0.156，0.055，0.315，預測可靠性為5級，分泌途徑信號肽分值最高。對其余23種植物的F3′5′H進行同樣分析，雖可靠性的數(shù)值不同，但是分析的結果顯示分泌途徑信號肽可靠性最高，故F3′5′H可能含有氨基酸剪切位點。

用SignalP 3.0 Server在線分析進行信號肽預測，隱馬爾可夫模型（HMM）預測表明F3′5′H分泌信號肽的可靠性為0.609，錨定信號肽的可靠性為0.313，剪切位點位于第30或31個氨基酸殘基，可靠性為0.335（圖5A）。神經(jīng)網(wǎng)絡算法（NN）預測表明F3′5′H分泌信號肽包含70個氨基酸，剪切位點可能位于第30或31個氨基酸殘基，可靠性為0.741（圖5B）。因此，矮牽牛F3′5′H可能存在分泌導肽酶切位點，是一種分泌蛋白。該F3′5′H在游離核糖體上合成后分泌到其他細胞器中發(fā)揮功能。對其余23種植物的F3′5′H進行同樣分析，雖數(shù)值有差異，但都得到一致的結果。

圖5 矮牽牛F3′5′H導肽的預測

2.1.7F3′5′H亞細胞定位分析

PSORT II Prediction在線分析得出矮牽牛F3′5′H定位于細胞質可靠性最高，為0.391，其次是線粒體和細胞核，可靠性都為0.174，定位于內質網(wǎng)腔可靠性為0.13，定位于在分泌泡、高爾基體和過氧化物酶體的可靠性均為0.043。通過以上的數(shù)據(jù)分析，并聯(lián)系相關的細胞生物學知識，可以預測得出：矮牽牛F3′5′H在細胞質核糖體上合成前體，然后通過后轉移運輸?shù)骄€粒體內，含導肽的前體蛋白在跨膜運送之前，需要折疊為松散的結構，以利于跨膜運輸。在跨膜轉運時，前體蛋白首先被線粒體表面的受體識別，在位于外膜上的GIP蛋白的參與下，使前體蛋白從外膜的接觸點通過內膜，之后其導肽即被基質中的線粒體導肽水解酶與導肽水解激活酶水解，并同時重新卷曲折疊為成熟的蛋白質[16]。對其余23種植物的F3′5′H進行同樣分析，雖數(shù)值有差異，但23種植物的F3′5′H定位于細胞質的可靠性均最高，其次是線粒體，故F3′5′H在細胞質中游離核糖體中合成后，經(jīng)信號肽引導錨定于內質網(wǎng)膜上，通過膜泡運輸方式分選到高爾基體、溶酶體等細胞器中，也有可能是F3′5′H在細胞質中游離核糖體中合成后，以跨膜運輸方式分選到線粒體中或以門控運輸?shù)姆绞椒诌x到細胞核中。

2.2 F3′5H′蛋白質結構特征

SOPMA（圖6A）和GOR4（圖6B）預測均表明α?螺旋和無規(guī)則卷曲是矮牽牛F3′5′H最多的二級結構元件，分別為50.99%和34.19%，44.86%和39.72%，β延伸分別為9.68%和15.42%，并散布于整個結構，SOPMA預測中β?轉角為5.14%。對其余23種植物的F3′5′H進行同樣分析，發(fā)現(xiàn)這23種植物的F3′5′H的二級結構最多的元件均為α?螺旋和無規(guī)則卷曲，其次為β延伸，故F3′5′H二級結構最多的元件為α?螺旋和無規(guī)則卷曲。

圖6 矮牽牛F3′5′H二級結構預測

2.3 F3′5′H氨基酸序列的分子系統(tǒng)進化特征

對23條已知的F3′5′H氨基酸序列進行物種間的同源性分析，結果顯示（圖7），同科的都聚在一起，親緣關系近的百分數(shù)大，反之則小。

圖7 23種植物F3′5′H進化樹分析

3 結論

23種高等植物F3′5′H的cDNA序列起始密碼子均為ATG，終止密碼子均為TAA、TAG或TGA；ORF長度、理論等電點、酸性和堿性氨基酸的比例、半衰期、摩爾消光系數(shù)、帶電氨基酸、氨基酸殘基數(shù)及分子量均基本一致；氨基酸序列中含量最高的氨基酸均為Leu和Ala。蛋白質不穩(wěn)定性指數(shù)表明F3′5′HcDNA序列編碼的氨基酸序列均屬于穩(wěn)定蛋白。

23種植物的F3′5′H氨基酸序列比對表明：在近N?端和C?端的序列區(qū)域保守，可能是重要的功能域，分別有3個保守序列：起始于45位的“PPGP”序列，起始于335位的“AGTDT”序列，起始于473位的“FGAGRRICAG”。

整個肽鏈中親水性氨基酸均勻分布，表現(xiàn)為親水性，屬親水性蛋白。該肽鏈橫跨膜內外，存在跨膜結構域，且具有一個結構域F3′5′H屬細胞色素P450超基因家族。其含潛在葉綠體轉運肽、線粒體目標肽及分泌途徑信號肽，分泌途徑信號肽分值最高，可能含有氨基酸剪切位點，可能存在分泌導肽酶切位點，是一種分泌蛋白。F3′5′H在細胞質中游離核糖體中合成后，經(jīng)信號肽引導錨定于內質網(wǎng)膜上，通過膜泡運輸方式分選到高爾基體、溶酶體等細胞器中，也有可能是F3′5′H在細胞質中游離核糖體中合成后，以跨膜運輸方式分選到線粒體中或以門控運輸?shù)姆绞椒诌x到細胞核中。F3′5′H二級結構最多的元件為α?螺旋和無規(guī)則卷曲。系統(tǒng)樹分析發(fā)現(xiàn)同科的都聚在一起，親緣關系近的百分數(shù)大，反之則小。